Summary
우리는 원시 그대로의 미세 혈관 내피 세포의 칼슘 신호를 시각화하고 조작하기위한 준비를 제시한다. 내피 튜브 갓 골격 근육 주위의 세포 내와 사이에 생체 형태와 동적 신호의 유지 공급 마우스 저항 동맥에서입니다. 내피 튜브는 다른 조직 및 기관의 미세 혈관으로부터 제조 될 수있다.
Abstract
골격 근육 운동에 의해 예시 된 바와 같이 저항 맥관 의한 혈류의 제어는, 대사 부산물의 제거와 산소의 공급과 영양분 수반을 조절한다. 내피 세포되는 EC ()는 모든 저항 혈관 내막 라인 직경을 조절하는데 중요한 역할 (예, 내피 세포 의존적 혈관 확장)를 제공하고, 조직 혈류함으로써, 크기 및 분포. EC에 의한 혈관 저항의 규제가 확산 autacoids (예 : 질소 산화물 및 아라키돈 산 대사 물질)의 생산에 이르게 내 Ca 2 + 신호에 의해 영향을 받는다 평활근 세포의 이완을 유도 1-3 과분극 4,5. 따라서 내피 세포의 칼슘 2 + 신호의 역학을 이해하는 것은 혈액 흐름 제어를 관리하는 메커니즘을 이해 향한 중요한 단계입니다. 내피 튜브를 분리하는 것은 BL과 관련된 혼란 변수를 제거혈관 내강과 주변 평활근 세포와 달리 EC 구조 및 기능에 영향을 미치는 혈관 주위 신경과 OOD. 여기에서 우리는이 용기에 최적화 프로토콜을 사용하여 뛰어난 상복부 동맥 (SEA)에서 내피 관의 절연을 제시한다.
마취 된 쥐에서 내피 튜브를 분리하기 위해, SEA는 (해부하는 동안 그것을 시각화 촉진하기 위하여) 혈관 루멘 내에서 혈액을 유지하기 위해 현장에서 결찰하고, 복부 근육의 전체 시트를 절제한다. SEA는 골격근 섬유와 결합 조직을 주변에서 무료로 해부, 혈액 루멘에서 플러시하고, 가벼운 소화 효소는 부드러운 분쇄를 사용하여 외막, 신경과 평활근 세포의 제거를 가능하게하기 위해 수행된다. 그대로 내피 세포의 이러한 갓 절연 준비 화학, 전기시를 전송할 수, 개인의 EC는 기능적으로 서로 결합 남은 자신의 기본 형태를 유지간극 결합 6,7를 통해 세포 사이 gnals. 칼슘 신호와 막 생물 물리학에 새로운 통찰력을 제공 할뿐만 아니라, 이러한 준비는 기본 미세 혈관 내피 세포 내에서 유전자 발현과 단백질 지방화의 분자 연구를 가능하게한다.
Introduction
이 프로토콜에서는, 우리는 마우스 바다에서 내피 세포 튜브의 분리에 대해 설명합니다. SEA는 전방 복부 근육에 내흉 동맥 및 공급 산소를 혈액에서 발생한다. 우리의 모델로 SEA 작업은 평활근 세포의 휴식을 관리하고 조정에있는 내피 세포의 역할을 기본 세포 간 신호 이벤트를 공부에 적합하다 상대적으로 긴, 분지 미세 혈관 세그먼트를 제공하기 때문이다. 골격 근육 이외의 조직에 관심이있는 사람들을 위해, 우리는 쉽게 뇌, 창자 및 림프 시스템의 미세 혈관 내피 세포에서 튜브를 얻기 위해 적용 할 수있는이 기술을 발견했다.
이 방법의 주요 특징은 미세 혈관 내피 세포의 손상 길이 (1-3 MM은) 7-9 신호 +, 고립 된 그들이 PSS와 superfused되는 유량 용기에 유리 coverslip에 대해 보안 및 CA 2 군데 있습니다 또는 그것은전기 신호의 6,8에 찔려 죽은. 유량 용기 내에서 관의 위쪽 반은 superfusion 솔루션에 노출 된 실험 개입에 응답 (커버 슬립과 접촉) 하단 보호되는 동안 대기 남아있다. 모두 인트라 및 세포 간 칼슘 2 + 신호 전달 사건을 연구 이외에도, 내피 관 단백질 발현 6,10를 조사하기 위해 유전자 발현 6,10, 면역 조직 화학 염색을 평가하는 정량적 실시간 PCR에 사용될 수 있고, 전기 생리학 연구 생물 리 학적 특성을 정의하는 전기 전도 6,11의.
