Summary
हम देशी बरकरार microvascular endothelium में कैल्शियम संकेतन visualizing और जोड़ तोड़ के लिए एक तैयारी उपस्थित थे. Endothelial ट्यूब हौसले कंकाल की मांसपेशी पड़ोसी कोशिकाओं के भीतर और बीच विवो आकारिकी और गतिशील संकेतन में बनाए रखने की आपूर्ति माउस प्रतिरोध धमनियों से अलग. Endothelial ट्यूबों अन्य ऊतकों और अंगों की microvessels से तैयार किया जा सकता है.
Abstract
कंकाल की मांसपेशी कसरत के उदाहरण के रूप में प्रतिरोध vasculature से रक्त के प्रवाह के नियंत्रण, द्वारा उत्पादों चयापचय को हटाने के साथ ऑक्सीजन की आपूर्ति और पोषक तत्वों सहवर्ती को नियंत्रित करता है. Endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) सभी प्रतिरोध वाहिकाओं के intima लाइन और व्यास को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका (जैसे अन्तःचूचुक निर्भर vasodilation) की सेवा और, ऊतक रक्त प्रवाह की जिससे परिमाण और वितरण. ईसीएस द्वारा संवहनी प्रतिरोध के नियमन प्रसारण आंतरिक स्त्राव (जैसे नाइट्रिक ऑक्साइड और arachidonic एसिड मेटाबोलाइट्स) का उत्पादन होता है, जो intracellular सीए 2 + संकेतन, से प्रभावित है चिकनी पेशी सेल विश्राम प्रकाश में लाना है कि 1-3 और hyperpolarization 4,5. इस प्रकार endothelial सीए 2 + संकेतन की गतिशीलता को समझने रक्त प्रवाह नियंत्रण संचालन तंत्र को समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है. Endothelial ट्यूबों अलग बीएल के साथ जुड़े confounding चर समाप्तपोत लुमेन में और आसपास के चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और नहीं तो चुनाव आयोग की संरचना और समारोह को प्रभावित जो परिवाहकीय नसों, साथ ई.. यहाँ हम इस पोत के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग बेहतर अधिजठर धमनी (सागर) से endothelial ट्यूबों के अलगाव प्रस्तुत करते हैं.
एक anesthetized माउस से endothelial ट्यूबों को अलग करने के लिए, सागर (विच्छेदन के दौरान यह दृश्यमान करने की सुविधा के लिए) पोत लुमेन भीतर रक्त बनाए रखने के लिए बगल में ligated है, और पेट की मांसपेशियों की पूरी चादर excised है. समुद्र कंकाल की मांसपेशी फाइबर और संयोजी ऊतक आसपास से मुक्त विच्छेदित है, रक्त लुमेन से प्लावित है, और हल्के enzymatic पाचन कोमल विचूर्णन का उपयोग बाह्यकंचुक, नसों और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को हटाने के लिए सक्षम करने के लिए किया जाता है. बरकरार endothelium के ये हौसले से पृथक तैयारी रासायनिक और बिजली सी स्थानांतरण करने में सक्षम, व्यक्तिगत ईसीएस कार्यात्मक रूप से एक दूसरे के लिए युग्मित शेष के साथ उनके पैतृक आकारिकी बनाए रखने केअंतराल जंक्शनों 6,7 के माध्यम से intercellularly gnals. संकेत कैल्शियम और झिल्ली बायोफिज़िक्स में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करने के अलावा, इन तैयारियों देशी microvascular अन्तःचूचुक भीतर जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्थानीयकरण की आणविक अध्ययन के लिए सक्षम.
Introduction
इस प्रोटोकॉल में, हम माउस समुद्र से endothelial सेल ट्यूबों के अलगाव का वर्णन. समुद्र पूर्वकाल पेट की मांसलता को आंतरिक वक्ष धमनी और आपूर्ति ऑक्सीजन युक्त रक्त से उत्पन्न होती है. हमारे एक मॉडल के रूप में समुद्र के साथ काम कर रहा यह चिकनी पेशी सेल विश्राम गवर्निंग और समन्वय में अन्तःचूचुक की भूमिका अंतर्निहित कहनेवाला संकेत घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है कि अपेक्षाकृत लंबे, unbranched microvessel क्षेत्रों प्रदान करने के कारण है. कंकाल की मांसपेशी के अलावा अन्य ऊतकों में रुचि रखने वालों के लिए, हम आसानी से मस्तिष्क, पेट और लसीका प्रणाली के microvessels से endothelial ट्यूब प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा करने के लिए इस तकनीक को मिल गया है.
