Summary
אנו מציגים הכנה להדמית מניפולציה סידן איתות בהאנדותל כלי הדם מקומי, ללא פגע. צינורות אנדותל מבודדים טריים מעורקי התנגדות עכבר אספקת שרירים שלד לשמור במורפולוגיה vivo ואיתות דינמית בתוך ובין תאי שכנים. ניתן להכין צינורות אנדותל מmicrovessels של רקמות ואיברים אחרים.
Abstract
השליטה על זרימת דם בכלי הדם על ידי ההתנגדות מווסתת את אספקת חמצן וחומרים מזינים במקביל עם ההסרה של חילוף חומרים לפי מוצרים, כפי שהודגמה על ידי פעילות גופנית שרירי שלד. תאי אנדותל (ECs) מרפדים את אינטימה של כל כלי ההתנגדות ולשרת את התפקיד מרכזי בשליטה בקוטר (vasodilation למשל תלוי האנדותל), ובכך, את הגודל וההפצה של זרימת דם לרקמות. הרגולציה של התנגדות כלי דם על ידי ECs הוא התבצע על ידי Ca 2 + איתות תאית, שמובילה לייצור של autacoids diffusible (למשל תחמוצת חנקן ומטבוליטים חומצה הארכידונית) 1-3 וhyperpolarization 4,5 כי לעורר רגיעה תא שריר חלק. לכן הבנה של הדינמיקה של Ca 2 + איתות אנדותל היא צעד מפתח להבנת מנגנונים המסדירים בקרת זרימת דם. בידוד צינורות אנדותל מבטל משתנים מבלבלים קשורים blood בלומן הכלי ועם תאים המקיפים את שריר חלק ועצבי perivascular, אשר אחרת להשפיע על מבנה EC ותפקוד. כאן אנו מציגים את הבידוד של צינורות האנדותל בעורק מעולה ברום הבטן (SEA) באמצעות פרוטוקול מותאם לכלי זה.
כדי לבודד צינורות אנדותל מעכבר הרדים, הים הוא את הגבעול באתר כדי לשמור על דם בתוך לומן הכלי (כדי להקל על לדמיין את זה בזמן נתיחה), ואת כל הגיליון של שרירים בטן הוא נכרת. הים הוא גזור חופשי מסביב סיבי שריר שלד ורקמות חיבור, דם סמוק מהלום, ועיכול אנזימטי מתון מתבצע כדי לאפשר הסרת adventitia, עצבים ותאי שריר חלק באמצעות טחינה דקה עדינה. הכנות טריות מבודדים אלה של האנדותל בשלמות לשמור על המורפולוגיה האם שלהם, עם ECs הבודד שנותר בשילוב פונקציונלי זו לזו, תוכל להעביר כימית וחשמלי signals intercellularly דרך צמתים פער 6,7. בנוסף לאספקת תובנה חדשה ביופיסיקה איתות סיד והקרום, הכנות אלה יאפשרו מחקרים מולקולריים של ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון בתוך האנדותל כלי הדם מקומי.
Introduction
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הבידוד של צינורות תא האנדותל מהים העכבר. הים נובע מהדם בעורק ואספקת בית החזה הפנימי מחומצן לשרירי בטן הקדמי. שלנו עובד עם הים כמודל ניתן לייחסו לזה מתן מגזרים ארוכים יחסית, unbranched דם קטן שמתאים גם ללימוד אירועי איתות אינטר בדבר תפקידה הבסיסי של האנדותל בשלטון ותיאום הרפיה תא שריר חלק. למעוניינים ברקמות אחרות מאשר שרירי שלד, מצאנו בטכניקה זו כדי להתאים בקלות להשגת צינורות אנדותל מmicrovessels של מערכת הלימפה במוח, מעיים ו.
התכונות העיקריות של שיטה זו הן שאורכים שלמים (1-3 מ"מ) של האנדותל כלי הדם מבודדים, מאובטח נגד coverslip זכוכית בתא זרימה שבו הם superfused עם PSS, וצלמת עבור Ca 2 + איתות 7-9 אומשופד ל6,8 איתות החשמלי. בתוך תא הזרימה, חיצו העליון של צינור חשוף לפתרון superfusion ומגיב להתערבויות ניסיוניות, בעוד החצי התחתון (במגע עם coverslip) מוגן ונשאר שקט. בנוסף ללימוד שני 2 אירועי Ca התוך ואינטר + איתות, צינורות האנדותל יכולים לשמש בזמן אמת PCR כמוני להערכת ביטוי גני 6,10, אימונוהיסטוכימיה לחקור ביטוי חלבון 6,10, ומחקרי אלקטרו להגדיר מאפייני biophysical של 6,11 הולכה חשמליות.
