Summary
نقدم التحضير لتصور والتلاعب إشارات الكالسيوم في الأم، سليمة الاوعية الدموية الدقيقة البطانة. أنابيب البطانية المعزولة حديثا من الشرايين المقاومة الماوس توريد الهيكل العظمي والعضلات في الاحتفاظ مورفولوجيا الجسم الحي والإشارات الحيوية داخل وبين الخلايا المجاورة. أنابيب البطانية يمكن إعداد من microvessels من الأنسجة والأعضاء الأخرى.
Abstract
السيطرة على تدفق الدم من الأوعية الدموية المقاومة ينظم امدادات من الاوكسجين والمواد المغذية يصاحب ذلك مع إزالة الأيضية والمنتجات، كما يتضح من خلال ممارسة العضلات والهيكل العظمي. الخلايا البطانية (ECS) خط البطانية من جميع السفن المقاومة وتلعب دورا رئيسيا في التحكم في القطر (مثل البطانة التي تعتمد على توسع الأوعية)، وبالتالي، فإن حجم وتوزيع تدفق الدم الأنسجة. ويتم تنظيم المقاومة الوعائية من قبل ECS من قبل الخلايا كا 2 + إشارات، مما يؤدي إلى إنتاج autacoids إنتشاري (مثل أكسيد النيتريك وحمض الأراكيدونيك الأيض) 1-3 وفرط الاستقطاب 4،5 التي تثير على نحو سلس استرخاء الخلايا العضلية. وبالتالي فهم ديناميات البطانية كا 2 + إشارات هو خطوة رئيسية نحو فهم الآليات التي تحكم مراقبة تدفق الدم. عزل أنابيب البطانية يلغي المتغيرات التباس المرتبطة BLالعود في التجويف السفينة ومع توضيح خلايا العضلات الملساء المحيطة بالأوعية والأعصاب، والتي تؤثر على خلاف ذلك بنية EC وظيفة. هنا نقدم عزل أنابيب البطانية من الشريان الشرسوفي متفوقة (SEA) باستخدام بروتوكول الأمثل لهذه السفينة.
لعزل أنابيب البطانية من الماوس تخدير، هو ligated على البحر في الموقع للحفاظ على الدم داخل التجويف السفينة (لتسهيل تصور أنه خلال تشريح)، ويتم رفعه ورقة كاملة من عضلات البطن. يتم تشريح SEA المحيطة خالية من ألياف العضلات والهيكل العظمي والنسيج الضام، يتم مسح الدم من التجويف، ويتم تنفيذ عملية الهضم الأنزيمية خفيفة الى تمكين إزالة البرانية والأعصاب وخلايا العضلات الملساء باستخدام سحن لطيف. هذه الاستعدادات معزولة طازجة من البطانة سليمة الاحتفاظ مورفولوجيا وطنهم، مع الفردية ECS المتبقية إلى جانب وظيفيا مع بعضها البعض، وقادرة على نقل المواد الكيميائية والاشتراكية الكهربائيةgnals intercellularly من خلال تقاطعات الفجوة 6،7. بالإضافة إلى تقديم رؤية جديدة في إشارات الكالسيوم والغشاء الفيزياء الحيوية، هذه الاستعدادات تمكين الدراسات الجزيئية للتعبير الجينات والبروتينات التعريب داخل الاوعية الدموية الدقيقة البطانة الأصلية.
Introduction
في هذا البروتوكول، ونحن تصف عزل أنابيب الخلية البطانية من SEA الماوس. دعت SEA من الشريان واللوازم الصدري الدم المؤكسج الداخلية لعضلات البطن الأمامي. لدينا عمل مع SEA كنموذج يعزى إليها تقديم طويلة نسبيا، وقطاعات microvessel غير متفرعة التي هي مناسبة تماما لدراسة الأحداث الإشارات بين الخلايا الكامنة دور البطانة في حكم وتنسيق سلس استرخاء الخلايا العضلية. للراغبين في الأنسجة الأخرى من العضلات والهيكل العظمي، وجدنا هذه التقنية يمكن تكييفها بسهولة للحصول على أنابيب البطانية من microvessels من الدماغ، الأمعاء والجهاز اللمفاوي.
الملامح الرئيسية لهذه الطريقة هي أن أطوال سليمة (1-3 ملم) من الاوعية الدموية الدقيقة البطانة هي معزولة، مضمونة مقابل ساترة الزجاج في غرفة التدفق التي يتم superfused أنها مع جهاز الأمن الوقائي، وتصوير لكا 2 + اشارة 7-9 أومخوزق للإشارات الكهربائية 6،8. داخل غرفة التدفق، يتعرض النصف العلوي من أنبوب إلى حل superfusion ويستجيب لتدخلات التجريبية، في حين أن النصف السفلي (في اتصال مع ساترة) محمية وتبقى هادئة. بالإضافة إلى دراسة كل من داخل وبين الخلايا كا 2 + الأحداث يشير، وأنابيب البطانية يمكن استخدامها لكمية الوقت الحقيقي PCR لتقييم التعبير الجيني 6،10، المناعية للتحقيق في تعبير البروتين 6،10، والدراسات الكهربية لتحديد الخصائص الفيزيائية الحيوية من التوصيل الكهربائي 6،11.