इस विधि की प्रमुख विशेषताओं microvascular endothelium के बरकरार लंबाई (1-3 मिमी) 7-9 संकेत +, पृथक वे पीएसएस के साथ superfused कर रहे हैं, जिसमें एक प्रवाह चैम्बर में एक गिलास coverslip के खिलाफ सुरक्षित है, और 2 सीए के लिए imaged हैं या कर रहे हैं किबिजली के संकेत 6,8 के लिए impaled. प्रवाह कक्ष के भीतर, एक ट्यूब के ऊपरी आधे superfusion समाधान के संपर्क में है और प्रयोगात्मक उपायों का जवाब है, (coverslip के साथ संपर्क में) नीचे आधा सुरक्षित है, जबकि और मौन रहता है. दोनों के भीतर और कहनेवाला सीए 2 + संकेत घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इसके अलावा, endothelial ट्यूब प्रोटीन अभिव्यक्ति 6,10 जांच करने के लिए जीन अभिव्यक्ति 6,10, immunohistochemistry का आकलन करने के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और electrophysiological पढ़ाई biophysical गुणों को परिभाषित करने के लिए बिजली के चालन 6,11 की.
Endothelial समारोह के अध्ययन के लिए endothelial ट्यूब तैयारी करने के कई फायदे हैं. आम तौर पर 'सी' जब आकार, (व्यक्तिगत रूप से अलग (ट्यूब गठन में रहते हैं जो) endothelial कोशिकाओं और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं: पहले अलगाव प्रक्रिया दो सेल आबादी के बीच एक सरल गौरव प्रदान करता हैआराम से). इस चयनात्मक नमूना और पोत समारोह के लिए संबंधित कोशिकाओं 'योगदान अंतर्निहित अद्वितीय गुणों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. दूसरा, इस मॉडल चिकनी मांसपेशियों, नसों, और पैरेन्काइमा आसपास के, रक्त प्रवाह के प्रभाव से स्वतंत्र, endothelium के लिए आंतरिक घटनाओं संकेत का संकल्प सक्षम बनाता है. हौसले जिससे जीन या सेल संस्कृति के साथ जुड़े प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन से बचने, पृथक जबकि तीसरा, अन्तःचूचुक अध्ययन किया है.
Protocol
1. उपकरण की तैयारी: फ्लो चैंबर, pipettes, और समाधान
- चैम्बर प्रवाह: पृथक endothelial ट्यूब (चित्रा 1 ए देखें) Superfuse तल पर एक 24 मिमी x 50 मिमी कांच coverslip के साथ एक प्रवाह चैम्बर का प्रयोग करें. चैम्बर कोडांतरण से पहले, 3% एचसीएल और 70% इथेनॉल दोनों के साथ कांच coverslips धोने ultrapure पानी से कुल्ला, और नाइट्रोजन गैस के साथ सूखी.
- Pipettes: pipettes के तीन अलग अलग प्रकार प्रोटोकॉल के दौरान इस्तेमाल कर रहे हैं: केन्युलेशन, विचूर्णन, और लगाए. केन्युलेशन और लगाए pipettes दोनों प्रयोग के दिन से पहले किया जा सकता है, लेकिन विचूर्णन पिपेट यह उचित लुमेन आकार के पोत का व्यास के ज्ञान की आवश्यकता के रूप में के दिन किया जाना चाहिए.
- Cannulation pipettes:, लुमेन से लाल रक्त कोशिकाओं फ्लश लंबा, पतला समाप्त होता है के लिए एक micropipette खींचने का उपयोग borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब खींचने के लिए आदेश में. ~ एक बाहरी व्यास संदंश के साथ समाप्त होता है तोड़ 30% Leधमनियों (~ 50-80 माइक्रोन), और आग पोलिश चिकनी होने की टिप (चित्रा 1 बी देखें) की तुलना में एस एस. यह लगभग 45 डिग्री को भी कोण pipettes के सुझावों के लिए उपयोगी है.
- Trituration pipettes: यंत्रवत्, endothelial ट्यूब से चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और बाह्यकंचुक अलग कर देना borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब से triturating pipettes करना. ऊपर के रूप में केशिका ट्यूबों तैयार है, और संदंश के साथ अंत टूट गया. सुझाव: यह आसान सफाई से विचूर्णन पिपेट कांच का मोटा दीवार को तोड़ने के लिए बनाने के लिए एक गिलास स्कोरिंग उपकरण का प्रयोग करें. Endothelial ट्यूबों अलग हो जाएगा, जहां से जहाज के बाहरी व्यास की तुलना में लगभग 10-20 माइक्रोन बड़ा प्रयोग है, के दिन निर्धारित आंतरिक व्यास को पिपेट तोड़ो. आग पोलिश टूटा समाप्त होता है जब तक चिकनी (चित्रा 1C देखें).
- Pipettes लगाए: प्रवाह कक्ष के भीतर endothelial ट्यूब को स्थिर करने के लिए, endothelial टी सुरक्षित करने के लिए pipettes लगाए बनानेचैंबर के coverslip नीचे के खिलाफ Ube. केन्युलेशन pipettes के रूप में एक ही तरीके से गिलास केशिका ट्यूब खींचो. सुझावों सील कर रहे हैं तो जब तक एक ~ 100 माइक्रोन का व्यास, और आग पोलिश संदंश के साथ समाप्त होता है को तोड़ने, गोल और चिकनी (चित्रा -1 देखें). नोट: लगाए पिपेट की नोक पूरी तरह से सील नहीं किया जाता है, तरल पदार्थ लुमेन में प्रवेश करेंगे और प्रयोगात्मक परिणाम उलझाना सकता है.