ישנם מספר יתרונות להכנת צינור אנדותל ללימוד תפקוד האנדותל. הראשון הוא שתהליך הבידוד מספק הבחנה פשוטה בין שתי אוכלוסיות תאים: תאי האנדותל (שיישארו בהיווצרות צינור) ותאי שריר חלק (ניתקה בנפרד, בדרך כלל "C" בצורה שבירגוע). זה מאפשר לדגימה ומחקר של מאפיינים ייחודיים שבבסיס תרומת תאי בהתאמה לתפקוד כלי סלקטיבית. שנית, מודל זה מאפשר הרזולוציה של איתות אירועים מהותיים לאנדותל, עצמאי מההשפעה של זרימת הדם, המקיף את שריר חלק, עצבים, וparenchyma. שלישית, האנדותל הוא למד תוך מבודד טרי, ובכך להימנע משינויים בגן או ביטוי חלבונים הקשורים בתרבית תאים.
Protocol
1. הכנת הציוד: תזרים הלשכה, טפטפות, ופתרונות
- תא זרימה: השתמש בתא זרימה עם coverslip זכוכית x 50 מ"מ 24 מ"מ בתחתית לsuperfuse צינורות המבודדים אנדותל (ראו איור 1 א). לפני ההרכבה הקאמרית, לשטוף coverslips הזכוכית עם שני 3% HCl ו70% אתנול, לשטוף עם מים ultrapure, ויבש עם גז חנקן.
- טפטפות: שלושה סוגים שונים של טפטפות משמשות במהלך הפרוטוקול: cannulation, טחינה דקה, ומצמיד. שני cannulation וטפטפות תולה יכולים להתבצע לפני יום הניסוי, אך טפטפת טחינה דקה צריכים להיעשות ביום כפי שהוא דורש ידע בקוטר של כלי לגודל לומן כראוי.
- טפטפות cannulation: על מנת לשטוף את תאי דם אדומים מהלום, למשוך צינורות זכוכית נימי ורוסיליקט באמצעות חולץ micropipette יש קצוות ארוכים, מחודדים. לשבור את הקצוות עם מלקחיים לקוטר חיצוני ~ 30% less מזה של העורקים (~ 50-80 מיקרומטר), ופולני אש הקצה להיות חלק (ראה איור 1). זה מועיל לזווית גם הטיפים של טפטפות ל45 כ °.
- טפטפות טחינה דקה: כדי לנתק באופן מכאני את תאי שריר החלק וadventitia מצינורות אנדותל, להפוך טפטפות triturating מצינורות זכוכית נימי ורוסיליקט. הכן את צינורות נימים כאמור לעיל, ולשבור את הקצה עם מלקחיים. טיפ: השתמש במכשיר ניקוד זכוכית כדי שיהיה קל יותר לשבור את הקיר העבה של זכוכית פיפטה טחינה דקה בצורה נקיה. לשבור את פיפטה לקוטר הפנימי שנקבע ביום של הניסוי, כ 10-20 מיקרומטר הגדול יותר מזה של הקוטר החיצוני של כלי השיט שממנו הצינורות אנדותל יהיו מבודדים. פולני אש הקצוות שבורים עד שהתערובת חלקה (ראה תרשים 1C).
- מצמיד טפטפות: כדי לייצב את צינור אנדותל בתוך תא הזרימה, להפוך מצמיד טפטפות כדי לאבטח את t אנדותלאופה נגד תחתית coverslip של החדר. משוך צינורות זכוכית נימים באופן זהה טפטפות cannulation. ואז לשבור את הקצוות עם מלקחיים לקוטר של ~ 100 מיקרומטר, ופולני אש עד שהקצוות נסגרים, מעוגל וחלק (ראה איור 1D). הערה: אם הקצה של פיפטה מצמיד אינו אטום לחלוטין, נוזל ייכנס ללום ועלולה לבלבל את תוצאות ניסוי.
- פתרונות: הכן את כל הפתרונות בultrapure (18.2 MΩ) H 2 O ולעקר אותם דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. ודא osmolality של הפתרונות הוא בין 285-300 mOsm. פתרונות יישארו טובים במשך כשבועיים, כאשר הם מאוחסנים ב 4 ° C.
- פתרון לנתיחה: תמיסת מלח בשימוש במהלך הניתוח של העורק ברום הבטן מעולה מורכבת (במילימול / ליטר): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic חומצה ( HEPES), 10 גלוקוז, נתרן ניתרופרוסיד 0.01 (SNP),ד 0.1% אלבומין בסרום שור (BSA) עם pH של 7.4. SNP תורם NO כלול כדי לעזור להירגע תאי שריר חלק, ובכך הופך אותם קלה יותר לcannulate העורק וכדי להקל על ההסרה של תאי שריר חלק בטחינה דקה.