내피 세포 기능을 연구 내피 튜브 준비 몇 가지 장점이 있습니다. 통상적으로 "C"자형 때, (개별적으로 해리 (관 형성에 남아) 내피 세포 및 평활근 세포 : 처음 분리 과정이 세포 집단 간의 간단한 구별을 제공하는 것이다편안한). 이 선택적 샘플링 및 혈관 기능에 대한 각각의 세포의 기여를 기본 고유 한 속성을 연구 할 수 있습니다. 둘째,이 모델은 평활근, 신경, 및 실질을 둘러싸고, 혈류의 영향으로부터 독립적 내피 본질적인 이벤트 신호의 해상도를 가능하게한다. 갓함으로써 유전자 또는 세포 배양과 관련된 단백질 발현의 변화를 피하고, 절연하면서 제, 내피 세포가 연구된다.
Protocol
1. 장비의 준비 : 유량 용기, 피펫, 및 솔루션
- 실 유량 : 절연 endothelial 튜브 (그림 1A 참조) superfuse려면 왼편에 24mm X 50mm 유리 커버 슬립으로 흐름 챔버를 사용합니다. 챔버를 조립하기 전에, 3 % 염산 70 % 에탄올로 두 유리 커버 슬립을 흘려 초순수로 린스하고, 질소 가스로 건조.
- 피펫 : 피펫의 세 가지 다른 종류의 프로토콜 중에 사용되는 : 삽관, 분쇄, 및 고정. 삽관 및 피닝 피펫 모두 실험 일 전에 제조 될 수 있지만, 분쇄 피펫은 적절 루멘 크기 용기의 직경의 지식을 필요로의 일해야한다.
- 삽관 피펫 : 루멘에서 적혈구를 플러시 긴 테이퍼 단부를 가지고 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 보로 실리케이트 유리 모세관 튜브를 당겨 위하여. ~ 외경 집게로 단부 브레이크 30 % 르동맥 (~ 50 ~ 80 μm의), 화재 광택 부드러운 될 수있는 팁 (그림 1B 참조)보다 SS. 약 45 °로도 각 피펫의 팁을에 도움이됩니다.
- 연화 피펫 : 기계적으로, 내피 관에서 평활근 세포 외막을 해리 붕규산 유리 모세관 튜브에서 triturating 피펫을 만들 수 있습니다. 위와 같이 모세관 튜브를 준비하고 집게로 끝을 휴식. 팁 : 쉽게 깨끗하게 분쇄 피펫 유리의 두꺼운 벽을 깰 수 있도록 유리 채점 장치를 사용하십시오. 내피 튜브가 고립 될으로부터 용기의 외경보다 약 10 ~ 20 ㎛의 더 큰 실험 당일 결정된 내경에 피펫을 휴식. 화재 광택 깨진 끝 매끄러운 때까지 (그림 1C 참조).
- 피펫 피닝 : 유동 챔버 내의 내피 관을 안정화하기 위해, 내피 t 확보 피펫을 고정 할챔버의 커버 슬립 바닥에 우베. 삽관 피펫과 동일한 방법으로 유리 모세관 튜브를 당겨. 끝을 밀봉 할 때까지 ~ 100 μm의 직경, 및 화재 폴란드 집게로 끝을 휴식, 둥근 부드러운 (그림 1D 참조). 주 : 피닝 피펫 팁이 완전히 밀봉되지 않은 경우, 유체는 루멘을 입력하고 실험 결과를 혼동있다.
- 솔루션 : 고순도의 모든 솔루션 (18.2 MΩ) H 2 O를 준비하고 0.2 μm의 필터를 통해 살균. 용액의 삼투압은 285-300 mOsm 사이에 있는지 확인합니다. 4 ℃에서 저장 될 때 솔루션은 약 2 주간 좋은 유지
- 박리 액 : 뛰어난 상복부 동맥 절개 중에 사용 염 용액 (밀리몰 / L 소재)로 구성된다 : (137)의 NaCl, 5 KCl을, 1 MgCl2를, 10 N-2-히드 록시 에틸-N'-2-에탄 술폰산 ( HEPES), 글루코스 (10), 0.01 소듐 니트 로프 루시드 (SNP)D 0.1 % 소 혈청 7.4의 pH와 알부민 (BSA). NO 공여체 SNP는 동맥 cannulate하고 분쇄 중에 평활근 세포의 제거를 용이하게하기 위하여 쉽게들을 만들고 따라서, 평활근 세포를 이완 돕기 위하여 포함된다.