- समाधान: ultrapure में सभी समाधान (18.2 MΩ) एच 2 ओ को तैयार है और एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से उन्हें बाँझ. समाधान की osmolality 285-300 mOsm के बीच है सुनिश्चित करें. 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब समाधान लगभग दो सप्ताह के लिए अच्छा रहेगा
- विच्छेदन समाधान: बेहतर अधिजठर धमनी के विच्छेदन के दौरान इस्तेमाल नमक समाधान (mmol / एल में) से बना है: 137 NaCl, 5 KCl, 1 2 MgCl, 10 एन 2 hydroxyethylpiperazine-n '2 ethanesulfonic एसिड ( HEPES), 10 ग्लूकोज, 0.01 सोडियम nitroprusside (SNP), एकडी 0.1% गोजातीय सीरम 7.4 का पीएच के साथ albumin (BSA). कोई दाता SNP धमनी cannulate करने और विचूर्णन दौरान चिकनी पेशी सेल हटाने की सुविधा को आसान बनाने उन्हें इस प्रकार, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं आराम में मदद करने के लिए शामिल किया गया है.
- हदबंदी समाधान: endothelial ट्यूब की हदबंदी के दौरान इस्तेमाल नमक समाधान (mmol / एल में) से बना है: 137 NaCl, 5 KCl, 1 2 MgCl, 10 HEPES, 10 ग्लूकोज, साथ 2 2 CaCl, और 0.1% बीएसए, 7.4 का पीएच. इस बफर के 1 मिलीलीटर विभाज्य, जोड़ने: 0.62 मिलीग्राम / एमएल papain, 1.5 मिलीग्राम / एमएल collagenase और 1.0 मिलीग्राम / एमएल dithioerythritol. विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं से एंजाइमों enzymatic गतिविधि के स्तर अलग हो सकता है, इस काम के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के उत्पाद संख्या सामग्री की तालिका में संदर्भ के लिए शामिल किए गए हैं. नोट: प्रोटोकॉल के दौरान एंजाइमों के साथ हदबंदी बफर और हदबंदी बफर दोनों अलग अलग चरणों में किया जाता है.
- Superfusion समाधान: superfusin के लिए इस्तेमाल शारीरिक नमक समाधान (पीएसएस)जी पृथक endothelial ट्यूब (mmol / एल में) से बना है: 137 NaCl, 5 KCl, 1 2 MgCl, 10 HEPES, 7.4 का एक pH के साथ 10 ग्लूकोज और 2 2 CaCl,.
- सर्जिकल प्रक्रियाओं की शुरुआत से पहले buffers और समाधान तैयार करें. एक 200 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में 4 डिग्री सेल्सियस और विभाज्य विच्छेदन बफर के 50 एमएल से समाधान निकालें और बर्फ पर जगह है. इसके अतिरिक्त, हदबंदी से विभाज्य 50 मिलीलीटर एंजाइमों के बिना बफर और कमरे के तापमान को संतुलित करने के लिए बेंच शीर्ष पर जगह है. 4 डिग्री सेल्सियस से superfusion समाधान निकालें और यह बेंच शीर्ष पर कमरे के तापमान को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं.
2. पशु तैयारी
जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं और प्रोटोकॉल प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के साथ समझौते में हैं कि सुनिश्चित करें. यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गयामिसौरी.
- पुरुष या कम से कम 9 सप्ताह पुरानी मादा चूहों का प्रयोग करें और व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक का अध्ययन. Intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) के माध्यम से pentobarbital सोडियम (60 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ एक माउस anesthetize. सुझाव: इंजेक्शन ज्यादा की संभावना को कम कर देता पहले बाँझ खारा में 10 मिलीग्राम / एमएल pentobarbital गिराए.
- संज्ञाहरण तुरंत pentobarbital के पहले इंजेक्शन के बाद तापमान विनियमन समझौता, तो गर्म माउस रखना. (~ 37 डिग्री सेल्सियस के लिए calibrated) एक हीटिंग प्लेट के ऊपर एक धातु वाहक (हवादार एल्यूमीनियम टोकरी) का उपयोग करना स्थिर माउस का तापमान बनाए रखने के लिए अच्छी तरह से काम करता है. वैकल्पिक रूप से, माउस से एक उचित दूरी पर स्थित करने के लिए, देखभाल करने के लिए एक गर्मी दीपक का उपयोग करें. संज्ञाहरण के उचित स्तर (पैर की अंगुली या पूंछ चुटकी करने के लिए वापसी की कमी) हासिल की है जब तक माउस हर 5-10 मिनट मॉनिटर. एक पूरक खुराक 15-20 मिनट के बाद आवश्यक हो सकता है. यह विशेष रूप से मोटापे से ग्रस्त वृद्ध, या पशु के साथ, अधिक मात्रा से बचने के लिए धीरे धीरे और सावधानी के साथ आगे बढ़ने के लिए सबसे अच्छा हैअन्यथा जोर दिया है.