- פתרון דיסוציאציה: תמיסת מלח משמשת במהלך הניתוק של צינור אנדותל מורכב (במילימול / ליטר): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 גלוקוז, 2 CaCl 2, וארגון ה-BSA 0.1%, עם ה-pH של 7.4. לaliquot 1 מיליליטר של החיץ הזה, להוסיף: פפאין 0.62 מ"ג / מיליליטר, 1.5 מ"ג / מיליליטר collagenase ו1.0 מ"ג / מיליליטר dithioerythritol. מאז אנזימים מהספקים שונים יכולים להיות ברמות שונות של פעילות האנזימטית, מספרי המוצר של אלה המשמשים לעבודה זו כלולים לעיון בטבלה של חומרים. הערה: במהלך הפרוטוקול שני דיסוציאציה חיץ וחיץ ניתוק עם אנזימים המשמשים בשלבים שונים.
- פתרון superfusion: הפתרון הפיזיולוגי מלח (PSS) המשמש לsuperfusing צינור אנדותל המבודד מורכב (במילימול / ליטר): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 גלוקוז ו2 CaCl 2, עם pH של 7.4.
- הכן את המאגרים ופתרונות לפני תחילת הליכים כירורגיים. הסר את הפתרונות מ4 ° C ו aliquot 50 מיליליטר של חיץ Dissection לתוך בקבוק 200 מיליליטר Erlenmeyer ולמקם אותו על קרח. בנוסף, aliquot 50 מיליליטר של דיסוציאציה חיץ ללא אנזימים ולמקם אותו על גבי הספסל כדי לאזן לטמפרטורת חדר. הסר את פתרון superfusion מ4 ° C ולאפשר לו לאזן לטמפרטורת חדר על גבי הספסל.
2. הכנת בעלי החיים
לוודא שכל הנהלים והפרוטוקולים מעורבים בעלי חיים הם בקנה אחד עם המכון הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. הנהלים שתוארו כאן אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטהמיזורי.
- השתמש בזכר או נקבות עכברים לפחות 9 שבועות וללמוד כל אחד בנפרד. הרדימי עכבר עם נתרן pentobarbital (60 מ"ג / קילוגרם) באמצעות intraperitoneal הזרקה (IP). טיפ: דילול pentobarbital ל10 מ"ג / מיליליטר בתמיסת מלח סטרילית לפני ההזרקה מקטינה את האפשרות של מנת יתר.
- הרדמה פשרות ויסות טמפרטורה, כדי לשמור על העכבר לחמם מייד לאחר הזריקה הראשונה של pentobarbital. שימוש במנשא מתכת (סל אלומיניום מאוורר) על גבי צלחת חימום (מכוילת ל~ 37 מעלות צלזיוס) עובד היטב כדי לשמור על הטמפרטורה של העכבר יציב. לחלופין, השתמש במנורת חום, מטפלת כדי למקם אותו במרחק מתאים מהעכבר. לפקח על העכבר בכל דקות 5-10 עד הרמה המתאימה של הרדמה מושגת (חוסר הנסיגה לבוהן או קמצוץ זנב). מינון משלים עשוי להידרש לאחר 15-20 דקות. עדיף להתקדם לאט ובזהירות, כדי למנוע מינון יתר, במיוחד עם השמנת יתר, גיל, או בעלי חייםs הדגיש אחרת.
- להסיר את השיער מהצד הגחון על ידי גילוחו בזהירות עם קוצץ שיער חיות מחמד קטן. יש לנקוט בתשומת לב מיוחדת, כדי למנוע טראומה לבעלי החיים. זה מועיל כדי להסיר את כל השיער מאזור המשתרע בתי השחי לאזור הערווה. הסר את כל שיער באופן רופף דבקות עם ספוגית אלכוהול טרי.
- מקם את העכבר על גבה, שוכב עם שני קדמיים והאחוריים גפיים פרושים לחשוף כמה שיותר את דופן הבטן ככל האפשר. במידת צורך, להשתמש בקלטת מעבדה כדי לאבטח את הרגליים באופן התפשטות נשר.
3. בידוד של עורקי Superior ברום הבטן
- לעשות חתך קטן דרך העור בדיוק מעל האזור של אזור הערווה. להבטיח שרק העור נחתך תוך הימנעות נזק לשרירי הבטן הבסיסיים; להאריך את החתך רוחבי בכל כיוון אל hindlimbs בהתאמה. המשך את החתך rostrally לאורך קו האמצע הגחון לחלק העליון של כלוב הצלעות וn להאריך את החתך רוחבי בכל כיוון לforelimbs בהתאמה.
- רם בעדינות את העור ולהשתמש במספריים כדי לנתק את רקמות חיבור המחזיקות את העור לשריר הבסיסי, ובכך לחשוף את כל פני השטח של שרירי הבטן (ראו איור 3 א). להשקות את השריר החשוף עם תמיסת מלח 0.9% טמפרטורת חדר.