- 해리 용액 : 내피 관의 해리시 사용되는 염 용액 (밀리몰 / L 소재)로 구성된다 : (137)의 NaCl, 5 KCl을, 1 MgCl2를, 10 HEPES, 10 글루코스, 2 염화칼슘, 및 0.1 % BSA, 7.4의 pH. 이 버퍼의 1 ㎖ 분취 량을 추가, 0.62 ㎎ / ㎖ 파파인, 1.5 ㎎ / ㎖ 콜라 1.0 ㎎ / ㎖ 디티 오 에리트 리톨을. 다른 공급 업체의 효소는 효소 활성의 다양한 수준을 가질 수 있기 때문에,이 작품에 사용되는의 제품 번호는 재료의 테이블에 참조 용으로 포함되어 있습니다. 참고 : 프로토콜 동안 효소 분리 버퍼와 해리 버퍼 모두가 서로 다른 단계에서 사용된다.
- Superfusion 솔루션 : superfusin에 사용되는 생리 식염수 (PSS)G 고립 된 내피 관 (밀리몰 / L의)로 구성되어있다 : 137의 NaCl, 5 KCl을, 1 MgCl2를, 10 HEPES, 7.4의 pH 10 포도당과 2 염화칼슘 2.
- 수술 절차를 시작하기 전에 버퍼 및 솔루션을 준비합니다. 200 ㎖의 삼각 플라스크에 4 ° C와 나누어지는 해부 버퍼 50 ㎖에서 솔루션을 제거하고 얼음에 놓습니다. 또한, 해리의 나누어지는 50 ML 효소없이 버퍼 실온으로 평형을 벤치 위에 놓습니다. 4 ° C에서 superfusion 솔루션을 제거하고 벤치 위에 실온으로 평형을 할 수 있습니다.
2. 동물 준비
동물과 관련된 모든 절차 및 프로토콜은 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 맞는 있는지 확인하십시오. 여기에서 설명하는 절차는 대학의 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다미주리.
- 남성 또는 적어도 9 주 이전 암컷 생쥐를 사용하여 개별적으로 연구. 복강 내 (IP) 주입을 통해 펜토 바르 비탈 나트륨 (60 ㎎ / ㎏)와 마우스를 마취. 팁 : 주입은 과다 복용의 가능성을 감소하기 전에 멸균 식염수에 10 ㎎ / ㎖로 펜토 바르 비탈을 희석.
- 마취는 즉시 펜 토바 비탈의 첫 번째 주사 후 온도 조절을 타협, 그래서 따뜻하게 마우스를 유지. (~ 37 ° C로 보정) 가열판 위에 금속 캐리어 (통풍 알루미늄 바구니)를 사용하여 안정적인 마우스의 온도를 유지하기 위해 잘 작동합니다. 또한, 마우스에서 적절한 거리에서 그것의 위치를주의하면서 가열 램프를 사용합니다. 마취의 적절한 수준 (발가락이나 꼬리 핀치에 철수의 부족)에 도달 할 때까지 마우스마다 5 ~ 10 분을 모니터링합니다. 보충 투여 량은 15 ~ 20 분 후에해야 할 수 있습니다. 그것은 특히, 비만 세, 또는 동물과 함께 과다 복용을 방지하기 위해 천천히 그리고 신중하게 진행하는 것이 가장 좋습니다그렇지 않으면 스트레스들.
- 조심스럽게 작은 애완 동물의 털 가위로 면도 복부 측면에서 머리를 제거합니다. 특별한주의는 동물에게 외상을 방지하기 위해주의해야한다. 그것은 음모 지역에 겨드랑이에 걸친 영역에서 모두 머리를 제거하는 것이 도움이된다. 신선한 알코올 면봉으로 어떤 느슨하게 달라 붙는 머리카락을 제거합니다.
- 가능한 한 복부 벽의 많은 부분을 노출 퍼져 모두 앞과 뒷다리 거짓말, 그 뒷면에 마우스를 놓습니다. 필요하다면, 확산 - 이글 방식으로 다리를 고정 실험실 테이프를 사용한다.
3. 우수한 상복부 동맥의 분리
- 단지 음모 영역의 면적 위의 피부를 통해 작은 절개를합니다. 기본 복부 근육에 손상을 피하는 동안 만 피부가 절단되고 있음을 확인, 각각의 뒷다리 밖으로 각 방향에서 가로 방향으로 절개를 확장합니다. rostrally 복부 흉곽의 상단에 정중선과 함께 절개를 계속N 각각의 앞발에 각 방향에서 가로 방향으로 절개를 확장합니다.