وهناك العديد من المزايا لإعداد أنبوب البطانية لدراسة وظيفة بطانة الأوعية الدموية. الأول هو أن عملية العزل يوفر تمييز بسيط بين اثنين من السكان الخلية: الخلايا البطانية (التي لا تزال في تشكيل أنبوب) وخلايا العضلات الملساء (فصل على حدة؛ عادة "C" عندما شكلاسترخاء). وهذا يسمح لأخذ عينات انتقائية ودراسة خصائص فريدة من نوعها الكامنة مساهمة منها خلايا 'إلى وظيفة السفينة. الثانية، وهذا النموذج يمكن حل إشارات الأحداث الجوهرية إلى البطانة، مستقلة عن تأثير تدفق الدم، العضلات الملساء المحيطة والأعصاب، وحمة. الثالث، هو درس البطانة حين طازجة معزولة، وبالتالي تجنب التغيرات في الجينات أو التعبير البروتين المرتبطة ثقافة الخلية.
Protocol
1. إعداد المعدات: غرفة التدفق، الماصات، وحلول
- تدفق الغرفة: استخدام غرفة التدفق مع 24 مم × 50 مم الزجاج ساترة على الجزء السفلي لsuperfuse الأنابيب المعزولة البطانية (انظر الشكل 1A). قبل تجميع الغرفة، وغسل coverslips الزجاج مع كل من حمض الهيدروكلوريك 3٪ و 70٪ من الإيثانول، وشطف مع الماء عالى النقاء، والجافة مع غاز النيتروجين.
- وتستخدم ثلاثة أنواع مختلفة من الماصات خلال بروتوكول: الماصات القسطرة، سحن، وتعلق. كل من القسطرة وماصات تعلق يمكن إجراؤها قبل يوم من التجربة، ولكن ينبغي بذل ماصة سحن يوم لأنه يتطلب معرفة قطر السفينة إلى حجم التجويف بشكل مناسب.
- ماصات القسطرة: من أجل طرد خلايا الدم الحمراء من التجويف، وسحب أنابيب زجاجية البورسليكات الشعرية باستخدام مجتذب micropipette أن يكون طويلا، وينتهي مدبب. كسر نهايات مع ملقط لقطرها الخارجي 30٪ ~ لوSS من ذلك الشرايين (~ 50-80 ميكرون)، والبولندية النار في تلميح إلى أن تكون ناعمة (انظر الشكل 1B). فإنه من المفيد أن أيضا زاوية نصائح من الماصات إلى ما يقرب من 45 درجة.
- ماصات سحن: لتنأى ميكانيكيا خلايا العضلات الملساء والبرانية من أنابيب البطانية، وجعل ماصات الطحن من البورسليكات أنابيب زجاجية الشعرية. إعداد الأنابيب الشعرية على النحو الوارد أعلاه، وكسر نهاية بالملقط. نصيحة: استخدم جهاز زجاج هدفا لجعله أسهل لكسر الجدار أكثر سمكا من الزجاج سحن ماصة نظيفة. كسر ماصة إلى القطر الداخلي تحدد على يوم من التجربة، ما يقرب من 10-20 ميكرومتر أكبر من القطر الخارجي للسفينة التي سيتم عزل أنابيب البطانية. البولندية النار نهايات كسر حتى تصبح ناعمة (انظر الشكل 1C).
- تعلق ماصات: لتحقيق الاستقرار في أنبوب البطانية داخل غرفة التدفق، وجعل تعلق الماصات لتأمين ر البطانيةيوب ضد ساترة السفلي من الغرفة. سحب الأنابيب الشعرية الزجاج في بنفس الطريقة التي ماصات القسطرة. ثم كسر نهايات مع ملقط ليبلغ قطرها 100 ميكرون ~، والبولندية النار حتى يتم اغلاق النصائح، وتقريب وسلس (انظر الشكل 1D). ملاحظة: إذا لم يتم مختومة غيض من ماصة تعلق تماما، وسوف تدخل السوائل لمعة وربما نخلط النتائج التجريبية.
- الحلول: إعداد جميع الحلول في عالى النقاء (18.2 MΩ) H 2 O وتعقيم لهم من خلال 0.2 ميكرون التصفية. تأكد من أن الأسمولية من الحلول ما بين 285-300 الميلي أسمول. تبقى حلول جيدة لمدة أسبوعين تقريبا عند تخزينها في 4 درجات مئوية.
- الحل تشريح: الحل الملح المستخدم أثناء تشريح الشريان الشرسوفي متفوقة يتكون من (في ملمول / لتر): 137 كلوريد الصوديوم، 5 بوكل، 1 MgCl 2، 10 N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic حمض ( HEPES)، 10 الجلوكوز، 0.01 نتروبروسيد الصوديوم (SNP)، ود 0.1٪ ألبومين المصل البقري (BSA) مع الرقم الهيدروجيني من 7.4. يتم تضمين SNP المانحة NO للمساعدة على الاسترخاء خلايا العضلات الملساء، مما يجعلها أسهل ليقني؛ يدخل القنية الشريان وسلس لتسهيل إزالة الخلايا العضلية أثناء سحن.
