Summary
Vi præsenterer en forberedelse til at visualisere og manipulere calcium signalering i native, intakt mikrovaskulære endotel. Endoteliale rør frisk isoleret fra mus modstand arterier forsyner skeletmuskulaturen beholde in vivo morfologi og dynamisk signalering inden for og mellem de omkringliggende celler. Endoteliale rør kan fremstilles ud fra mikrokar i andre væv og organer.
Abstract
Styringen af blodgennemstrømning af modstanden vaskulaturen regulerer tilførslen af ilt og næringsstoffer samtidig med fjernelsen af metaboliske biprodukter, som eksemplificeret ved at udøve skeletmuskulatur. Endotelceller (EC'er) linje intima alle modstandskar og tjene en vigtig rolle i kontrollen diameter (fx endotel-afhængige vasodilatation) og dermed omfanget og fordelingen af væv blodgennemstrømning. Reguleringen af vaskulær resistens ved EC'er sker ved intracellulær Ca 2 +-signalering, der fører til produktion af diffunderbare autacoider (f.eks nitrogenoxid og arachidonsyremetabolitter) 1-3 og hyperpolarisering 4,5 at fremkalde glatte muskelceller afslapning. Således at forstå dynamikken i endotel Ca 2 + signalering er et vigtigt skridt i retning af at forstå mekanismer, der regulerer blodgennemstrømningen kontrol. Isolerende endotel rør eliminerer forstyrrende variabler forbundet med blood i karhulrummet og med omgivende glatte muskelceller og perivaskulære nerver, som ellers påvirker EF struktur og funktion. Her præsenterer vi isolering af endotel rør fra den overlegne epigastric arterie (SEA) ved hjælp af en protokol optimeret til dette fartøj.
For at isolere endotel rør fra en bedøvet mus, er SMV ligeret in situ at bevare blod i karhulrummet (for at lette visualisere det under dissektion), og hele ark mavemuskel udskæres. Havet er dissekeres fri fra omgivende skelet muskelfibre og bindevæv, er blod skylles ud af lumen, og mild enzymatisk fordøjelse er udført for at muliggøre fjernelse af adventitia, nerver og glatte muskelceller ved hjælp af blid findeling. Disse frisk isolerede præparater af intakt endotel bevarer deres oprindelige morfologi, med individuel ECs resterende funktionelt koblet til hinanden, i stand til at overføre kemisk og elektrisk signals intercellulært gennem gap junctions 6,7. Ud over at give ny indsigt i calcium signalering og membran biofysik, disse forberedelser aktivere molekylære studier af genekspression og protein lokalisering inden indfødte mikrovaskulære endotel.
Introduction
I denne protokol, beskriver vi isoleringen af endotelceller rør fra musen SEA. SEA opstår fra den interne thorax arterie og forsyninger iltet blod til den forreste mavemuskulaturen. Vores arbejde med havet som en model kan henføres til det at give relativt lange, uforgrenede mikrokardannelse segmenter, der er velegnede til at studere signalering begivenheder underliggende rolle endotel i styrende og koordinerende glatmuskelcelle afslapning. For dem interesseret i andre end skeletmuskulatur væv, har vi fundet denne teknik til at være let tilpasses for at opnå endoteliale rør fra mikrokar af hjerne, tarm og lymfesystemet.
De vigtigste elementer i denne metode er, at intakte længder (1-3 mm) af mikrovaskulære endotel er isolerede, sikret mod et dækglas i et flow kammer, hvor de er superfusioneret med PSS, og filmede for Ca 2 + signalering 7-9 ellerspiddet til elektrisk signalering 6,8. Inden strømningskammeret, er den øvre halvdel af et rør er udsat for superfusionsapparatet opløsningen og reagerer på eksperimentelle indgreb, mens den nederste halvdel (i kontakt med dækglas) er beskyttet og forbliver hvilende. Ud over at studere både intra-og intercellulære Ca2 + signaling begivenheder kan endotelceller rør anvendes til kvantitativ real-time PCR for at vurdere genekspression 6,10, immunhistokemi til at undersøge protein-ekspression 6,10 og elektrofysiologiske studier for at definere biofysiske egenskaber af elektrisk ledning 6,11.