- 피부를 부드럽게 들어 올려 결합 조직 (그림 3A 참조)하여 복부 근육의 전체 표면을 노출, 기본 근육에 피부를 유지 절단 가위를 사용합니다. 실온 0.9 % 식염수로 노출 근육 관개.
- 바다의 작은 크기로 인해, 추가 절차에 대한 실체 현미경 아래에 동물을 배치합니다. 집게로 흉골의 아래쪽에있는 지방 패드를 들어 올리고 그것을 통해 절개를합니다. 기본 조직에 너무 깊이 잘라하지 않도록하고, 하부 늑골을 따라 절개를 계속합니다. 바다는 볼 수 있어야합니다, 그것은 손상되지 않도록주의하십시오. 절개가 완료되면, 실온 0.9 % 식염수로 노출 된 조직 관개.
- 골격근의 상부층이 후퇴 한 후에, SEA 및 내부 근육 쉽게 식별된다. 팁 : 길이의 주원래 길이를 대략적으로 (분리에 자신의 축을 따라 단축) 내피 관을 확장하는 분리하기 전에 생체 내에서 SEA. 집게와 가위를 사용하여 조심스럽게 SEA 아래의 얇은 근육층을 절개.
- 각진 겸자를 사용하여 밑에 SEA 6-0 실크 봉합사의 길이를 통과하고 가압 및 후속 분리 및 세정 중에 시각화를 용이하게하기 위해 혈관 내강 안에 보유 혈액 보관하는 동맥과 정맥을 결찰 인접.
- 반대쪽에서 바다 결찰 절차를 반복합니다.
- 모두 SEA는 결찰 한 후, 각각의 측면을 분리하는 복부 근육의 중간 선을 따라 절개를합니다.
- 피부를위한 수행과 완전히 몸에서 복부 근육을 분리하는 수직 바깥 가장자리를 따라 절개를 계속 한 후, 각 방향에서 가로 방향으로 절개를 확장합니다. 가압 루멘을 유지하기 위해 바다로 공급 혈관의 손상을 방지.
- C밀봉을 유지하기 위해 결찰 위의 바다, 유타, 4 ° C 해부 버퍼 10 ㎖를 포함하는 50 ㎖의 비이커에 고립 된 근육과 동맥을 배치합니다.
- 복부의 다른 측면에 대해 절차를 반복하고 10 분 동안 절개 버퍼에서 조직을 배양한다.
- (그림 (b) 참조) 냉장 (4 ℃) 포함 해부 실 해부 버퍼에서 바다를 포함하는 복부 근육을 놓습니다. 해부 챔버 하단에 실 가드 (폴리 디 메칠 실록산 [PDMS])의 층으로 페트리 접시로 구성되어 있습니다.
- 곤충 핀 (0.15 mm)를 사용하여 생체 내 길이 (위에서 언급 한)을 대략하고 실 가드에 고정 고립 바다와 복부 근육을 스트레칭. 팁 : 같은 근육을 정위 복막에 직면 얇은 층이 상위에 있다고는 transillumination를 사용하여 바다를 쉽게 볼 수 있습니다.
- 미세 미세 절제 장비를 활용하고 향해 결찰의 상류 사이트에서 작업하류 단, 최초의 주요 분기 사이트 (1-2 CM) 때까지 짝을 정맥 주위 조직에서 바다의 선택을 취소합니다. 그럼 그냥 분기 사이트 위에 그냥 내고 아래를 절단하여 바다를 절제.
- 혈관 내강 내에서 유지 혈액을 제거하려면, 바다를 cannulate 얼음 차가운 해부 버퍼로 세척합니다. 실라 스틱 튜브의 조각을 사용하면, 차가운 얼음 해부 버퍼를 포함하는 5 ML의 주사기에 삽관 피펫의 뒤쪽 끝을 연결하고 바다를 cannulate하는 해부 챔버 내에서 팁의 위치를 미세 조작기의 마이크로 피펫을 확보.
- 적혈구의 모두가 플러시되면, 삽관 피펫에서 바다를 제거하고 해부 접시 밖으로 피펫을 올립니다.
- 작은 세그먼트로의 길이는 각 1-3밀리미터을 SEA를 잘라. 이러한 짧은 세그먼트 내피 튜브의 분리를 용이하게한다.