- ध्यान से छोटे पालतू बाल कतरनी के साथ यह शेविंग द्वारा उदर की ओर से बाल निकालें. विशेष रूप से ध्यान जानवर को आघात से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. यह जघन क्षेत्र के बगल में फैले एक क्षेत्र से सभी बाल हटाने के लिए उपयोगी है. एक ताजा शराब झाड़ू के साथ किसी भी शिथिल पकड़ बाल निकालें.
- संभव के रूप में पेट की दीवार के रूप में ज्यादा बेनकाब करने के लिए बाहर फैल दोनों पहले से और हिंद अंग के साथ झूठ बोल रही है, अपनी पीठ पर माउस स्थिति. यदि आवश्यक हो, एक पसरा ढंग से पैरों को सुरक्षित करने के लिए प्रयोगशाला टेप का उपयोग करें.
3. सुपीरियर अधिजठर धमनी के अलगाव
- बस जघन क्षेत्र के क्षेत्र के ऊपर त्वचा के माध्यम से एक छोटा सा चीरा बनाओ. अंतर्निहित पेट की मांसपेशियों को नुकसान से परहेज करते हुए केवल त्वचा में कटौती की जा रही है कि सुनिश्चित करना; संबंधित hindlimbs के लिए बाहर प्रत्येक दिशा में laterally चीरा हूं. Rostrally उदर रिब पिंजरे के शीर्ष पर midline और साथ चीरा जारीn संबंधित forelimbs के लिए प्रत्येक दिशा में laterally चीरा हूं.
- धीरे त्वचा उठा और संयोजी ऊतक (चित्रा 3 देखें) जिससे पेट की मांसलता की पूरी सतह को उजागर अंतर्निहित मांसपेशियों को त्वचा पकड़े तोड़ कैंची का उपयोग करें. कमरे के तापमान में 0.9% नमकीन घोल के साथ संपर्क में पेशी की सिंचाई.
- समुद्र के छोटे आकार की वजह से, आगे प्रक्रियाओं के लिए एक stereomicroscope के नीचे पशु स्थिति. संदंश के साथ उरोस्थि के निचले भाग में स्थित वसा पैड लिफ्ट, और इसके माध्यम से एक चीरा बनाते हैं. अंतर्निहित ऊतकों में भी गहराई में कटौती नहीं करना सुनिश्चित करें, जिससे नीचे रिब साथ चीरा जारी. समुद्र दिखाई जानी चाहिए, यह हानिकारक से बचने के लिए ध्यान रखना. चीरा पूरा एक बार, कमरे के तापमान में 0.9% नमकीन घोल के साथ संपर्क में ऊतक की सिंचाई.
- कंकाल की मांसपेशी के ऊपर परत से मुकर जाने के बाद, समुद्र और अंतर्निहित मांसपेशियों को आसानी से पहचान कर रहे हैं. सुझाव: लंबाई का नोटउनके मूल लंबाई लगभग करने के लिए (अलगाव पर उनके अक्ष के साथ छोटा है) endothelial ट्यूब का विस्तार करने के लिए अलग से पहले विवो में सागर. संदंश और कैंची का प्रयोग, ध्यान से समुद्र के नीचे पतली मांसपेशियों परत आबकारी.
- Angled संदंश का प्रयोग, समुद्र के नीचे 6-0 रेशम सीवन की लंबाई के पास और दबाव और बाद में अलगाव और सफाई के दौरान दृश्य की सुविधा के लिए पोत लुमेन भीतर बनाए रखा रक्त रखने के लिए यह धमनी और उसके सटे नस ligate.
- Contralateral पक्ष पर समुद्र बंधाव प्रक्रिया दोहराएँ.
- दोनों समुद्र ligated मिल जाने के बाद संबंधित पक्षों को अलग करने के लिए पेट की मांसपेशियों के midline के साथ एक चीरा बनाते हैं.
- त्वचा के लिए किया जाता के रूप में पूरी तरह से शरीर से पेट की मांसपेशियों को अलग करने के लिए खड़ी बाहरी किनारे के साथ चीरा जारी रखने के तो, हर दिशा में laterally चीरा बढ़ाएँ. दबाव लुमेन बनाए रखने के लिए समुद्र से तंग आ वाहिका संरचना को नुकसान से बचने.
- सीसील बनाए रखने के लिए बंधाव ऊपर समुद्र केन्द्र शासित प्रदेशों, और 4 डिग्री सेल्सियस विच्छेदन बफर के 10 एमएल युक्त एक 50 मिलीलीटर बीकर में अलग मांसपेशी और धमनी जगह है.
- पेट के दूसरे पक्ष के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ और 10 मिनट के लिए विच्छेदन बफर में ऊतकों सेते हैं.
- (3B चित्रा देखें) एक ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) से युक्त विच्छेदन कक्ष विच्छेदन बफर में समुद्र युक्त पेट की मांसपेशियों रखें. विच्छेदन कक्ष तल पर Sylgard (polydimethylsiloxane [PDMS]) की एक परत के साथ एक पेट्री डिश के होते हैं.