Der er flere fordele ved at præparatet endotel røret for at studere endotelfunktion. Første er, at isolation proces giver en enkel skelnen mellem to cellepopulationer: endothelceller (som forbliver i rør dannelse) og glatte muskelceller (individuelt dissocieret, typisk "C" formet nårafslappet). Dette giver mulighed for selektiv prøvetagning og undersøgelse af unikke egenskaber, der ligger til grund respektive celler bidrag til fartøjets funktion. For det andet er denne model muliggør løsningen af signalering begivenheder iboende til endotelet, uafhængig af indflydelse af blodstrømmen, der omgiver den glatte muskulatur, nerver, og parenkym. For det tredje er endotel undersøgte mens frisk isolerede, hvorved man undgår ændringer i gen-eller protein-ekspression er forbundet med cellekultur.
Protocol
1.. Forberedelse af udstyr: strømningskammer, pipetter og løsninger
- Flow kammer: Brug et flow kammer med en 24 mm x 50 mm dækglas på bunden at superfuse de isolerede endotel rør (se figur 1A). Før montering af kammeret, vaske dækglas med både 3% HCI og 70% ethanol, skyl med ultrarent vand, og tør med nitrogen gas.
- Pipetter: Tre forskellige typer af pipetter anvendes under protokollen: kanylering, findeling og pinning. Både kannulation og pinning pipetter kan foretages før dagen for forsøget, men trituration pipette bør gøres den dag, da det kræver kendskab til diameteren af fartøjet til størrelse lumen korrekt.
- Kanylerings pipetter: For at skylle røde blodlegemer fra lumen, træk borosilikatglas kapillarrør ved hjælp af en mikropipette aftrækker til at have lange, tilspidsede ender. Bryd enderne med pincet til en ydre diameter ~ 30% less end arterierne (~ 50-80 um), og brand polish spidsen for at være glat (se figur 1B). Det er nyttigt at også vinkel spidserne af pipetterne til ca 45 °.
- Triturering pipetter: At mekanisk kobler de glatte muskelceller og adventitia fra endotel rør gør triturering pipetter fra borosilikatglas kapillarrør. Forbered kapillærrør som ovenfor, og bryde enden med en pincet. Tip: Brug et glas ridseindretningen at gøre det lettere at bryde den tykkere væg af triturering pipette glas rent. Break pipetten indre diameter bestemmes på dagen for eksperimentet, omtrent 10-20 um større end den ydre diameter af det fartøj, som endotelceller rør vil blive isoleret. Fire polish de knækkede ender indtil glat (se figur 1C).
- Pinning pipetter: For at stabilisere endotel rør inden strømningskammeret, gør pinning pipetter til at sikre endotel tUbe mod dækglasset bunden af kammeret. Træk glas kapillarrør på samme måde som kanylering pipetter. Så bryde enderne med pincet til en diameter på ~ 100 um og brand polish til spidserne er forseglet, afrundet og glat (se figur 1D). Bemærk: Hvis spidsen af pinning pipetten ikke er helt lukket, vil væske komme ind i hulrummet og kan forvirre eksperimentelle resultater.
- Løsninger: Forberede alle løsninger i ultrarent (18,2 MOhm) H 2 O og sterilisere dem gennem et 0,2 um filter. Sørg for, osmolalitet af løsningerne er mellem 285-300 mOsm. Løsninger forbliver godt for cirka to uger, når de opbevares ved 4 ° C.
- Dissektion opløsning: Saltopløsningen anvendes under dissektion af den overlegne epigastriske arterie er sammensat af (i mmol / l): 137 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl2, 10 N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsyre ( HEPES), 10 glucose, 0.01 natriumnitroprussid (SNP), end 0,1% bovint serumalbumin (BSA) med en pH-værdi på 7,4. NO donor SNP er medtaget for at hjælpe slappe af glatte muskelceller, hvilket gør dem lettere at cannulate arterien og lette glatte muskelceller fjernelse under findeling.