4. 내피 튜브의 분리
- 12mm X 75mm 유리 컬트 채우기차가운 얼음 해부 버퍼 우레 관을 반 누름합니다. 기울어 진 집게를 사용하여, 문화 튜브에 동맥 조각을 전송하고 얼음에 배치합니다. 이때, 별도의 12mm X 75mm 배양 튜브에서 1 ㎖의 최종 부피로 해리 완충액으로 소화 효소를 결합 (1.3.2 해법 참조)와 가열 블록을 37 ° C로 용액을 예열.
- 해리 버퍼와 효소가 예열되는 동안, 조심스럽게 용기 세그먼트를 포함하는 작은 볼륨을 떠나는 문화 튜브에서 해부 버퍼를 대기음.
- 조심스럽게 남아 해부 버퍼를 씻어 효소없이 상온 해리 버퍼를 추가합니다. 팁 : 동맥 조각들을 재 정착을 기다리는 시간을 절약하기 위해 문화 튜브의 바닥에 남아 해리 버퍼가 천천히 같은 추가합니다. 충격을 최소화하기 위해 37 ° C에, 실온 (~ 24 ° C)에, 얼음 (4 ℃)에서 여러 단계를 통해 버퍼 온도를 올립니다.
- 조심스럽게 dissoc를 대기음iation은 선박 세그먼트를 포함하는 작은 볼륨을 남겨주십시오되고 다시, 문화 관에서 버퍼.
- 가열 블록으로부터 효소로 예열 해리 완충액을 제거 용기 세그먼트를 함유하는 배양 튜브에 효소 용액 1 ㎖을 전송하며, 가열 블록에 확대 배양 튜브를 배치. 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
- 효소 배양하는 동안, 분쇄 피펫을 준비 미네랄 오일로 가득 찰과 미세 조작기에 장착 된 마이크로 실린에 고정합니다. 그런 해리 버퍼의 2 NL과 피펫을 채우고 유량 용기에 피펫 팁의 위치를 마이크로 실린 플런저를 철회.
- 30 분의 인큐베이션의 끝에, 가열 블럭에서 배양 튜브를 제거하고 신중 위와 버퍼 대기음.
- 실내 온도 해리 버퍼의 4 ㎖로 동맥 세그먼트를 씻으십시오. 참고 :이 선박 segm를 유지할 필요가 더 이상문화 튜브의 바닥에 행군, 동맥 조각을 방해 실제로 잔류 효소가 효과적으로 제거되어 있는지 확인하는 데 도움이됩니다.
- 완만 한 밀리리터 마이크로 피펫으로 흡입하고, 해리 완충액 1 ㎖를 유동 챔버에 배치하여 유동 챔버로 이동 한 용기 세그먼트.
- 마이크로 실린을 함유하는 미세 조작기를 이용하여, 용기 세그먼트의 일단 근처 분쇄 피펫의 선단을 위치.
- ECS의 기계적 변형을 유발 한 후 다시 챔버로 꺼내하지 않도록, triturating 피펫 천천히 (225 NL / 초)로 혈관 세그먼트 (회수 500 NL)를 대기음. 소화에 성공하면, 평활근 세포 및 외막은 내피 관으로부터 해리 될 것이다.
- 모든 평활근 세포가 분해 될 때까지 분쇄를 반복합니다. 과도한 분쇄 (4 배 이상)되는 EC 손상 및 효능에 응답하지 않는 렌더링 수 있다는 점에 유의해야합니다. 팁 :분쇄 피펫을 사용하여, 튜브를 얽히게에서 그것을 유지하기 위해 가능한 한 빨리 멀리 내피 관에서 외막 이동합니다. 주 : 분쇄 피펫을 사용하여, 절연 내피 관은 흡입 및 분리 챔버로 이송 될 수있다.
- 흐름의 방향을 따라 정렬 유량 용기의 중심에있는 내피 튜브를 놓고 triturating 피펫을 제거합니다.
- 미세 조작기의 보안 피닝 피펫은 유량 용기의 양쪽 끝에 장착하고, 내피 튜브의 양단에 자신의 팁을 배치합니다.
- 챔버의 바닥에 그것을 눌러 튜브의 한쪽 끝을 통해 고정 피펫을 낮 춥니 다. 튜브의 대향 단부에 같은 방식으로 제 피닝 피펫을 위치. 참고 : 피닝 피펫의 위치는 트레이드 오프 튜브 (멀리 튜브의 끝에서 그들을 배치)를 확보하고 더 많은 영상 / 실험 지역 (가까운 튜브의 끝에 그들을 배치)를 허용 사이입니다. t 찾기옷자락 ~ 튜브의 각 끝에서 50 ㎛ 잘 작동합니다. 고정 피펫 튜브를 만지는 것처럼, 천천히함으로써 생체 내 길이에 근접하도록 확장, 관의 축 방향을 철회 한 후 튜브를 고정하는 실 바닥에 피펫을 누릅니다.