- कीट पिन (0.15 मिमी) का उपयोग करना, vivo लंबाई (जैसा कि ऊपर उल्लेख) लगभग और Sylgard करने के लिए इसे सुरक्षित करने के लिए पृथक समुद्र और पेट की मांसपेशियों में खिंचाव. सुझाव: इस तरह की मांसपेशी Orienting पेरिटोनियम का सामना करना पड़ पतली परत शीर्ष पर है कि transillumination का उपयोग समुद्र में आसानी से दिखाई देता है.
- ठीक microdissection उपकरणों के उपयोग और दिशा बंधाव के अपस्ट्रीम साइट से कामबहाव के अंत, पहली बड़ी शाखा साइट (1-2 सेमी) तक अपनी बनती नस और आसपास के ऊतकों से समुद्र साफ़ करें. तो सिर्फ शाखा साइट ऊपर है और अभी बंधाव नीचे काटने के द्वारा समुद्र आबकारी.
- पोत लुमेन भीतर बनाए रखा रक्त निकालने के लिए, समुद्र cannulate और बर्फ ठंड विच्छेदन बफर के साथ यह फ्लश. Silastic टयूबिंग के एक टुकड़े का उपयोग करना, बर्फ ठंड विच्छेदन बफर युक्त एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के लिए एक केन्युलेशन पिपेट के पीछे के अंत देते हैं और समुद्र cannulate को विच्छेदन कक्ष के भीतर इसकी टिप की स्थिति के लिए एक micromanipulator में micropipette सुरक्षित.
- एरिथ्रोसाइट्स के सभी बाहर प्लावित कर रहे हैं एक बार, केन्युलेशन पिपेट से समुद्र को हटाने, और विच्छेदन पकवान के बाहर पिपेट उठा.
- छोटे खंडों में लंबाई में प्रत्येक 1-3 मिमी समुद्र काटें. ये छोटे खंडों endothelial ट्यूबों के अलगाव की सुविधा.
4. Endothelial ट्यूब का अलगाव
- एक 12 मिमी x 75 मिमी कांच पंथ भरेंबर्फ के ठंडे विच्छेदन बफर के साथ ure ट्यूब आधे रास्ते. Angled संदंश का प्रयोग, संस्कृति ट्यूब में धमनी टुकड़े हस्तांतरण और बर्फ पर जगह है. इस समय, एक अलग 12 मिमी x 75 मिमी संस्कृति ट्यूब में 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए हदबंदी बफर के साथ पाचन एंजाइमों गठबंधन (1.3.2 समाधान देखें) और एक हीटिंग ब्लॉक के साथ 37 डिग्री सेल्सियस का हल पहले से गरम.
- हदबंदी बफर और एंजाइमों वार्मिंग रहे हैं, ध्यान से पोत क्षेत्रों युक्त एक छोटी मात्रा छोड़ने संस्कृति ट्यूब से विच्छेदन बफर aspirate.
- धीरे शेष विच्छेदन बफर दूर धोने के लिए एंजाइमों के बिना कमरे के तापमान हदबंदी बफर जोड़ें. सुझाव: धमनी टुकड़े उन्हें फिर से बसाने के लिए इंतज़ार कर समय की बचत करने के लिए संस्कृति ट्यूब के तल पर रहते हैं कि हदबंदी बफर धीरे धीरे इस तरह जोड़ें. सदमे को कम से कम 37 डिग्री सेल्सियस, कमरे के तापमान (~ 24 डिग्री सेल्सियस) के लिए, बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) से कई कदमों पर बफर तापमान बढ़ा.
- ध्यान dissoc महाप्राणiation पोत क्षेत्रों युक्त एक छोटी मात्रा छोड़ने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है फिर, संस्कृति ट्यूब से बफर.
- , हीटिंग ब्लॉक से एंजाइमों के साथ पूर्वतापन हदबंदी बफर निकालें पोत क्षेत्रों युक्त संस्कृति ट्यूब एंजाइम समाधान के 1 मिलीलीटर हस्तांतरण, और हीटिंग ब्लॉक में वापस संस्कृति ट्यूब जगह. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- एंजाइमों के साथ ऊष्मायन के दौरान, विचूर्णन पिपेट तैयार खनिज तेल के साथ यह backfill और एक micromanipulator में मुहिम शुरू की है कि एक microsyringe पर यह सुरक्षित है. फिर हदबंदी बफर के 2 NL साथ विंदुक भरें और प्रवाह कक्ष के ऊपर पिपेट टिप microsyringe सवार वापस लेना.
- 30 मिनट ऊष्मायन के अंत में, हीटिंग ब्लॉक से संस्कृति ट्यूब को हटाने और ध्यान से ऊपर के रूप में बफर aspirate.