- בשל גודלו הקטן של הים, מקם את החיה מתחת סטראו להליכים נוספים. הרם את כרית השומן ממוקמת בחלק התחתון של עצם החזה עם מלקחיים, ועושה חתך דרכו. המשך החתך לאורך הצלעות התחתונה, כדי לוודא שלא לחתוך עמוק מדי לתוך הרקמה הבסיסית. הים צריך להיות גלוי; לטפל כדי למנוע פגיעה בו. לאחר החתך הוא מלא, להשקות את הרקמה חשופה עם תמיסת מלח 0.9% טמפרטורת חדר.
- לאחר השכבה העליונה של שריר שלד כבר חזר בו, בים ובשרירים שבבסיסם מזוהים בקלות. טיפ: שים לב לאורכו שלSEA in vivo לפני שהבודד להאריך צינורות אנדותל (אשר לקצר לאורך הציר שלהם על בידוד) משוער האורך המקורי שלהם. בעזרת מלקחיים ומספריים, בלו, בזהירות שכבת השריר דקה מתחת לים.
- בעזרת מלקחיים זוויתי, עובר באורך של 6-0 תפר משי מתחת לים ולקשור את העורק ווריד הסמוכים לה כדי לשמור עליה בלחץ דם ונשמר בתוך לומן הכלי כדי להקל על הדמיה בבידוד וניקוי שלאחר מכן.
- חזור על תהליך קשירת SEA בצד הנגדי.
- לאחר שני הימים כבר את הגבעול, עושה חתך לאורך קו האמצע של שרירי בטן על מנת להפריד בין צדדים, בהתאמה.
- להאריך את החתך רוחבי בכל כיוון כפי שנעשה לעור, ולאחר מכן להמשיך את החתך אנכי לאורך הקצה החיצוני כדי להפריד לחלוטין את שריר הבטן מהגוף. למנוע נזק לכלי הדם ניזון הים כדי לשמור על לומן בלחץ.
- Cut הים מעל לקשירה כדי לשמור על החותם, ולמקם את השריר ועורק הבודדים בכוס 50 מיליליטר מכילה 10 מיליליטר של 4 ° C חיץ לנתיחה.
- חזור על התהליך עבור הצד של הבטן האחר ודגירת הרקמות בחיץ לנתיחה עבור 10 דקות.
- הנח את השרירים בטן המכילים את הים בחיץ נתיחה מצונן (4 מעלות צלזיוס) חדר נתיחה המכיל (ראה איור 3 ב). חדר הנתיחה מורכב מצלחת פטרי עם שכבה של Sylgard (polydimethylsiloxane [PDMS]) בתחתית.
- באמצעות סיכות חרקים (0.15 מ"מ), למתוח את הים המבודד ושרירי בטן משוער in vivo אורכים (שצוין לעיל) ולאבטח אותו לSylgard. טיפ: המכוון לשריר כך שהשכבה דקה מול הצפק היא על גבי הופך את הים לעין בקלות באמצעות שקוף.
- תוך שימוש בכלי microdissection בסדר ועובד מהאתר במעלה הזרם של קשירה כלפיסוף במורד הזרם, לנקות את הים מהווריד לזווגה והרקמה הסובבת עד האתר הגדול הראשון של הסניף (1-2 סנטימטר). ואז תחתוך את הים על ידי חיתוך זה פשוט מעל אתר הסניף וממש מתחת לקשירה.
- כדי להסיר דם נשמרים בתוך לומן הכלי, cannulate הים ולשטוף אותו עם חיץ לנתיחה קרה כקרח. באמצעות פיסת צינורות silastic, לצרף את הקצה האחורי של פיפטה cannulation למזרק 5 מיליליטר המכיל חיץ לנתיחה קר כקרח ולאבטח את micropipette בmicromanipulator למצב את קצהו בתוך חדר הנתיחה כדי cannulate הים.
- ברגע שכל אריתרוציטים הם סמוקים החוצה, להסיר את הים מפיפטה cannulation, והרם את פיפטה מהצלחת לנתיחה.
- חותכים את הים למקטעים קטנים יותר כל מ"מ 1-3 באורך. קטעים קצרים אלה להקל על הבידוד של צינורות אנדותל.
4. בידוד של צינור האנדותל
- מלא כת זכוכית x 75 מ"מ 12באמצע הדרך צינור יור עם חיץ לנתיחה קר כקרח. בעזרת מלקחיים זוויתי, להעביר את חלקי עורקים לתוך צינור התרבות ומניח על קרח. בשלב זה, לשלב את אנזימי עיכול עם חיץ דיסוציאציה לנפח סופי של 1 מיליליטר בצינור תרבות 12 מ"מ x 75 מ"מ נפרד (ראה 1.3.2 פתרונות) ומחמם את הפתרון ל37 ° C עם בלוק חימום.
- בעוד חיץ הניתוק והאנזימים מתחממים, לשאוב בזהירות את חיץ הנתיחה מצינור התרבות משאיר נפח קטן המכיל את קטעי כלי השיט.