- superfusion 용액의 흐름을 시작하고 (도 3c 참조) 내피 관이 평형과 밀착하는 적어도 20 분 동안 휴식을 허용한다. 내피 관에 걸쳐 일정한 유체 흐름 (superfusion)을 유지하기 위해 연동 펌프를 사용한다. 참고 : 내피 관 유량 용기의 바닥 (~ 25 분)에 부착 또는 내피 튜브에서 이탈하지 않도록하기 위해 자리에 남아되면 고정하기 피펫을 제거 할 수 있습니다.
5. 염료로드 및 칼슘 이미징
- , 세포 내 칼슘 반응을 시각화 실온에서 FLUO - 오전 4 염료로 내피 튜브를로드하려면 (~ 24 ° C). 욕실에서 유체의 흐름을 중지하고 FLUO-4를 추가10 μM의 최종 농도에서 챔버 AM. 다음 세포 염료를 제거하고 세포 내 염료가 완전히 탈 에스테르 화 된 보장하기 위해 20 분 동안 신선한 PSS와 내피 튜브를 superfuse, 색소 세포를 입력 할 수 있도록하기 위해 10 분을 기다립니다.
- 칼슘 이미징을 수행합니다. 이 작품의 경우, 직립 현미경은 회전 디스크 공 촛점 이미징 시스템을 갖추고 주변 환경의 온도에서 사용되었다 (그림 2 참조). 491 nm의 레이저 형광 칼슘 염료를 자극하고 강화 된 디지털 카메라를 사용하여 (500-550 nm의 방출에) 이미지를 수집.
Representative Results
칼슘 반응은 아세틸 콜린을 사용하여 갓 고립 된 내피 튜브 (ACH)에서 시작할 수 있습니다. 이 영화에서, 10 μM FLUO - 오전 4시로드 내피 관은 1 μM 이크 (동영상 1)의 superfusion 자극한다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 염료는 491 nm에서 흥분과 방출을 강화 전하 결합 소자 카메라를 사용하여 500-550 nm의에서 기록되어있다. 이미지 스택은 25 초 동안 / 초 120 프레임에 인수 된 후 (예 : 40 프레임 / 초)를 평균 할 수 있습니다. 시간에 따른 주제 형광 이미지는도 4에 나타낸다.
그림 1. 챔버와 내피 튜브의 분리시 사용 피펫 흐름. A) 뽑아, 깨진 광택 및 각도 (오른쪽) 삽관 피펫 뽑아 (왼쪽)의 기초. B로 24mm X 50mm 유리 coverslip에 조립 흐름 챔버) 예. 이는 피펫은 해부 다음 동맥 내강에서 적혈구를 세척하는데 사용된다. 스케일 바 = 200 μm의. C) 뽑아, 부서 및 광택 (오른쪽) 분쇄 피펫 뽑아 (왼쪽)와 예. 이 피펫의 내부 직경은 동맥의 외부 직경에 의해 결정된다. (뽑아 깨진 닦은 오른쪽) 고정 피펫 뽑아 (왼쪽)과 스케일 바 = 200 μm의. D) 예. 이 피펫 팁은 반올림 완전 유동 챔버에서 내피 관을 확보하기 위해 밀봉된다. 스케일 바 = 200 μm의. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 칼슘 2 + 신호의 영상.) 칼슘 이미징에 사용되는 수직 현미경. B) (B) 강화 전하 결합 소자 카메라. C) 침수 목표 (A) 63X (와 공 촛점 (A)를 회전하는 디스크 장치에 대한 디스크 공 초점 현미경을 회전 NA 1) =와 (b) 20X (NA = 0.5) 영상에 사용됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 복부 근육의 분리 및 우수한 상복부 동맥. (즉, 혈관 결찰한다)를 입력하는 지방 패드 아래의 사이트를 표시합니다. 스케일 바 = 1 CM. B) 미세 절제에 대한 해부 실에서 고정 격리 복부 근육 (일방적 인)과 SEA. 빨간색 화살표 (용기의 세척이 중단 된 지점, 즉) SEA의 첫 번째 주요 분기점 사이트를 나타냅니다. 바다에서 스케일 바 = 1 CM. C) 격리 된 내피 세포의 관. 실온에서 1 시간 배양 한 다음 내피 관의 미분 간섭 대비 이미지. 내피 관을 3 ㎖ / 분으로 Superfusion 완충액 superfused 하였다. 스케일 바 = 50 μm의. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 내피 세포의 관에있는 칼슘 형광. 1 μM 아세틸 콜린 아세틸 콜린 투여시 자극. B 전. A) 형광) 내피 튜브 형광과 자극에 대한 응답으로 내피 관의 대표 형광 이미지, t = 5 초에서 t = 0 초. C) 내피 튜브 형광. t에서 D) 내피 튜브 형광 = t = 15 초에서 10 초. E) 내피 튜브 형광 t = 20 초에서. F) 내피 튜브 형광. 스케일 바 = 40 μm의. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