- Dissociation opløsning: Saltopløsningen anvendes under dissociation af endotel røret er sammensat af (i mmol / l): 137 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose, 2 CaCl2, og 0,1% BSA, med en pH-værdi på 7,4. Til en 1 ml portion af denne buffer, tilsættes: 0,62 mg / ml papain, 1,5 mg / ml collagenase og 1,0 mg / ml dithioerythritol. Eftersom enzymer fra forskellige leverandører kan have varierende niveauer af enzymatisk aktivitet, er produktnumre af dem, der anvendes til dette arbejde medtaget som reference i tabellen af materialer. Bemærk: Under protokol bruges både dissociation buffer og dissociation buffer med enzymer på forskellige trin.
- Superfusionssystem løsning: Den fysiologisk saltopløsning (PSS), der anvendes til superfusing isolerede endotel rør er sammensat af (i mmol / l): 137 NaCl, 5 KCI, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose og 2 CaCl2, med en pH på 7,4.
- Forbered buffere og løsninger, før du begynder kirurgiske procedurer. Fjern løsninger fra 4 ° C og alikvot 50 ml Dissektion buffer ind i en 200 ml Erlenmeyer-kolbe og placere den på is. Derudover alikvote 50 ml Dissociation buffer uden enzymer og placere den på bænken top afbalancere til stuetemperatur. Fjern superfusionsapparatet løsning fra 4 ° C, og lad den tempereres til stuetemperatur på bænken toppen.
2. Animal Forberedelse
Sørg for at alle procedurer og protokoller, der involverer dyr er i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. De her beskrevne procedurer blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg UniversitetMissouri.
- Brug mandlige eller kvindelige mus mindst 9 uger gammel og studere hver individuelt. Bedøver en mus med natriumpentobarbital (60 mg / kg) via intraperitoneal (ip) injektion. Tip: Fortynding af pentobarbital til 10 mg / ml i sterilt saltvand før injektion reducerer muligheden for overdosis.
- Anæstesi kompromitterer temperatur regulering, så holder musen varme umiddelbart efter den første injektion af pentobarbital. Ved hjælp af en metal-bærer (ventileret aluminiumskurv) oven på en varmeplade (kalibreret til ~ 37 ° C) fungerer godt for at holde temperaturen af musen stabil. Alternativt kan du bruge en varmelampe, der tager sig at placere den i en passende afstand fra musen. Overvåg musen hver 5-10 min, indtil det ønskede niveau af anæstesi er opnået (manglende tilbagetrækning til tå eller hale knivspids). En supplerende dosis kan være nødvendig efter 15-20 min. Det er bedst at gå langsomt og med forsigtighed for at undgå overdosering, især overvægtige, alderen, eller dyrr ellers understreget.
- Fjern hår fra den ventrale side ved forsigtigt at barbere det med små kæledyr hårklippere. Der bør udvises særlig opmærksomhed for at undgå traumer til dyret. Det er nyttigt at fjerne alle hår fra et område, der spænder over armhulerne til pubesområde. Fjern eventuelle løst klamrer hår med en frisk spritserviet.
- Anbring musen på ryggen, liggende med både for-og bagbenene spredt ud til at udsætte så meget af den abdominale væg som muligt. Brug om nødvendigt laboratorium tape til at fastgøre benene i et spread-ørn måde.
3. Isolering af Superior Epigastriske Artery
- Lave et lille snit gennem huden lige over det område, pubic region. Sørg for, at kun huden bliver skåret samtidig undgå skader på den underliggende mavemuskel, forlænge snittet sideværts i hver retning ud til de respektive bagben. Fortsæt snittet rostrally langs den ventrale midterlinjen til toppen af brystkassen ogn forlænge snittet sideværts i hver retning til respektive forlemmer.
- Løft forsigtigt huden og anvende en saks til at adskille bindevæv holder huden til den underliggende muskel og derved udsætte hele overfladen af den abdominale muskulatur (se figur 3A). Skyl den udsatte musklen med stuetemperatur 0,9% saltvandsopløsning.