- בעדינות להוסיף חיץ ניתוק טמפרטורת חדר ללא אנזימים כדי לשטוף חיץ נתיחה שנותר. טיפ: הוסף את חיץ הניתוק כזה לאט שחתיכות עורקים יישארו בחלק התחתון של צינור התרבות כדי לחסוך זמן מחכה להם להתיישב מחדש. להעלות את טמפרטורות החיץ לאורך שלבים מרובים מקרח (4 מעלות צלזיוס), לטמפרטורת חדר (~ 24 מעלות צלזיוס), ל37 ° C כדי למזער את ההלם.
- לשאוב dissoc זהירותiation חיץ מצינור התרבות, שוב להיות בטוח להשאיר את נפח קטן המכיל את קטעי כלי השיט.
- הסר את חיץ ניתוק החימום המוקדם עם אנזימים מבלוק החימום, להעביר 1 מיליליטר של תמיסת אנזים לצינור התרבות המכיל מקטעי הכלי, והנח את צינור התרבות אחורה בבלוק החימום. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- במהלך הדגירה עם אנזימים, להכין את פיפטה טחינה דקה, לגבות אותו עם שמן מינרלים ולאבטח אותו על microsyringe כי הוא רכוב בmicromanipulator. ואז לחזור על בוכנת microsyringe למלא את פיפטה עם 2 NL של חיץ ניתוק ולמקם את קצה פיפטה מעל תא הזרימה.
- בסוף הדגירה 30 דקות, להסיר את צינור התרבות מבלוק החימום ובזהירות לשאוב את החיץ כאמור לעיל.
- שטוף את מקטעי עורקים עם 4 מיליליטר של חיץ ניתוק טמפרטורת חדר. שים לב: זה כבר לא נחוץ כדי לשמור על segm הכליהמציג בחלק התחתון של צינור התרבות; מפריע חתיכות עורקים ממש עוזר להבטיח כי אנזימי השייר הוסרו באופן יעיל.
- העברת קטע כלי אחד לתא הזרימה בעדינות על ידי נשיפתו עם micropipette 1 מיליליטר, ולמקם אותו לתוך תא הזרימה עם 1 מיליליטר של חיץ דיסוציאציה.
- ניצול micromanipulator מכיל microsyringe, מקם את קצה פיפטה טחינה דקה ליד קצה אחד של מגזר כלי השיט.
- לשאוב מגזר הכלי (500 NL נסוג) לתוך פיפטה triturating לאט (225 NL / sec), כדי שלא לגרום למתח מכאני לECS, ולאחר מכן להוציא אותו בחזרה לתוך החדר. אם העיכול היה מוצלח, תאי שריר החלק וadventitia יהיו מנותקים מצינור אנדותל.
- חזור על טחינה דקה עד שכל תאי שריר החלק הם ניתקו. להיות מודע לכך שטחינה דקה מוגזמת (4x או יותר) עלולה לגרום נזק לECS ו לדקלם אותם מגיבים לאגוניסטים. טיפ:באמצעות פיפטה טחינה דקה, הזז את adventitia מן הצינור אנדותל בהקדם האפשרי כדי למנוע ממנו לסבך את הצינור. הערה: שימוש בפיפטה טחינה דקה, צינור אנדותל המבודד יכול להישאף והועבר לחדר נפרד.
- מקם את צינור אנדותל במרכז תא הזרימה, מיושר לאורך כיוון הזרימה, ולהסיר את פיפטה triturating.
- טפטפות מצמיד מאובטחת בmicromanipulators רכוב בכל צד של תא הזרימה, ולמקם את הטיפים שלהם בקצוות בהתאמה של צינור אנדותל.
- מנמיכים פיפטה תולה על קצה אחד של השפופרת ללחוץ עליו מפני החלק התחתון של החדר. מקם את פיפטה המצמיד השנייה באותה הדרך בקצה השני של הצינור. הערה: מיקום של טפטפות הנעיצה הוא trade-off בין אבטחת הצינור (למקם אותם רחוק יותר מהקצה של הצינור) ומאפשר ליותר הדמיה / אזור ניסוי (למקם אותם יותר קרוב לקצה של הצינור). איתור tשולי ~ 50 מיקרומטר מכל קצה של הצינור עובד היטב. בדיוק כמו פיפטה מצמיד נוגעת בצינור, לחזור בו לאיטו לאורך הציר של הצינור, ובכך להאריך אותו כדי להתקרב in vivo אורך; לאחר מכן לחץ על פיפטה אל תחתית החדר כדי להבטיח את הצינור.