여기에서 우리는 바다에서 내피 튜브의 분리 및 제정되는 EC 내에서 신호 이벤트 + 칼슘을 시각화하는이 제제의 사용을 설명합니다. 이 절차는 원래 햄스터 cremaster 근육 (8)의 동맥에서 내피 튜브를 분리하기 위해 개발 한에서 적응했다. 햄스터 트랙터 근육과 뺨의 공급 동맥 주머니 소동맥 (10), 마우스 우수한 상복부 동맥 6,7,9, 마우스 장간막과 대뇌 : 여기에 제시된 기술의 사소한 변화를 활용하여, 우리는 등의 혈관 침대의 다양한에서 내피 관, 격리했다 동맥과 림프 미세 혈관 (게시되지 않은 관찰, 참조는 장간막 혈관 (12)과 대뇌 혈관 (13) 분리에 포함되어 있습니다). 새로운 혈관 내피 침대에서 튜브를 분리하면 원래의 프로토콜을 수정해야 할 수도 있습니다. 분리가 실패하면, 소화 시간을 변경하여 시작하는 것이 최상이다 :내피 관 평활근 세포 외막에서 격리하고 내피 관이 그대로 유지하지 않는 경우 소화 시간을 단축하기 어려운 경우 소화 시간을 늘리십시오. 소화 시간을 변경하는 것이 실패한 경우, 소화 효소의 농도 또는 분해 온도를 조절하는 시도되어야한다. 또 다른 옵션은 평활근 세포 분리에 전단력을 증가 분쇄 피펫의 내경을 감소시키는 것이다. 유체 분사의 속도를 증가하는 것도 같은 효과를 시도했지만 준비가 손상 될 가능성이 높습니다 할 수 있습니다. 그것은 내피 세포가 잘 접합부 단백질에 의해 서로 연결되어 있지 않을 수있는 혈관 내피 세포의 손상으로부터 튜브를 분리하는 것이 가능하지 않을 수 있음을 인식해야한다.
효소 소화 다음 평활근 세포 해리는 초기 핸드 식 피펫 8을 사용하여 실시 하였다. 우리는 microsyr를 사용 분쇄 과정을 정제했다이상 내피 튜브의 일관된 분리 (최대 3 ㎜) 6을 사용할 수있다 잉 시스템. 이 시스템을 사용하는 경우, 분쇄 피펫은 유체 이동 및 용기 세그먼트를 함유 PSS를 제어 피스톤 사이에 연속적인 액체 칼럼을 제공하는 광유 채워서된다. 용기로서 일정한 전단에 마이크로 실린 피스톤 결과 일정한 구동력과 함께 유체가 비압축성 피펫 팁을 통해 강제된다. 대조적으로, 종종 해리 세포에 사용 손 기술 (예 파스퇴르 피펫의 끝 부분에 고무 전구 짜지) 구동 압력 변동을 도입 공기를 압축하고, 이에 따라, 전단이 피펫 팁에 작용을 포함한다.
미세 혈관의 내피 세포 기능을 연구 튜브 준비에 여러 가지 장점이 있습니다. 첫번째는 분리 공정의 ECS 별개 동질 원시 세포 개체군 매끄러운 MU를 제공하는 것이다scle 세포. EC에 물리적으로 연결된 튜브 남아 있기 때문에, 그들은 저작 중에 릴렉스 된 상태의 경우 "C"구성을 유지 개별 평활근 세포로부터 구별된다. 따라서 각각의 세포 유형을 용이하게 구별된다 예를 들어, 실시간 PCR과 면역 조직 화학 10 분자 기술에 대한 샘플을받을 때. 다수의 튜브가 단일 용기로부터 (또는 SEA 대해 수행 양안 용기로부터) 분리되어 있기 때문에, 분자 데이터 및 기능 데이터는 주어진 동물의 동일한 용기에서 얻을 수있다. 따라서 분자 발현은 미세 혈관 내피 세포의 기능적인 행동과 상관 관계 될 수있다. 또한, 미세 혈관 내피 본질적인 내 및 세포 간 모두 시그널링 이벤트 혈역학의 힘 (압력, 유량), 혈류 (예를 들면 호르몬)에 운반 혈관 작용 성 제제의 영향으로부터 독립적으로 해결 될 수 있고, 또는 주변의 평활근 세포 (예를 들어60; myoendothelial 커플 링을 통해 14 ~ 16), 신경 (17), 또는 조직의 실질 18.