- حل التفكك: الحل الملح المستخدم أثناء التفكك من الأنبوب البطانية يتكون من (في ملمول / لتر): 137 كلوريد الصوديوم، 5 بوكل، 1 MgCl 2، 10 HEPES، 10 الجلوكوز، 2 و CaCl 2، و 0.1٪ BSA، مع الرقم الهيدروجيني من 7.4. إلى قسامة 1 مل من هذا المخزن المؤقت، إضافة: غراء 0.62 ملغ / مل، 1.5 ملغ / مل كولاجيناز و 1.0 ملغ / مل dithioerythritol. منذ الانزيمات من مختلف الموردين يمكن أن يكون لها مستويات مختلفة من النشاط الأنزيمي، يتم تضمين أرقام المنتج من تلك المستخدمة لهذا العمل لتكون مرجعا في جدول المواد. ملاحظة: خلال بروتوكول يتم استخدامها على حد سواء تفارق العازلة وتفارق العازلة مع الانزيمات في الخطوات المختلفة.
- الحل Superfusion: الحل الملح الفسيولوجية (PSS) يستخدم لsuperfusinز يتكون الأنبوب البطانية المعزولة (في ملمول / لتر): 137 كلوريد الصوديوم، 5 بوكل، 1 MgCl 2، 10 HEPES، 10 الجلوكوز و 2 و CaCl 2، مع الرقم الهيدروجيني من 7.4.
- إعداد مخازن والحلول قبل البدء في العمليات الجراحية. إزالة الحلول من 4 درجة مئوية، وقسامة 50 مل من العازلة تشريح في قارورة 200 مل مخروطي ووضعه على الجليد. بالإضافة إلى ذلك، قسامة 50 مل من التفكك العازلة دون الانزيمات ووضعه على رأس مقاعد البدلاء لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة. إزالة حل superfusion من 4 ° C والسماح لها لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة على رأس مقاعد البدلاء.
2. إعداد الحيوان
تأكد من أن جميع الإجراءات والبروتوكولات التي تشمل الحيوانات هي في الاتفاق مع المعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تمت الموافقة على الإجراءات الموضحة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام جامعةميسوري.
- استخدام الذكور أو إناث الفئران لا يقل عن 9 أسابيع من العمر ودراسة كل على حدة. تخدير الفأر مع بنتوباربيتال الصوديوم (60 ملغ / كلغ) عن طريق داخل الصفاق (IP) حقن. نصيحة: تمييع بنتوباربيتال إلى 10 ملغ / مل في ملحي معقم قبل الحقن يقلل من احتمال جرعة زائدة.
- التخدير التنازلات تنظيم درجة الحرارة، وبالتالي الحفاظ على الماوس الحارة فورا بعد الحقن الأولى من بنتوباربيتال. باستخدام الناقل المعدنية (التهوية سلة الألومنيوم) في أعلى لوحة التدفئة (معايرتها إلى ~ 37 ° C) يعمل بشكل جيد للحفاظ على درجة حرارة الماوس مستقرة. بدلا من ذلك، استخدام مصباح الحرارة، مع الحرص على وضعه على مسافة مناسبة من الماوس. رصد الماوس كل 5-10 دقائق حتى يتم تحقيق المستوى المناسب من التخدير (عدم الانسحاب إلى أخمص القدمين أو قرصة الذيل). جرعة تكميلية قد تكون هناك حاجة بعد 15-20 دقيقة. فمن الأفضل للمضي قدما ببطء وبحذر لتجنب جرعة زائدة، وخاصة مع السمنة المفرطة، العمر، أو حيوانق شدد على خلاف ذلك.
- إزالة الشعر من الجانب البطني عن طريق الحلاقة بعناية مع كليبرز شعر الحيوانات الأليفة الصغيرة. وينبغي اتخاذ عناية خاصة لتجنب الصدمات للحيوان. فإنه من المفيد لإزالة كل الشعر من منطقة الإبطين تمتد إلى منطقة العانة. إزالة أي شعر التشبث فضفاضة مع مسحة الكحول النقي.
- ضع الماوس على ظهرها، والكذب مع كل من الصدارة وأطرافه هند انتشرت لفضح أكبر قدر من جدار البطن ممكن. إذا لزم الأمر، استخدم الشريط المختبر لتأمين الساقين بطريقة شوفيني.
3. عزل الشريان متفوقة شرسوفي
- إجراء شق صغير من خلال الجلد فقط فوق منطقة من منطقة العانة. فقط تأكد من أن الجلد يتم قطع مع تجنب الضرر لعضلة البطن الأساسية؛ تمديد شق أفقيا في كل اتجاه إلى hindlimbs منها. مواصلة شق rostrally على طول خط الوسط بطني إلى أعلى القفص الصدري ون تمديد شق أفقيا في كل اتجاه لالأمامية منها.