- कमरे के तापमान हदबंदी बफर के 4 एमएल के साथ धमनी क्षेत्रों धो लें. नोट: यह पोत SEGM रखने के लिए आवश्यक नहीं रह गया हैसंस्कृति ट्यूब के नीचे पिता, धमनी टुकड़े परेशान वास्तव में अवशिष्ट एंजाइमों प्रभावी रूप से हटा रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने में मदद करता है.
- धीरे 1 मिलीलीटर micropipette के साथ यह aspirating, और हदबंदी बफर के 1 मिलीलीटर के साथ प्रवाह चैम्बर में जगह द्वारा प्रवाह चैम्बर के लिए स्थानांतरण एक पोत खंड.
- Microsyringe युक्त micromanipulator का उपयोग, पोत खंड के एक छोर के निकट विचूर्णन पिपेट की नोक स्थिति.
- ईसीएस के लिए यांत्रिक तनाव का कारण है, और फिर वापस चेंबर में यह बेदखल करने के लिए इतना रूप में नहीं, triturating पिपेट धीरे धीरे (225 NL / सेक) में पोत खंड (वापस ले लिया 500 NL) aspirate. पाचन सफल रहा था, तो चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और बाह्यकंचुक endothelial ट्यूब से अलग किया जाएगा.
- सभी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं अलग हैं जब तक विचूर्णन दोहराएँ. अत्यधिक विचूर्णन (4x या अधिक) ईसीएस को नुकसान पहुंचा और एगोनिस्ट उन्हें अनुत्तरदायी प्रदान कर सकते हैं कि जानकारी है. सुझाव:विचूर्णन पिपेट का उपयोग, ट्यूब entangling से रखने के लिए जितनी जल्दी हो सके दूर endothelial ट्यूब से बाह्यकंचुक चाल है. नोट: विचूर्णन पिपेट का उपयोग करना, पृथक endothelial ट्यूब aspirated और एक अलग कक्ष में स्थानांतरित किया जा सकता है.
- प्रवाह की दिशा साथ गठबंधन प्रवाह चैम्बर के केंद्र में endothelial ट्यूब स्थिति, और triturating पिपेट हटा दें.
- Micromanipulators में सुरक्षित लगाए pipettes प्रवाह कक्ष के दोनों छोर पर घुड़सवार, और endothelial ट्यूब के संबंधित सिरों पर उनके सुझावों की स्थिति.
- कक्ष के नीचे के खिलाफ यह प्रेस करने के लिए ट्यूब के एक छोर पर एक लगाए पिपेट कम करें. ट्यूब के विपरीत अंत में एक ही तरह से दूसरी लगाए पिपेट स्थिति. नोट: लगाए pipettes की नियुक्ति एक व्यापार बंद ट्यूब (आगे ट्यूब के अंत से उन्हें रखने) हासिल करने और अधिक इमेजिंग / प्रयोगात्मक क्षेत्र (करीब ट्यूब का अंत करने के लिए उन्हें रखने के लिए) की अनुमति के बीच है. टी लगानेहेम ~ ट्यूब के प्रत्येक के अंत से 50 माइक्रोन अच्छी तरह से काम करता है. लगाए पिपेट ट्यूब छू लेती है, उसी तरह धीरे धीरे जिससे vivo में लंबाई लगभग करने के लिए यह विस्तार ट्यूब की धुरी के साथ इसे वापस लेना है, तो ट्यूब सुरक्षित करने के लिए चैम्बर नीचे के खिलाफ पिपेट दबाएँ.
- Superfusion समाधान का प्रवाह शुरू, और (चित्रा -3 सी देखें) endothelial ट्यूब संतुलित करना और पालन करने के लिए कम से कम 20 मिनट के लिए आराम करने की अनुमति देते हैं. Endothelial ट्यूब भर में लगातार द्रव का प्रवाह (superfusion) बनाए रखने के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग. नोट: endothelial ट्यूब प्रवाह कक्ष के नीचे (~ 25 मिनट) का पालन किया या endothelial ट्यूब उखाड़ फेंकना नहीं बन जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए जगह में छोड़ दिया है एक बार लगाए pipettes हटाया जा सकता है.
5. डाई लोड हो रहा है और कैल्शियम इमेजिंग
- , Intracellular कैल्शियम प्रतिक्रियाओं कल्पना कमरे के तापमान पर Fluo-04:00 डाई के साथ endothelial ट्यूब लोड करने के लिए (~ 24 डिग्री सेल्सियस). स्नान में द्रव का प्रवाह बंद करो, और Fluo-4 जोड़10 माइक्रोन का एक अंतिम एकाग्रता में चैम्बर कर रहा हूँ. तो कोशिकी डाई निकाल दिया जाता है और कहा कि intracellular डाई पूरी तरह से de-एस्टरीकृत किया गया है यह सुनिश्चित करने के लिए 20 मिनट के लिए ताजा पीएसएस के साथ endothelial ट्यूब Superfuse, डाई कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए अनुमति देने के लिए 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें.