내피는 새롭게 지정된 미세 혈관으로부터 격리되기 때문에 중요한 달리 배양되는 EC 19-21와 관련된 표현형의 어떠한 변화도 없다. 예를 들어, 배양 된 내피는 무스 카린 수용체 발현을 잃게함으로써 자신의 칼슘 신호 프로파일을 변경합니다. 또한, 내장 컴퓨터의 전기 생리학 속성은 문화 (22)에 변경할 수 있습니다. 개인 내피 기능적인 간격 접합 채널을 통해 결합 남아 있기 때문에, 내피 관 세포 6,7 사이의 전기 및 CA 2 + 신호의 전도를 공부를위한 이상적인 모델을 제시한다. 또한 해리 평활근 세포 용이 미세 혈관 기능 (23)을 밑에 상보 데이터에 대한 패치 클램프 기술로 연구되어 인식해야한다.
내피 튜브 M에 키 제한ODEL는 온도 증가와 준비의 불안정성이다. 바다에서 우리의 준비는 주변 환경의 온도 (~ 24 ° C)에서 32 ° C에서 몇 시간 동안 안정하고 건강한 입증하고 있지만, 형태 및 기능 저하가 37 ° C에서 10 시간 이내에 발생합니다. 내피 튜브의 두 번째 중요한 제한은 그대로 혈관 벽 14-16에서 EC의 기능에 필수적이다 myoendothelial 접합 및 고유의 신호 도메인의 손실이다. 또한 인식해야한다, 즉 더 긴 튜브가 길어으로 완전히 평활근 세포 및 외막을 둘러싼 해리하기 어려워지기 때문에 튜브의 제조가 복잡하게되어 상대적으로 먼 거리 6을 통해 조사되는 세포 간 신호 전달을 활성화하는 동안. 우리는 1-2밀리미터보다 긴 튜브는 또한 위치와 유량 용기에 확보하기 어려운 것을 발견했다. 반대로, 짧은 튜브 (예 <1mm) ENA하면서8 공부 될 BLE 칼슘 2 + 및 전기 신호는, 그들이 유동 챔버 superfusion 동안 유지하기 어렵다. immunolabeling 단백질 발현 및 현지화의 색인을 제공하지만 마지막으로, 심지어 양자 튜브의 최적의 분리와 함께, 서양 말을 사용하여 단백질 발현의 전통적인 정량 불충분 한 자료가있다. 이러한 한계에도 불구하고, 내피 관은 생체 내에서 미세 혈관 내피 세포 기능의 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공하기위한 새로운 준비를 나타냅니다.
Disclosures
없음.
Acknowledgments
저자는 원고를 준비하는 사설 코멘트 박사 Pooneh Bagher 박사 에리카 웨스트 코트 감사합니다. 이 작품은 보너스 번호 R37-HL041026 및 SSS에 R01-HL086483 및 MJS에 F32 - HL107050에서 국립 심장, 폐 및 보건 국립 연구소의 혈액 연구소에 의해 지원되었다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
| Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
| Papain | Sigma | P-4762 | |
| Collagenase | Sigma | C-8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
| Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
| Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
| Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
| Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| 12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| 3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
| Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| 100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| 1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
| Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
| XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
| Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res. 78, 415-423 (1996).
- Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists. Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).
- Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).
- Busse, R., et al.
- Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium. J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, 757-770 (2012).
- Cohen, K. D., Jackson, W. F. Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells. Microcirculation. 12, 169-182 (2005).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).
- Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries. Microcirculation. 15, 503-514 (1908).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).
- Bagher, P., et al. Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).
- Faraci, F. M., et al. Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).
- Emerson, G. G., Segal, S. S. Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ. Res. 87, 474-479 (2000).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).
- Tran, C. H., et al. Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).
- Nausch, L. W., et al. Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).
- Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction. J Physiol. 555, 459-469 (2004).
- Colden-Stanfield, M., et al. Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 61, 632-640 (1987).
- Brunner, F., Kukovetz, W. R. Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).
- Tracey, W. R., Peach, M. J. Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 70, 234-240 (1992).
- Adams, D. J., Hill, M. A. Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).
- Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles. Microcirculation. 4, 35-50 (1997).