- رفع بلطف الجلد واستخدام مقص لقطع النسيج الضام القابضة للجلد لعضلة الأساسية، وبالتالي تعريض كامل سطح عضلات البطن (انظر الشكل 3A). ري العضلات يتعرض مع درجة حرارة الغرفة 0.9٪ محلول ملحي.
- نظرا لصغر حجم SEA، ضع تحتها الحيوان stereomicroscope لمزيد من الإجراءات. رفع لوحة الدهون التي تقع في الجزء السفلي من عظمة القص مع ملقط، وإجراء شق خلال ذلك. مواصلة شق على طول الضلع السفلي، والتأكد من عدم قطع عميق جدا في النسيج الأساسي. يجب أن يكون SEA مرئية؛ الحرص على تجنب الإضرار بها. مرة واحدة شق كاملة، لري الأنسجة المكشوفة مع درجة حرارة الغرفة 0.9٪ محلول ملحي.
- بعد أن تم سحب الطبقة العليا من الهيكل العظمي والعضلات، ويتم تحديد البحار والعضلات الأساسية بسهولة. نصيحة: لاحظ طولالبحر في الجسم الحي قبل عزل لتمديد أنابيب البطانية (التي تقصر على طول محور سفرهم لدى والعزلة) لتقريب طولها الأصلي. باستخدام ملقط ومقص، واستئصال بعناية طبقة رقيقة العضلات تحت البحر.
- باستخدام ملقط الزاوية، تمرير طول 6-0 خياطة الحرير تحت البحر وligate الشريان والوريد المجاورة لها للحفاظ على ضغط الدم والاحتفاظ داخل التجويف السفينة لتسهيل التصور خلال العزلة اللاحقة والتنظيف.
- كرر الإجراء ربط البحر على الجانب المقابل.
- مرة واحدة تم ligated كل من البحار وإجراء شق على طول خط الوسط من عضلات البطن لفصل الجانبين منها.
- تمديد شق أفقيا في كل اتجاه كما فعلت للبشرة، ثم يواصل شق عموديا على طول الحافة الخارجية لفصل تماما عضلة البطن من الجسم. تجنب الأضرار التي لحقت الأوعية الدموية التي تغذيها SEA للحفاظ على ضغط التجويف.
- Cحزب التحرير في SEA فوق ربط للحفاظ على الختم، ووضع العضلات المعزولة والشريان في دورق 50 مل تحتوي على 10 مل من 4 ° C العازلة تشريح.
- كرر الإجراء بالنسبة للجانب الآخر من البطن واحتضان الأنسجة في المخزن المؤقت تشريح لمدة 10 دقيقة.
- وضع عضلات البطن الذي يحتوي على SEA في المبرد (4 ° C) غرفة التشريح تحتوي على تشريح العازلة (انظر الشكل 3B). تتكون غرفة تشريح طبق بتري بطبقة من Sylgard (polydimethylsiloxane [PDMS]) في الجزء السفلي.
- باستخدام دبابيس الحشرات (0.15 ملم)، وتمتد من البحر معزولة وعضلات البطن إلى تقارب في الجسم الحي أطوال (المشار إليها أعلاه) وثبته على Sylgard. نصيحة: توجيه العضلات بحيث تواجه طبقة رقيقة الصفاق هو على رأس يجعل SEA مرئية بسهولة باستخدام تضوء.
- استخدام أدوات تسليخ مجهري غرامة والعمل من موقع المنبع من ربط نحونهاية المصب، امسح SEA من الوريد تقرن والأنسجة المحيطة بها حتى أول موقع فرع رئيسي (1-2 سم). ثم استئصال SEA بقطع عليه فقط فوق موقع فرع وأقل بقليل من ربط.
- لإزالة الدم الاحتفاظ داخل التجويف السفينة، يقني؛ يدخل القنية البحر ومسح هذا مع العازلة تشريح الجليد الباردة. باستخدام قطعة من أنابيب silastic، ونعلق نهاية الجزء الخلفي من ماصة القسطرة لحقنة 5 مل تحتوي على الجليد الباردة العازلة تشريح وتأمين micropipette في مياداة مجهرية لوضع طرفها داخل غرفة تشريح ليقني؛ يدخل القنية البحر.
- مرة واحدة يتم مسح جميع الكريات الحمراء للخروج، وإزالة SEA من ماصة القسطرة، ورفع ماصة للخروج من طبق تشريح.
- قطع SEA إلى قطاعات أصغر كل 1-3 ملم في الطول. هذه القطاعات أقصر تسهيل عزل أنابيب البطانية.
4. عزل أنابيب غشائي
- ملء عبادة 12 مم × 75 مم الزجاجأنبوب لدى عودتهم في منتصف الطريق مع الثلج الباردة العازلة تشريح. باستخدام ملقط الزاوية، ونقل القطع الشرايين في أنبوب الثقافة ووضع على الجليد. في هذا الوقت، والجمع بين الإنزيمات الهضم مع العازلة التفكك إلى الحجم النهائي من 1 مل في منفصلة 12 ملم × 75 ملم أنبوب الثقافة (انظر 1.3.2 حلول) وسخن الحل إلى 37 درجة مئوية مع كتلة التدفئة.