- कैल्शियम इमेजिंग प्रदर्शन. इस काम के लिए, एक ईमानदार माइक्रोस्कोप एक कताई डिस्क confocal इमेजिंग प्रणाली से सुसज्जित परिवेश कमरे के तापमान पर इस्तेमाल किया गया था (देखें चित्र 2). एक 491 एनएम लेजर के साथ फ्लोरोसेंट कैल्शियम डाई उत्तेजित और एक तेज डिजिटल कैमरे का उपयोग कर (500-550 एनएम उत्सर्जन पर) प्राप्त चित्रों के.
Representative Results
कैल्शियम प्रतिक्रियाओं acetylcholine का उपयोग हौसले से अलग endothelial ट्यूब (ACH) में शुरू किया जा सकता है. इस फिल्म में 10 माइक्रोन Fluo-4 AM साथ भरी हुई एक endothelial ट्यूब 1 माइक्रोन को ACH (1 मूवी) की superfusion साथ प्रेरित है. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें . डाई 491 एनएम पर उत्साहित है और उत्सर्जन एक तेज आरोप डिवाइस युग्मित कैमरे का उपयोग कर 500-550 एनएम से दर्ज की गई है. छवि के ढेर के एक 25 सेकंड की अवधि के लिए / सेकंड 120 तख्ते पर अर्जित कर रहे हैं और उसके बाद (उदाहरण के लिए 40 फ्रेम / सेक) औसतन किया जा सकता. समय के साथ प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियों चित्रा 4 में दिखाया गया.
चित्रा 1. चैम्बर और endothelial ट्यूबों के अलगाव के दौरान इस्तेमाल किया pipettes प्रवाह. ए) एक एक खींच लिया, टूटी पॉलिश और angled (दाएं) केन्युलेशन पिपेट खींचा (बाएं) और के आधार. बी के रूप में एक 24 मिमी x 50 मिमी कांच coverslip के साथ इकट्ठे प्रवाह चैम्बर) उदाहरण. इस पिपेट विच्छेदन निम्नलिखित धमनी के लुमेन से एरिथ्रोसाइट्स फ्लश करने के लिए प्रयोग किया जाता है. स्केल बार = 200 माइक्रोन. सी) एक एक खींच लिया, टूटा हुआ है और पॉलिश (दाएं) विचूर्णन पिपेट खींचा (बाएं) और के उदाहरण हैं. इस पिपेट का आंतरिक व्यास धमनी के बाहरी व्यास द्वारा निर्धारित किया जाता है. एक एक (खींचा, टूटा हुआ है और पॉलिश सही) लगाए पिपेट खींचा (बाएं) और के पैमाने बार = 200 माइक्रोन. डी) उदाहरण. इस पिपेट की नोक से गोल और पूरी तरह से प्रवाह चैम्बर में endothelial ट्यूब सुरक्षित करने के लिए बंद है. स्केल बार = 200 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. सीए 2 + संकेतों के इमेजिंग. ए) कैल्शियम इमेजिंग के लिए इस्तेमाल ईमानदार माइक्रोस्कोप. बी) एक (ख) तेज चार्ज कपल्ड डिवाइस कैमरा. सी) विसर्जन उद्देश्यों (एक) 63X (साथ (एक) confocal कताई डिस्क इकाई के लिए डिस्क confocal खुर्दबीन स्पिनिंग एनए 1) = और (ख) 20X (एनए 0.5 =) इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. पेट की मांसपेशियों के अलगाव और बेहतर अधिजठर धमनी. एक (यानी जहाजों ligated किया जाना चाहिए जहां प्रवेश) जिस पर वसा पैड के तहत साइटों के निशान. स्केल बार = 1 सेमी. बी) microdissection के लिए एक विच्छेदन कक्ष में बाहर टिकी पृथक पेट की मांसपेशी (एकतरफा) और सागर. लाल तीर (पोत की सफाई बंद कर दिया है, जिस पर बिंदु यानी) समुद्र के पहले प्रमुख विभाजन साइट को इंगित करता है. एक समुद्र से स्केल बार = 1 सेमी. सी) पृथक endothelial सेल ट्यूब. कमरे के तापमान पर 1 घंटे ऊष्मायन के बाद एक endothelial ट्यूब का अंतर हस्तक्षेप विपरीत छवि. endothelial ट्यूब 3 मिलीग्राम / मिनट पर superfusion बफर के साथ superfused किया गया था. स्केल बार = 50 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4. एक endothelial सेल ट्यूब में कैल्शियम प्रतिदीप्ति. 1 माइक्रोन एसिटाइलकोलाइन एसिटाइलकोलाइन प्रशासन के समय में उत्तेजना. बी से पहले. ए) प्रतिदीप्ति) endothelial ट्यूब प्रतिदीप्ति साथ उत्तेजना के जवाब में एक endothelial ट्यूब के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियों, टी = 5 सेकंड में टी = 0 सेकंड. सी) endothelial ट्यूब प्रतिदीप्ति. टी डी) endothelial ट्यूब प्रतिदीप्ति = टी = 15 सेकंड में 10 सेकंड. ई) endothelial ट्यूब प्रतिदीप्ति टी = 20 सेकंड में. एफ) endothelial ट्यूब प्रतिदीप्ति. स्केल सलाखों = 40 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Discussion