- På grund af den lille størrelse af SEA placere dyret under et stereomikroskop for yderligere procedurer. Løft fedtpuden placeret i bunden af brystbenet med en pincet, og lave et snit gennem det. Fortsæt snittet langs bunden ribben, og sørg for ikke at skære for dybt ind i det underliggende væv. SEA skal være synlig, sørge for at undgå at beskadige den. Når snittet er udført, skylles eksponerede væv med stuetemperatur 0,9% saltvandsopløsning.
- Efter det øverste lag af skeletmuskulaturen er blevet trukket tilbage, er SMV og den underliggende muskel let identificeres. Tip: Bemærk længden afSEA in vivo før isolere at udvide endotel rør (som forkorter langs deres akse på isolation) at tilnærme deres oprindelige længde. Brug pincet og saks, omhyggeligt udskære tynde muskel lag nedenunder havet.
- Ved hjælp af vinklede pincet, passerer en længde på 6-0 silke sutur under SEA og ligere arterien og dens tilstødende vene for at holde det under tryk og blod tilbageholdes i karhulrummet at lette visualisering under den efterfølgende isolering og rengøring.
- Gentag SEA ligering proceduren på den kontralaterale side.
- Når begge SMV er blevet ligeret, lave et snit langs midterlinien af mavemusklerne til at adskille respektive sider.
- Forlæng snittet sideværts i hver retning som på huden, derefter fortsætte snittet lodret langs yderkanten til helt at adskille den mavemuskel fra kroppen. Undgå skader på vasculature fodret af havet for at opretholde de trykbærende lumen.
- Cut SEA over ligering til at opretholde tætningen og placere den isolerede muskler og arterie i et 50 ml bægerglas indeholdende 10 ml 4 ° C dissektion buffer.
- Gentag proceduren for den anden side af underlivet og inkuberes væv i dissektion buffer i 10 min.
- Placer mavemuskel indeholder havet i et afkølet (4 ° C) dissektion kammer indeholdende dissektion buffer (se figur 3B). Dissektion kammer består af en petriskål med et lag af Sylgard (polydimethylsiloxan [PDMS]) i bunden.
- Brug insekt stifter (0,15 mm), strække isolerede SEA og mavemuskel ud at tilnærme in vivo længder (anført ovenfor), og fastgør den til Sylgard. Tip: Orientering af musklen sådan at det tynde lag vender bughinden er på toppen gør SEA umiddelbart synlige ved hjælp af gennemlysning.
- Ved hjælp af fine mikrodissektions instrumenter og arbejder fra opstrøms stedet for ligatur modnedstrøms ende, rydde havet fra sin parrede vene og det omgivende væv, indtil den første store gren stedet (1-2 cm). Så udskære SEA ved at skære den lige over grenen stedet og lige under ligatur.
- For at fjerne blod tilbageholdes i karhulrummet, cannulate SEA og skyl det med iskold dissektion buffer. Ved hjælp af et stykke af silastic slanger, vedhæfte den bagerste ende af en kanyle pipette til en 5 ml sprøjte indeholdende iskold dissektion buffer og sikre mikropipette i en mikromanipulator at placere spidsen i dissektion kammeret cannulate SEA.
- Når alle erytrocytterne bliver skyllet ud, fjerne havet fra kanyle pipette og løft pipetten ud af dissektion fad.
- Skær SEA i mindre segmenter hver 1-3 mm i længden. Disse kortere segmenter lette isoleringen af endotheliale rør.
4.. Isolering af endotel Tube
- Fyld en 12 mm x 75 mm glas kulture rør halvvejs med iskold dissektion buffer. Ved hjælp af vinklede pincet, overføre arterielle stykker i kultur rør og placere på is. På dette tidspunkt, kombinere fordøjelsesenzymer med Dissociation buffer til et slutvolumen på 1 ml i en separat 12 mm x 75 mm dyrkningsrør (se 1.3.2 Solutions), og forvarme opløsningen til 37 ° C med en varmeblok.
- Mens dissociation buffer og enzymer varmer op, forsigtigt aspireres dissektion buffer fra kulturen rør efterlader et lille volumen, der indeholder skibssegmenter.