- في حين أن تفارق العازلة والانزيمات والاحماء، ونضح بعناية المخزن المؤقت تشريح من أنبوب الثقافة ترك صغيرة الحجم تحتوي على شرائح السفينة.
- بلطف إضافة درجة حرارة الغرفة العازلة تفارق دون الانزيمات ليغسل ما تبقى العازلة تشريح. تلميح: إضافة تفارق العازلة مثل ببطء أن القطع الشرايين تبقى على الجزء السفلي من أنبوب الثقافة لتوفير الوقت والانتظار بالنسبة لهم لإعادة توطينهم. رفع درجات الحرارة عازلة على خطوات متعددة من الجليد (4 ° C)، إلى درجة حرارة الغرفة (~ 24 درجة مئوية)، إلى 37 درجة مئوية لتقليل الصدمة.
- نضح بعناية dissocينتقم العازلة من أنبوب الثقافة، ومرة أخرى ويجري التأكد من ترك صغيرة الحجم تحتوي على شرائح السفينة.
- إزالة العازلة تفارق التسخين مع الانزيمات من كتلة التدفئة، ونقل 1 مل من محلول أنزيم إلى أنبوب الثقافة التي تحتوي على قطاعات السفينة، ووضع أنبوب الثقافة مرة أخرى في كتلة التدفئة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- أثناء الحضانة مع الانزيمات، وإعداد ماصة سحن، الردم مع الزيوت المعدنية وثبته على محقنة مكروية التي شنت في مياداة مجهرية. ثم سحب الغواص محقنة مكروية لملء ماصة مع 2 NL من العازلة تفارق وموقف الطرف ماصة على الحجرة التدفق.
- في نهاية الحضانة 30 دقيقة، وإزالة أنبوب الثقافة من كتلة التدفئة وبعناية نضح المخزن المؤقت على النحو الوارد أعلاه.
- تغسل شرائح الشرياني مع 4 مل من درجة حرارة الغرفة العازلة تفارق. ملاحظة: إنه لم يعد ضروريا للحفاظ على SEGM السفينةالوالدان في الجزء السفلي من الأنبوب الثقافة؛ تعكير قطع الشرايين يساعد فعلا لضمان أن تتم إزالة الأنزيمات المتبقية على نحو فعال.
- نقل شريحة سفينة واحدة إلى غرفة التدفق بواسطة الشفط برفق مع micropipette 1 مل، ووضعه في غرفة التدفق مع 1 مل من العازلة تفارق.
- الاستفادة من مياداة مجهرية تحتوي على محقنة مكروية، ضع غيض من ماصة سحن بالقرب من واحدة من نهاية الجزء السفينة.
- نضح الجزء السفينة (500 NL سحب) في ماصة الطحن ببطء (225 NL / ثانية)، حتى لا يسبب إجهاد ميكانيكي إلى ECS، ثم إخراج مرة أخرى في الغرفة. إذا كانت عملية الهضم ناجحة، سيتم فصل خلايا العضلات الملساء والبرانية من أنبوب البطانية.
- تكرار سحن حتى يتم فصلها عن خلايا العضلات الملساء. تكون على علم بأن سحن المفرط (4x أو أكثر) يمكن أن تلحق الضرر ECS وجعلها تستجيب للمنبهات. نصيحة:باستخدام ماصة سحن، حرك البرانية بعيدا عن أنبوب البطانية في أقرب وقت ممكن لمنعها من المشركة الأنبوب. ملاحظة: استخدام ماصة سحن، وأنبوب البطانية المعزولة يمكن أن يستنشق ونقل إلى غرفة منفصلة.
- وضع أنبوب البطانية في وسط غرفة التدفق، الانحياز على طول اتجاه التدفق، وإزالة ماصة الطحن.
- ماصات تعلق آمن في micromanipulators التي شنت على طرفي غرفة التدفق، ووضع النصائح الخاصة بهم في نهايات كل من أنبوب البطانية.
- خفض ماصة تعلق على واحدة من نهاية الأنبوب للضغط عليها ضد السفلي من الغرفة. ضع ماصة تعلق الثاني بنفس الطريقة في الطرف الآخر من الأنبوب. ملاحظة: الموضع من الماصات تعلق هي مفاضلة بين تأمين أنبوب (يضعهم أبعد من نهاية الأنبوب) والسماح لمزيد من التصوير / منطقة تجريبية (وضعها أقرب إلى نهاية الأنبوب). تحديد مكان رتنحنح ~ 50 ميكرون من كل طرف من طرفي الأنبوب يعمل بشكل جيد. تماما كما ماصة تعلق تلامس أنبوب، تتراجع ببطء على طول محور الأنبوب، وبالتالي امتداده لتقريب الجسم الحي في طول، ثم اضغط على ماصة ضد أسفل الغرفة لتأمين أنبوب.