- תתחיל הזרימה של פתרון superfusion, ולאפשר את צינור אנדותל לנוח לפחות 20 דקות כדי לאזן ולדבוק (ראה איור 3 ג). לנצל משאבת peristaltic כדי לשמור על זרימה מתמדת נוזל (superfusion) על פני צינור אנדותל. הערה: טפטפות הצמדה ניתן להסיר ברגע שצינור אנדותל דבק בחלק התחתון של תא הזרימה (~ 25 דקות) או נשאר במקומו, כדי להבטיח את צינור אנדותל אינו הופך שנעקר.
5. טעינת צבע וסידן הדמיה
- כדי להמחיש את תגובות סידן תוך תאי, טען את צינור אנדותל עם fluo-4 צבע AM בטמפרטורת חדר (~ 24 מעלות צלזיוס). לעצור את זרימת נוזל באמבטיה, ולהוסיף fluo-4בבוקר לתא בריכוז סופי של 10 מיקרומטר. המתן 10 דקות כדי לאפשר לצבע לחדור לתאים, ולאחר מכן superfuse צינור אנדותל עם PSS הטרי עבור 20 דקות כדי להבטיח צבע תאי מוסר ושהצבע תאיים כבר מלא דה esterified.
- לבצע הדמיה סידן. לעבודה זו, מיקרוסקופ זקוף (ראה תרשים 2) מצויד במערכת הדמיה confocal דיסק מסתובב שימש בטמפרטורת חדר הסביבה. Excite צבע סיד הניאון עם לייזר 491 ננומטר ולרכוש תמונות (ב500-550 פליטת ננומטר) באמצעות מצלמה דיגיטלית התעצמה.
Representative Results
יכולות להיות יזם תגובות סידן בצינורות מבודדים טרי אנדותל באמצעות אצטילכולין (ACH). בסרט הזה, צינור אנדותל עמוס 10 מיקרומטר fluo-4 AM האם מגורה עם superfusion של מיקרומטר ACH 1 (סרט 1). לחץ כאן לצפייה בסרט. הצבע הוא נרגש ב491 ננומטר ופליטה נרשמת 500-550 ננומטר באמצעות מצלמת מכשיר תשלום מצמידים התעצמה. ערימות תמונה נרכשות ב120 פריימים / השני לתקופה שניות 25 ואז יכולות להיות בממוצע (למשל ל40 מסגרות / sec). תמונות הקרינה נציג לאורך הזמן מוצגות באיור 4.
איור 1. תא הזרימה וטפטפות שימוש במהלך הבידוד של צינורות אנדותל. ng>) דוגמאות תא הזרימה מורכבת עם coverslip זכוכית x 50 מ"מ 24 מ"מ כבסיס. ב) (מימין) פיפטה משך (משמאל) ומשך, שבורה, מלוטשת וזווית cannulation. פיפטה זה משמשת כדי לשטוף אריתרוציטים מלומן של העורק לאחר נתיחה. דוגמאות בקנה מידה בר = 200 מיקרומטר. ג) (מימין) פיפטה משך (משמאל) ומשך, שבורה ומלוטשת טחינה דקה. הקוטר הפנימי של פיפטה זה נקבע על ידי הקוטר החיצוני של העורק. דוגמאות בר סולם = 200 מיקרומטר. ד) פיפטה משכה, שבורה ומלוטשת (משך (משמאל) וימין) מצמיד. קצה פיפטה זה מעוגל ואטום לגמרי כדי לאבטח את צינור אנדותל בתא הזרימה. בר = 200 מיקרומטר קנה המידה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
class = "jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 2. ספינינג מיקרוסקופ confocal דיסק להדמיה של Ca 2 + אותות.) מיקרוסקופ הזקוף המשמש להדמית סידן. (א) יחידת דיסק ספינינג confocal עם מטרות טבילה (ב) התעצמה מצלמה מכשיר תשלום מצמידים. ג) (א) 63X (ב ') NA = 1) ו (ב) 20X (NA = 0.5) המשמש להדמיה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. בידוד של השרירים הבטן ועורק ברום הבטן מעולה. rong>) מורדם עכבר עם שרירי בטן חשופה ושלחין עם תמיסת מלח 0.9% טמפרטורת חדר. חיצים אדומים מסמנים את האתרים תחת רפידות שומן שבימי בהתאמה להיכנס כל שריר rectus abdominis (כלומר היכן יש מקשרים את כלי דם). בקנה מידה בר = 1 סנטימטר. B) שרירים בטן מבודדים (חד צדדי) וSEA תלו בחדר נתיחה לmicrodissection. חץ אדום מציין את האתר הגדול הראשון של הסתעפות של הים (כלומר, הנקודה שבה ניקוי של הכלי הופסק). בקנה מידה בר = 1 סנטימטר. C) צינור מבודד אנדותל תא מים. תמונת ההפרש התערבות ניגודיות של צינור אנדותל הבא דגירה 1 שעות בטמפרטורת חדר. צינור אנדותל היה superfused עם חיץ superfusion ב3 מיליליטר / דקה. בר = 50 מיקרומטר קנה המידה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
ether.within-page = "תמיד"> 