- Forsigtigt tilføje stuetemperatur dissociation buffer uden enzymer til at vaske væk resterende dissektion buffer. Tip: Tilsæt dissociation buffer langsomt sådan, at de arterielle stykker forblive på bunden af kulturen røret for at spare tid på at vente for dem at bosætte sig. Hæv buffer temperaturer over flere trin fra is (4 ° C), til stuetemperatur (~ 24 ° C), til 37 ° C for at minimere stød.
- Aspirer forsigtigt dissociation buffer fra kultur rør, igen og sørg for at efterlade en lille volumen, der indeholder skibssegmenter.
- Fjern forvarmning dissociation buffer med enzymer fra varmeblokken, overføre 1 ml enzymopløsning til kulturen rør indeholdende segmenterne fartøjets og placer kultur røret tilbage i varmeblokken. Inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
- Under inkubation med enzymer, forberede trituration pipette, opfyldning med mineralsk olie og fastgør den på en mikrosprøjte, der er monteret i en mikromanipulator. Derefter trække mikrosproejten stemplet for at fylde pipetten med 2 nl af dissociation buffer og placere pipettespidsen over flowet kammeret.
- Ved afslutningen af 30 min inkubation fjernes kultur røret fra varmeblokken og omhyggeligt aspireres puffer som ovenfor.
- Vask arterielle segmenter med 4 ml stuetemperatur dissociation buffer. Bemærk: Det er ikke længere nødvendigt at holde skibet segmenser i bunden af kulturen rør, forstyrre arterielle stykker faktisk bidrager til at sikre, at resterende enzymer effektivt fjernet.
- Overfør et fartøj segment til strømningskammeret ved forsigtigt at aspirere den med en 1 ml mikropipette, og læg det i strømningskammeret med 1 ml af dissociation buffer.
- Udnytte den mikromanipulator indeholder mikrosproejten placere spidsen af trituration pipetten nær den ene ende af fartøjet segment.
- Aspirer karsegment (500 nl tilbage) ind i den malende pipette langsomt (225 nl / sek), så for ikke at forårsage mekanisk belastning til ECS, og derefter skubbe den tilbage i kammeret. Hvis fordøjelsen var en succes, vil de glatte muskelceller og adventitia adskilles fra endotel røret.
- Gentag triturering indtil alle glatte muskelceller dissocieres. Vær opmærksom på, at overdreven trituration (4x eller mere) kan beskadige ECS og gøre dem reagerer på agonister. Tip:ved hjælp af triturering pipette flytte adventitia væk fra endotel røret så hurtigt som muligt for at holde det fra at sammenfiltre røret. Bemærk: Ved hjælp af findeling pipette, kan det isolerede endotel røret indsugning og overføres til et separat kammer.
- Placer endotel røret i midten af strømningskammeret, rettet ind langs strømningsretningen, og fjern triturering pipette.
- Sikker pinningcentre pipetter i mikromanipulatorer monteret ved hver ende af strømningskammeret og placere deres spidser ved respektive ender af endotel røret.
- Sænke en pinning pipette over den ene ende af røret for at trykke den mod bunden af kammeret. Anbring den anden pinning pipetten på samme måde i den modsatte ende af røret. Bemærk: Placering af pinningcentre pipetter er et trade-off mellem at sikre røret (placere dem længere væk fra enden af røret), og giver mulighed for mere billedbehandling / eksperimenterende område (placere dem tættere på enden af røret). Lokalisering them ~ 50 um fra hver ende af røret fungerer godt. Ligesom pinning pipetten rører røret langsomt trække den tilbage langs aksen af røret, og derved udvide det at tilnærme in vivo længde og tryk derefter på pipetten mod kammerbunden for at fastgøre røret.
- Begynd strømmen af superfusionsapparatet opløsning og tillade endotel røret til at hvile i mindst 20 minutter for at ækvilibrere og overholde (se figur 3C). Anvende en peristaltisk pumpe for at opretholde konstant fluidstrømning (superfusion) på tværs af endotel røret. Bemærk: Sætte pind pipetter kan fjernes, når endotel rør har levet op til bunden af strømmen kammer (~ 25 min) eller til venstre for at sikre endotel rør ikke løsne sig.