- بدء تدفق حل superfusion، والسماح للأنبوب البطانية للراحة لمدة 20 دقيقة على الأقل لكي تتوازن والالتزام (انظر الشكل 3C). استخدام مضخة تحوي على الحفاظ على تدفق السوائل المستمر (superfusion) عبر أنبوب البطانية. ملاحظة: يمكن إزالة ماصات التدبيس مرة واحدة التزمت أنبوب البطانية إلى أسفل غرفة التدفق (~ 25 دقيقة) أو تركت في المكان لضمان ألا يصبح الأنبوب البطانية فكها.
5. صبغ التحميل والتصوير الكالسيوم
- لتصور ردود الكالسيوم داخل الخلايا، تحميل أنبوب البطانية مع FLUO-04:00 الصبغة في درجة حرارة الغرفة (~ 24 درجة مئوية). وقف تدفق السوائل في الحمام، وإضافة FLUO-4صباحا إلى غرفة في تركيز النهائي من 10 ميكرومتر. الانتظار 10 دقيقة للسماح للصبغة لدخول الخلايا، ثم superfuse أنبوب البطانية مع PSS الطازجة لمدة 20 دقيقة للتأكد من إزالة الصبغة خارج الخلية وبين الخلايا التي تم صبغ بالكامل تجمعت دي.
- أداء التصوير الكالسيوم. لهذا العمل، المجهر تستقيم (انظر الشكل 2) تم استخدامه مجهزة بنظام التصوير متحد البؤر القرص الغزل في درجة حرارة الغرفة المحيطة. تثير صبغة الفلورسنت الكالسيوم مع ليزر 491 نانومتر، والحصول على صور (في الانبعاثات 500-550 نانومتر) باستخدام كاميرا رقمية المكثف.
Representative Results
ويمكن البدء الردود الكالسيوم في أنابيب معزولة البطانية حديثا باستخدام أستيل (ACH). في هذا الفيلم، يتم تحفيز أنبوب البطانية محملة 10 ميكرومتر FLUO-4 صباحا مع superfusion من 1 ميكرومتر أدن تشافيز (فيلم 1). اضغط هنا لمشاهدة الفيلم . هو متحمس الصبغة في 491 نانومتر، ويتم تسجيل الانبعاثات 500-550 نانومتر باستخدام كاميرا الجهاز المسؤول عن جانب تكثيف. يتم الحصول على مداخن صورة في 120 لقطة / ثانية لفترة ثانية 25 ويمكن بعد ذلك بلغ متوسط (على سبيل المثال إلى 40 لقطة / ثانية). وتظهر الصور مضان ممثل على مر الزمن في الشكل 4.
الشكل 1. تدفق غرفة والماصات المستخدمة خلال عزل أنابيب البطانية. نانوغرام> A) وغرفة تدفق تجميعها مع 24 مم × 50 مم الزجاج ساترة كقاعدة. ب) أمثلة لسحبها (إلى اليسار) وسحب، مكسورة، مصقول والزاوية (يمين) القسطرة ماصة. ويستخدم هذا ماصة لطرد الكريات الحمراء من تجويف الشريان التالية تشريح. مقياس شريط = 200 ميكرون. C) أمثلة من سحبت (يسار) وانسحبت، وكسر ومصقول (يمين) سحن ماصة. يتم تحديد القطر الداخلي للماصة قبل هذا القطر الخارجي للشريان. شريط النطاق = 200 ميكرومتر. D) أمثلة من سحبها (إلى اليسار) وسحب، وكسر ومصقول (ماصة اليمين) تعلق. يتم تقريب هذا غيض من ماصة قبالة ومختومة لتأمين أنبوب البطانية في غرفة التدفق تماما. مقياس شريط = 200 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 2. الغزل القرص المجهر متحد البؤر التصوير من كا 2 + إشارات. A) المجهر تستقيم تستخدم للتصوير الكالسيوم. ب) (أ) وحدة القرص الغزل متحد البؤر مع (ب) تكثيف تهمة الكاميرا إلى جانب جهاز. C) أهداف الغمر (أ) 63X ( NA = 1) و (ب) 20X (NA = 0.5) المستخدمة في التصوير. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. عزل عضلات البطن والشريان الشرسوفي متفوقة. A رونغ>) تخدير الفأر مع عضلات البطن المكشوفة والمروية مع درجة حرارة الغرفة 0.9٪ محلول ملحي. السهام الحمراء بمناسبة مواقع تحت منصات الدهون التي التقييمات البيئية منها إدخال كل المستقيمة البطنية العضلات (أي حيث ينبغي ligated السفن). مقياس بار = 1 سم. ب) العضلات المعزولة في البطن (من جانب واحد) وSEA معلقة في غرفة تشريح لتسليخ مجهري. السهم الأحمر يشير إلى أول موقع التشعب الرئيسية للSEA (أي النقطة التي توقفت تنظيف السفينة). مقياس بار = 1 سم. C) معزولة أنبوب الخلية البطانية من البحر. الفرق تدخل تباين الصورة من أنبوب البطانية التالية 1 ساعة حضانة في درجة حرارة الغرفة. تم superfused أنبوب البطانية مع العازلة Superfusion في 3 مل / دقيقة. مقياس بار = 50 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