איור 4. הקרינה סידן בצינור תא האנדותל. תמונות ניאון נציג של צינור אנדותל בתגובה לגירוי עם אצטילכולין 1 מיקרומטר.) פלואורסצנטי לפני גירוי. ב ') הקרינה צינור אנדותל בזמן ממשל אצטילכולין, t = 0 שניות. C) הקרינה צינור אנדותל ב t = 5 שניות. ד) הקרינה צינור אנדותל ב t = הקרינה 10 שניות. E) אנדותל צינור ב t = 15 שניות הקרינה צינור אנדותל. F) בזמן t = 20 שניות. ברים סולם = 40 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Discussion
כאן אנו מתארים את הבידוד של צינורות אנדותל מהים והשימוש בתכשיר זה כדי להמחיש Ca 2 + אירועי איתות בתוך ECs המכונן שלה. הליך זה הותאם מאחד שפותח במקור לבודד צינורות אנדותל מarterioles של שריר Cremaster האוגר 8. ניצול שינויים קלים של הטכניקות שהוצגו כאן, יש לנו לבודד צינורות אנדותל ממגוון רחב של מיטות וכלי דם, כוללים: עורקי הזנה של שריר מפשק אוגר והלחי arterioles כיס 10, עורק ברום הבטן מעולה עכבר 6,7,9, mesenteric עכבר ומוחות עורקים וmicrovessels הלימפה (תצפיות לא פורסמו; אזכור כלולים לבידוד כלי mesenteric 12 וכלי מוחין 13). בידוד צינורות אנדותל מהמיטות כלי דם חדשים עשוי לדרוש שינויים בפרוטוקול המקורי. אם הבידוד הוא לא מוצלח, עדיף להתחיל על ידי שינוי פעמים עיכול:להגדיל את זמן העיכול אם צינורות אנדותל קשים לבודד מתאי שריר חלק וadventitia ולהפחית את זמן עיכול אם צינור אנדותל לא נותר על כנן. אם שינוי זמני עיכול הוא לא מוצלח, התאמת הריכוז של אנזימי עיכול או טמפרטורת העיכול צריכה להישפט. אפשרות נוספת היא להקטין את הקוטר הפנימי של פיפטה טחינה דקה, אשר מגדילה את כוח גזירה בהסרת תאי שריר חלק. הגדלת המהירות של פליטת נוזל יכול להיות גם ניסיתי במשך אותו האפקט, אבל יש יותר סיכוי לפגוע בהכנה. יש להכיר בכך שזה לא יכול להיות אפשרי לבודד צינורות אנדותל ללא פגע מכלי שבו תאי האנדותל אינם מחוברים היטב זה לזה על ידי חלבוני junctional.
דיסוציאציה של תאי שריר חלק הבאים עיכול אנזימטי בתחילה בוצעה באמצעות pipettor בסגנון יד 8. יש לנו מעודן הליך טחינה דקה באמצעות microsyrמערכת אינגה, שאפשרה בידוד עקבי של צינורות אנדותל ארוכים יותר (עד 3 מ"מ) 6. בעת שימוש במערכת זו, פיפטה טחינה דקה היא backfilled עם שמן מינרלים כדי לספק עמודת נוזל רציפה בין הבוכנה שליטה בתנועה וPSS המכיל את קטע כלי נוזל. Incompressibility של נוזל יחד עם כוח המניע המתמיד של תוצאות הבוכנה microsyringe בגזירה קבועה כמו הספינה נאלץ באמצעות קצה פיפטה. לעומת זאת, טכניקות ידיים המשמשות לעתים קרובות לתאים מתנערים (למשל לסחוט נורת גומי בסוף פיפטה פסטר) כרוכה בדחיסה של אוויר, אשר מציגה השתנות בלחץ הנהיגה, ובכך גזירה המופעל בקצה פיפטה.
ישנם יתרונות רבים להכנת הצינור ללימוד תפקוד האנדותל בmicrovessels. הראשון הוא שתהליך הבידוד מספק אוכלוסיות מובחנות הומוגנית ילידים סלולריות של ECS ו mu החלקתאי scle. מאז ECs יישאר מחובר פיזי כמו צינורות, הם נבדלים מהתאים בודדים שרירים חלקים, אשר שומרים על תצורת "C" אם הם נשארים רגועים במהלך טחינה דקה. סוגים כך בהתאמה תא בקלות נבדלים, למשל, כאשר קבלת דגימות לשיטות מולקולריות כגון PCR בזמן אמת ואימונוהיסטוכימיה 10. מאז צינורות מרובים מבודדים מכלי אחד (או מכלי דו צדדיים כפי שנעשה לים), ניתן לקבל נתונים מולקולריים ונתונים תפקודיים מאותו כלי של בעלי חיים מסוימים. ביטוי כך מולקולרי יכול להיות מתואם עם ההתנהגות הפונקציונלית של האנדותל כלי הדם. יתר על כן, ניתן לפתור אירועי איתות שני פנים ובין תאית מהותיים להאנדותל כלי הדם עצמאיים מהשפעתם של כוחות המודינמית (לחץ, זרימה), סוכני vasoactive נשאו בזרם הדם (למשל הורמונים), או מתאי שריר חלק שמסביב (לדוגמא60; באמצעות צימוד myoendothelial 14-16), עצבי 17, או parenchyma הרקמה 18.