5.. Dye Loading og Calcium Imaging
- At visualisere intracellulære calcium reaktioner, indlæse endotel rør med fluo-04:00 farvestof ved stuetemperatur (~ 24 ° C). Stop væskestrømmen i badet, og tilføje fluo-4AM til kammeret ved en endelig koncentration på 10 uM. Vent 10 minutter for at tillade farvestoffet at trænge ind i cellerne, så superfuse endotel røret med frisk PSS i 20 minutter for at sikre ekstracellulære farvestof fjernes, og at intracellulær farvestof er fuldt deesterificeres.
- Udfør calcium billeddannelse. For dette arbejde, en opretstående mikroskop (se figur 2) udstyret med en roterende skive konfokal billeddannelse blev anvendt ved stuetemperatur. Excite det fluorescerende calcium farvestof med en 491 nm laser og hente billeder (ved 500-550 nm emission) ved hjælp af en intensiveret digitalkamera.
Representative Results
Calcium reaktioner kan igangsættes i frisk isolerede endotel rør anvender acetylcholin (ACH). I denne film, er en endotel rør fyldt med 10 pM fluo-04:00 stimuleret med superfusion på 1 uM ACh (Film 1). Klik her for at se film . Farvestoffet exciteres ved 491 nm og emission registreres 500-550 nm med en intensiveret charge-coupled device kamera. Billedstakke erhverves ved 120 billeder / sek for en 25 sek periode og kan derefter gennemsnit (f.eks til 40 billeder / sek). Repræsentative fluorescens billeder over tid er vist i figur 4.
Figur 1. Strømningskammeret og pipetter, der anvendes under isolering af endothelceller rør. A) strømningskammeret monteret med et 24 mm x 50 mm dækglas som base. B) Eksempler på et trukket (venstre) og en løftes, brudt, poleret og vinklet (højre) cannulation pipette. Denne pipette anvendes til at skylle erytrocytter fra lumen af arterien efter dissektion. Skala bar = 200 pm. C) Eksempler på et trukket (venstre) og en løftes, knuste og poleret (højre) trituration pipette. Den indvendige diameter af denne pipette bestemmes af den udvendige diameter af arterien. Skala bar = 200 um. D) Eksempler på et trukket (venstre) og en løftes, knuste og poleret (højre) pinning pipette. Spidsen af denne pipette er afrundet og helt forseglet for at sikre endotel røret i strømningskammeret. Skala bar = 200 mM. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Spinning disk konfokal mikroskop til billeddannelse af Ca 2 +-signaler. A) Upright mikroskop bruges til calcium billeddannelse. B) (a) Konfokal roterende skive enhed med (b), intensiveret ladningskoblet kamera. C) immersionsobjektiver (a) 63x ( NA = 1) og (b) 20X (NA = 0,5), der anvendes til billedbehandling. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Isolering af mavemuskel og overlegen epigastric arterie. A (dvs. hvor fartøjer bør ligeret). Skala bar = 1 cm. B) Isoleret mavemuskel (ensidig) og SEA besejrede i en dissektion kammer til mikrodissektion. Rød pil viser den første store tvedeling site af SEA (dvs. det punkt, hvor rengøring af skibet er stoppet). Skala bar = 1 cm. C) Isoleret endothelcelle rør fra en SEA. Differential interferens kontrast billede af en endotel rør efter 1 times inkubation ved stuetemperatur. Endotel rør blev overhældt med superfusionsapparatet puffer ved 3 ml / min. Skala bar = 50 mM. Klik her for at se større billede .
Figur 4.. Calcium fluorescens i en endotelcelle rør. Repræsentative fluorescerende billeder af en endotel-rør som respons på stimulering med 1 uM acetylcholin. A) Fluorescens før stimulering. B) endotel rør fluorescens på tidspunktet for acetylcholin administration, t = 0 sek. C) endotel rør fluorescens ved t = 5 sek. D) endotel rør fluorescens ved t = 10 sek. E) endotel rør fluorescens ved t = 15 sek. F) endotel rør fluorescens ved t = 20 sek. Skalapanelerne = 40 mM. Klik her for at se større billede .