ether.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 4. مضان الكالسيوم في أنبوب الخلايا البطانية. الصور الفلورسنت ممثل أنبوب البطانية ردا على التحفيز مع 1 ميكرومتر أستيل. A) الإسفار قبل التحفيز. B) البطانية أنبوب مضان في وقت الإدارة أستيل كولين، ر = 0 ثانية. C) أنبوب البطانية مضان في ر = 5 ثانية. D) أنبوب البطانية مضان في ر = 10 ثانية. E) البطانية مضان أنبوب في ر = 15 ثانية. F) البطانية مضان أنبوب في ر = 20 ثانية. أشرطة النطاق = 40 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Discussion
نحن هنا وصف عزلة أنابيب البطانية من البحر واستخدام هذا المستحضر لتصور كا 2 + اشارة الأحداث داخل ECS التأسيسي. وقد تم تكييف هذا الإجراء من واحد وضعت أصلا لعزل أنابيب البطانية من الشرايين من العضلات المشمرة الهامستر 8. الاستفادة اختلافات طفيفة من التقنيات المقدمة هنا، ونحن عزلت أنابيب البطانية من مجموعة متنوعة من أسرة الأوعية الدموية، بما في ذلك: الشرايين تغذية عضلة الهامستر ضام والخد الشرايين الحقيبة 10، والماوس الشريان شرسوفي 6،7،9، المساريقي الماوس والدماغية (؛ وترد إشارات لعزل الأوعية المساريقي 12 والأوعية الدماغية 13 الملاحظات غير منشورة) الشرايين وmicrovessels اللمفاوي. عزل أنابيب البطانية من أسرة الأوعية الدموية الجديدة قد تتطلب تعديلات على البروتوكول الأصلي. إذا العزلة غير ناجحة، فمن الأفضل أن تبدأ من خلال تغيير أوقات الهضم:زيادة الوقت الهضم إذا أنابيب البطانية يصعب عزل من خلايا العضلات الملساء والبرانية وتقليل الوقت الهضم إذا لا يبقى أنبوب البطانية سليمة. إذا تغيير أوقات الهضم غير ناجحة، وضبط تركيز أنزيمات الهضم أو درجة الحرارة الهضم يجب أن يحاكم. خيار آخر هو للحد من القطر الداخلي للماصة سحن، مما يزيد من قوة القص في إزالة خلايا العضلات الملساء. زيادة سرعة قذف السائل يمكن أيضا أن يحاكم لنفس الغرض، لكن من المرجح أن تضر التحضير. وينبغي الاعتراف بأن ذلك قد لا يكون من الممكن عزل أنابيب البطانية سليمة من السفن في الخلايا البطانية التي لا ترتبط مع بعضها البعض بشكل جيد من البروتينات وصلي.
تم إجراء تفكك خلايا العضلات الملساء التالية الهضم الأنزيمي في البداية باستخدام pipettor على غرار اليد 8. لقد المكرر الإجراء سحن باستخدام microsyrنظام إنجي، مما أتاح العزلة ثابت من أنابيب البطانية أطول (تصل إلى 3 ملم) 6. عند استخدام هذا النظام، يتم ردم ماصة سحن مع الزيوت المعدنية لتوفير عمود السائل المستمر بين المكبس السيطرة على حركة السوائل وجهاز الأمن الوقائي الذي يحتوي على شريحة السفينة. يتم فرض incompressibility السائل جنبا إلى جنب مع القوة الدافعة المستمرة لنتائج المكبس محقنة مكروية في القص المستمر كما السفينة من خلال طرف ماصة. في المقابل، تقنيات اليد غالبا ما تستخدم لخلايا الانفصال (مثل الضغط لمبة المطاط في نهاية ماصة باستور) ينطوي على ضغط الهواء، الذي يدخل التغير في الضغط القيادة، وبالتالي تمارس القص في الطرف ماصة.
هناك مزايا متعددة لإعداد أنبوب لدراسة وظيفة بطانة الأوعية الدموية في microvessels. الأول هو أن عملية العزل يوفر السكان الأصليين متميزة متجانسة الخلوية من ECS ومو سلسالخلايا بعد المقطع. منذ ECS البقاء على اتصال جسديا وأنابيب، فهي متميزة من خلايا العضلات الملساء الفردية، التي تحتفظ تكوين "C" إذا كانت لا تزال خففت خلال سحن. وتتميز أنواع الخلايا المعنية بذلك بسهولة، على سبيل المثال عند الحصول على عينات لالتقنيات الجزيئية مثل الوقت الحقيقي PCR والمناعية 10. منذ يتم عزل أنابيب متعددة من سفينة واحدة (أو من السفن الثنائية كما فعلت لSEA)، ويمكن الحصول على البيانات الجزيئية والبيانات الفنية من نفس السفن من حيوان معين. يمكن ربط التعبير الجزيئية وهكذا مع سلوك وظيفي من الاوعية الدموية الدقيقة البطانة. علاوة على ذلك، يشير كلا من الأحداث داخل وبين الخلايا الذاتية لالاوعية الدموية الدقيقة البطانة يمكن حلها مستقلة عن تأثير القوى الدورة الدموية (الضغط، التدفق)، وكلاء فعال في الأوعية نفذت في مجرى الدم (مثل الهرمونات)، أو من خلايا العضلات الملساء المحيطة بها (على سبيل المثال60؛ عبر اقتران myoendothelial 14-16)، والأعصاب 17، أو الأنسجة حمة 18.