חשוב לציין, שכן האנדותל מבודד טרי מmicrovessels המיועד, אין שינוי של פנוטיפ שקשור בדרך אחרת עם culturing ECs 19-21. לדוגמא, ECS תרבית מאבד ביטוי הקולטן מוסקריניים ובכך לשנות את פרופילי סידן האיתות שלהם. יתר על כן, מאפייני אלקטרו של ECs יכולים לשנות בתרבות 22. בגלל ECs הבודד להישאר יחד בערוצי צומת פער פונקציונליים, צינור אנדותל מציג מודל אידיאלי לחקר ההולכה של 2 + אותות חשמליים בין התאים וCa 6,7. צריכים גם להכיר בכך שתאי שריר חלק ניתקו נלמדים בקלות עם טכניקות תיקון מהדק לנתונים משלימים שבסיס תפקוד כלי הדם 23.
מגבלה העיקרית למ 'צינור אנדותלאודל הוא חוסר היציבות של התכשיר עם הגדלת טמפרטורה. בעוד ההכנות שלנו מהים הוכיחו יציבה ובריאים בטמפרטורת הסביבה חדר (~ 24 ° C) ובמשך כמה שעות ב32 ° C, השפלה מורפולוגיים ופונקציונלית מתרחשת בפחות משעה על 37 ° C 9. הגבלה חשובה שנייה של צינור אנדותל היא האובדן של צמתים myoendothelial ותחומים האיתות הטבועות בם, כי הם חלק בלתי נפרד מתפקוד EC בדפנות כלי הדם בשלמותה 14-16. צריך גם להכיר בכך שבעוד שצינורות ארוכים יותר יאפשר איתות אינטר להיחקר על פני מרחקים גדולים יחסית 6, הכנת הצינורות מסובכת כפי שהם מקבלים יותר, כי זה הופך להיות קשה יותר כדי לנתק באופן מלא המקיף את תאי שריר חלק וadventitia. מצאנו כי צינורות ארוכים יותר מ1-2 מ"מ גם קשים יותר למצב ובטוח בתא הזרימה. בניגוד לכך, בעוד שצינורות קצרים יותר (לדוגמא: <1 מ"מ) ENACa 2 + וחשמל אותות ble להיחקר 8, הם קשה לשמור במהלך superfusion בתא הזרימה. לבסוף, גם עם בידוד אופטימלי של צינורות בילטרלי, יש חומר מספיק לכימות מסורתי של ביטוי חלבון באמצעות כתמים מערביים, אם כי immunolabeling מספק מדד של ביטוי חלבון ולוקליזציה. למרות מגבלות אלה, צינור אנדותל מייצג הכנה חדשנית למתן תובנה חדשה מנגנונים של תפקוד תא אנדותל כלי הדם בגוף חי.
Disclosures
אף אחד.
Acknowledgments
המחברים מודים לד"ר Pooneh Bagher וד"ר אריקה וסטקוט להערות עריכה בהכנת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי הלאומי ללב, ריאות ודם מכון של המכון הלאומי לבריאות במספרי הפרס R37-HL041026 וR01-HL086483 לSSS וF32-HL107050 לMJS. תוכן זה הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
| Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
| Papain | Sigma | P-4762 | |
| Collagenase | Sigma | C-8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
| Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
| Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
| Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
| Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| 12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| 3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
| Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| 100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| 1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
| Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
| XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
| Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res. 78, 415-423 (1996).
- Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists. Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).
- Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).
- Busse, R., et al. EDHF: bringing the concepts together. Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).
- Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium. J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, 757-770 (2012).
- Cohen, K. D., Jackson, W. F. Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells. Microcirculation. 12, 169-182 (2005).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).
- Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries. Microcirculation. 15, 503-514 (1908).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).
- Bagher, P., et al. Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).
- Faraci, F. M., et al. Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).
- Emerson, G. G., Segal, S. S. Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ. Res. 87, 474-479 (2000).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).
- Tran, C. H., et al. Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).
- Nausch, L. W., et al. Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).
- Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction. J Physiol. 555, 459-469 (2004).
- Colden-Stanfield, M., et al. Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 61, 632-640 (1987).
- Brunner, F., Kukovetz, W. R. Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).
- Tracey, W. R., Peach, M. J. Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 70, 234-240 (1992).
- Adams, D. J., Hill, M. A. Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).
- Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles. Microcirculation. 4, 35-50 (1997).