Discussion
Her beskriver vi isolering af endotel rør fra havet og brugen af dette præparat til at visualisere Ca 2 + signalering begivenheder inden for sit konstituerende ECS. Denne procedure blev tilpasset fra et oprindeligt udviklet til at isolere endotel rør fra arterioler af hamster cremaster muskel 8. Bruger mindre variationer af de teknikker, der præsenteres her, har vi isoleret endotheliale rør fra en række kar, herunder: foder arterier hamster retraktoren muskler og kæbepose arterioler 10, mus overlegen epigastriske arterie 6,7,9, mus mesenteriske og cerebral arterier og lymfe mikrokar (upublicerede observationer, referencer er inkluderet for at isolere mesenteriale skibe 12 og cerebrale skibe 13). Isolere endotel rør fra nye kar kan kræve ændringer af den oprindelige protokol. Hvis isolation er mislykket, er det bedst at begynde med at ændre fordøjelsesperiode:Forøg fordøjelsen tid, hvis endotelceller rør er vanskeligt at isolere fra glatte muskelceller og adventitia og reducere fordøjelse tid, hvis endotel slangen ikke forbliver intakt. Hvis ændre fordøjelsesperiode er mislykket, bør justere koncentrationen af fordøjelsesenzymer eller fordøjelsen temperatur blive retsforfulgt. En anden mulighed er at reducere den indre diameter af triturering pipette, hvilket øger forskydningskraft fjerne glatte muskelceller. Forøgelse af hastigheden af væskesprøjtemiddel kan også prøvet for den samme virkning, men er mere tilbøjelige til at beskadige præparatet. Det bør anerkendes, at det ikke kan være muligt at isolere intakte endotel rør fra skibe, i hvilke endotelceller ikke er godt forbundet med hinanden ved Junctional proteiner.
Dissociation af glatte muskelceller efter enzymatisk fordøjelse blev oprindeligt udført ved anvendelse af en hånd-stil pipettor 8. Vi har forfinet trituration procedure ved hjælp af en microsyringe-system, der har gjort det muligt konsekvent isolation af længere endotel rør (op til 3 mm) 6. Ved anvendelse af dette system er triturering pipette tilbagefyldt med mineralsk olie for at tilvejebringe en væskesøjle kontinuerlig mellem stemplet kontrollerende flydende bevægelse og PSS indeholdende karsegment. Den incompressibility af væske sammen med den konstante drivkraft for mikrosproejten stempel resulterer i konstant forskydning fartøjet tvinges gennem pipettespidsen. I modsætning hertil hånd teknikker ofte bruges til dissocierende celler (f.eks klemme gummibold i slutningen af en Pasteur-pipette) indebærer komprimering af luft, som indføres variation i drivtryk og dermed forskydning udøves på pipettespidsen.
Der er flere fordele til fremstilling røret for at studere endotelfunktionen i mikrokar. Den første er, at isolation proces giver forskellige homogene indfødte cellulære populationer af ECS og glat muscle celler. Da ECS være fysisk forbundet som rør, de er forskellige fra de enkelte glatte muskelceller, som bevarer et "C"-konfiguration, hvis de forbliver afslappet under findeling. Således respektive celletyper let skelnes, fx når at få prøver til molekylære teknikker såsom real-time PCR og immunhistokemi 10. Da flere rør er isoleret fra et enkelt fartøj (eller bilaterale skibe som på SEA) kan molekylære data og funktionelle oplysninger indhentes fra de samme fartøjer fra en bestemt dyr. Således molekylære ekspression kan være korreleret med den funktionelle adfærd mikrovaskulære endotel. Endvidere kan signaleringsbegivenheder både intra-og intercellulære iboende for mikrovaskulære endotel løses uafhængigt af påvirkning af hæmodynamiske kræfter (tryk, flow), vasoaktive midler, der transporteres i blodet (f.eks hormoner) eller fra de omkringliggende glatte muskelceller (f.eks60, via myoendothelial kobling 14-16), nerver 17 eller væv parenchyma 18.