الأهم من ذلك، منذ البطانة معزولة حديثا من microvessels المعينة، وليس هناك تغيير في النمط الظاهري الذي يرتبط إلا مع زراعة ECS 19-21. على سبيل المثال، ECS مثقف تفقد مستقبلات المسكارينية التعبير، وبالتالي تغيير ملامح إشارات الكالسيوم بهم. علاوة على ذلك، يمكن أن الخصائص الكهربية من ECS تغيير في الثقافة 22. لأن ECS الفردية تبقى جانب من خلال قنوات تقاطع الفجوة الوظيفية، ويعرض أنبوب البطانية نموذجا مثاليا لدراسة التوصيل من 2 + إشارات كهربائية والكالسيوم بين الخلايا 6،7. وينبغي أيضا الاعتراف بأن خلايا العضلات الملساء فصلها ودراستها بسهولة مع تقنيات التصحيح، المشبك عن البيانات التكميلية الكامنة وراء وظيفة الاوعية الدموية الدقيقة 23.
وجود قيود مفتاح أنبوب البطانية ممركز Odel هو عدم الاستقرار في التحضير مع زيادة درجة الحرارة. في حين أثبتت تحضيراتنا من SEA مستقرة وصحية في درجة حرارة الغرفة المحيطة (~ 24 درجة مئوية) ولعدة ساعات في 32 درجة مئوية، وتدهور المورفولوجية والوظيفية تحدث في أقل من ساعة عند 37 درجة مئوية 9. وجود قيود الثاني المهم من الأنبوب البطانية هو فقدان تقاطعات myoendothelial والمجالات الإشارات الكامنة التي هي جزء لا يتجزأ من وظيفة المفوضية الأوروبية في جدار الوعاء الدموي سليمة 14-16. وينبغي أيضا الاعتراف بأن، في حين تمكن أنابيب أطول إشارات بين الخلايا لدراستها عبر مسافات كبيرة نسبيا 6، معقد إعداد أنابيب لأنها تحصل على أطول لأنه يصبح من الصعب فصل كامل المحيطة خلايا العضلات الملساء والبرانية. لقد وجدنا أن أنابيب أطول من 1-2 ملم هي أيضا أكثر صعوبة لوضع وتأمين في غرفة التدفق. في المقابل، في حين أنابيب أقصر (على سبيل المثال <1 مم) ENAبلي كا 2 + والكهربائية إشارات لدراستها 8، فهي صعبة للحفاظ خلال superfusion في غرفة التدفق. أخيرا، حتى مع العزلة الأمثل للأنابيب على المستوى الثنائي، هناك مواد كافية لتقدير التقليدية للتعبير البروتين باستخدام البقع الغربية، على الرغم من immunolabeling يوفر مؤشر التعبير البروتين والتعريب. على الرغم من هذه القيود، وأنبوب البطانية يمثل إعداد رواية لتقديم رؤية جديدة في آليات الاوعية الدموية الدقيقة وظيفة الخلايا البطانية في الجسم الحي.
Disclosures
لا شيء.
Acknowledgments
المؤلفين أشكر الدكتور Pooneh باقر والدكتور اريكا يستكوت للتعليقات افتتاحية في إعداد المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم المعهد من المعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام جائزة R37-R01-HL041026 وHL086483 لنظام الضمان الاجتماعي وF32-HL107050 لMJS. هذا المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
| Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
| Papain | Sigma | P-4762 | |
| Collagenase | Sigma | C-8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
| Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
| Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
| Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
| Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| 12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| 3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
| Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| 100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| 1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
| Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
| XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
| Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res. 78, 415-423 (1996).
- Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists. Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).
- Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).
- Busse, R., et al. EDHF: bringing the concepts together. Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).
- Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium. J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, 757-770 (2012).
- Cohen, K. D., Jackson, W. F. Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells. Microcirculation. 12, 169-182 (2005).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).
- Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries. Microcirculation. 15, 503-514 (1908).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).
- Bagher, P., et al. Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).
- Faraci, F. M., et al. Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).
- Emerson, G. G., Segal, S. S. Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ. Res. 87, 474-479 (2000).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).
- Tran, C. H., et al. Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).
- Nausch, L. W., et al. Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).
- Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction. J Physiol. 555, 459-469 (2004).
- Colden-Stanfield, M., et al. Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 61, 632-640 (1987).
- Brunner, F., Kukovetz, W. R. Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).
- Tracey, W. R., Peach, M. J. Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 70, 234-240 (1992).
- Adams, D. J., Hill, M. A. Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).
- Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles. Microcirculation. 4, 35-50 (1997).