Vigtigere er det, eftersom endothelet er frisk isoleret fra udpegede mikrokar, er der ingen ændring af fænotype, der ellers er forbundet med dyrkning EC'er 19-21. For eksempel dyrkede ECs mister muscarinreceptorantal udtryk og derved ændre deres calcium signalering profiler. Endvidere kan elektrofysiologiske egenskaber ECS ændre sig i kultur 22. Fordi de enkelte ECs fortsat være koblet via funktionelle gap junction-kanaler, endotel rør udgør et ideelt model til at studere overledning af elektriske og Ca 2 + signaler mellem cellerne 6,7. Det må også erkendes, at de dissocierede glatte muskelceller let studeres med patch-clamp teknikker til supplerende data ligger til grund for mikrovaskulære funktion 23.
En vigtig begrænsning for endotel rør model er ustabiliteten af præparatet med stigende temperatur. Mens vores forberedelser fra SEA har vist sig stabil og sund ved stuetemperatur (~ 24 ° C), og i flere timer ved 32 ° C, morfologisk og funktionel nedbrydning forekommer i mindre end en time ved 37 ° C 9. En anden vigtig begrænsning af endotel røret er tabet af myoendothelial knudepunkter og deres iboende signalsystemer domæner, der er integreret i EF funktion i intakte karvæggen 14-16. Det bør også erkendes, at, mens længere rør muliggøre signalering skal undersøges over relativt store afstande 6, fremstilling af rør kompliceret som de bliver længere, fordi det bliver vanskeligt fuldt ud at adskille omgivende glatte muskelceller og adventitia. Vi har fundet, at rørene er længere end 1-2 mm er også sværere at placere og fastgøre i strømmen kammeret. I modsætning hertil, mens kortere rør (fx <1 mm) enaBLE Ca 2 + og elektriske signaler, der skal undersøges 8, er de vanskelige at opretholde i superfusion i strømningskammeret. Endelig, selv med optimal isolering af rør bilateralt, der ikke er tilstrækkelig materiale til traditionelle kvantificering af protein-ekspression ved hjælp af Western blots, selvom immunolabeling giver et indeks for protein-ekspression og lokalisering. Til trods for disse begrænsninger, endotel rør udgør et hidtil ukendt præparat til at give ny indsigt i mekanismerne i mikrovaskulære endotelceller funktion in vivo.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Pooneh Bagher og Dr. Erika Westcott redaktionelle kommentarer i udarbejdelsen af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af National Heart, Lung og Blood Institute of National Institutes of Health under award numre R37-HL041026 og R01-HL086483 til SSS og F32-HL107050 til MJS. Dette indhold er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
| Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
| Papain | Sigma | P-4762 | |
| Collagenase | Sigma | C-8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
| Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
| Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
| Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
| Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| 12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| 3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
| Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| 100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| 1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
| Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
| XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
| Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res. 78, 415-423 (1996).
- Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists. Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).
- Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).
- Busse, R., et al. EDHF: bringing the concepts together. Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).
- Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium. J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, 757-770 (2012).
- Cohen, K. D., Jackson, W. F. Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells. Microcirculation. 12, 169-182 (2005).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).
- Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries. Microcirculation. 15, 503-514 (1908).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).
- Bagher, P., et al. Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).
- Faraci, F. M., et al. Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).
- Emerson, G. G., Segal, S. S. Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ. Res. 87, 474-479 (2000).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).
- Tran, C. H., et al. Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).
- Nausch, L. W., et al. Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).
- Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction. J Physiol. 555, 459-469 (2004).
- Colden-Stanfield, M., et al. Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 61, 632-640 (1987).
- Brunner, F., Kukovetz, W. R. Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).
- Tracey, W. R., Peach, M. J. Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 70, 234-240 (1992).
- Adams, D. J., Hill, M. A. Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).
- Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles. Microcirculation. 4, 35-50 (1997).