यहाँ हम समुद्र से endothelial ट्यूबों के अलगाव और उसके विधान ईसीएस के भीतर संकेत घटनाओं + 2 सीए कल्पना करने के लिए इस तैयारी के उपयोग का वर्णन. यह प्रक्रिया मूल रूप से हम्सटर cremaster मांसपेशियों 8 की धमनियों से endothelial ट्यूबों को अलग करने के लिए विकसित एक से लिया गया था. हम्सटर प्रत्याकर्षक मांसपेशियों और गाल की फीड धमनियों थैली arterioles 10, माउस बेहतर अधिजठर धमनी 6,7,9, माउस mesenteric और मस्तिष्क: यहां प्रस्तुत तकनीक की मामूली बदलाव का उपयोग, हम सहित संवहनी बेड की एक किस्म से endothelial ट्यूब, अलग है धमनियों और लसीका microvessels (अप्रकाशित टिप्पणियों; संदर्भ mesenteric वाहिकाओं 12 और मस्तिष्क वाहिकाओं 13 अलग करने के लिए शामिल किए गए हैं). नई संवहनी बेड से endothelial ट्यूबों अलग मूल प्रोटोकॉल के लिए संशोधन की आवश्यकता हो सकती. अलगाव असफल होता है, यह पाचन बार बदलकर शुरू करने के लिए सबसे अच्छा है:Endothelial ट्यूबों चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और बाह्यकंचुक से अलग और endothelial ट्यूब बरकरार न रह जाए, तो पाचन के समय को कम करने के लिए मुश्किल हैं अगर पाचन समय बढ़ाएँ. पाचन बार फेरबदल असफल होता है, पाचन एंजाइमों की एकाग्रता या पाचन तापमान एडजस्ट करने की कोशिश की जानी चाहिए. एक अन्य विकल्प चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को हटाने में कतरनी बल बढ़ता है जो विचूर्णन पिपेट, का आंतरिक व्यास को कम करना है. तरल पदार्थ इंजेक्शन का वेग बढ़ाने से भी एक ही प्रभाव के लिए कोशिश की, लेकिन तैयारी को नुकसान होने की संभावना है किया जा सकता है. यह endothelial कोशिकाओं अच्छी तरह junctional प्रोटीन से एक दूसरे से जुड़े नहीं हैं जो में जहाजों से बरकरार endothelial ट्यूबों को अलग करना संभव नहीं हो सकता है कि मान्यता प्राप्त होना चाहिए.
Enzymatic पाचन निम्नलिखित चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की हदबंदी शुरू में एक हाथ शैली pipettor 8 उपयोग किया गया था. हम एक microsyr का उपयोग विचूर्णन प्रक्रिया परिष्कृत किया हैअब endothelial ट्यूबों के अनुरूप अलगाव (अप करने के लिए 3 मिमी) 6 सक्षम है जो Inge प्रणाली,. इस प्रणाली का उपयोग करते हैं, विचूर्णन पिपेट द्रव आंदोलन और पोत खंड युक्त पीएसएस नियंत्रित पिस्टन के बीच एक सतत द्रव स्तंभ प्रदान करने के लिए खनिज तेल के साथ backfilled है. पोत के रूप में लगातार कतरनी में microsyringe पिस्टन के परिणाम की निरंतर प्रेरणा शक्ति के साथ तरल पदार्थ की असंपीड्यता पिपेट टिप के माध्यम से मजबूर है. इसके विपरीत, अक्सर अलग कर कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया हाथ तकनीक (जैसे एक पाश्चर विंदुक के अंत में रबर बल्ब फैलाएंगे) ड्राइविंग दबाव में परिवर्तनशीलता का परिचय जो हवा के संपीड़न, और, इस प्रकार, कतरनी पिपेट टिप पर exerted शामिल है.
Microvessels में endothelial समारोह के अध्ययन के लिए ट्यूब तैयारी करने के लिए कई फायदे हैं. पहले अलगाव प्रक्रिया ईसीएस के अलग समरूप देशी सेलुलर आबादी और चिकनी म्यू प्रदान करता हैscle कोशिकाओं. ईसीएस शारीरिक रूप से ट्यूबों के रूप में जुड़े रहने के बाद, वे विचूर्णन दौरान आराम से रहना अगर एक 'सी' विन्यास बनाए रखने जो व्यक्ति चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं. इस प्रकार संबंधित प्रकार की कोशिकाओं में आसानी से पहचाना जाता है जैसे इस तरह के वास्तविक समय पीसीआर और immunohistochemistry के रूप में 10 आणविक तकनीक के लिए नमूने प्राप्त करने के लिए जब. कई ट्यूबों एक एकल पोत से (या समुद्र के लिए किया ही द्विपक्षीय जहाजों से) अलग कर रहे हैं के बाद से, आणविक डेटा और कार्यात्मक डेटा किसी दिए गए पशु का एक ही वाहिकाओं से प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रकार आणविक अभिव्यक्ति microvascular endothelium के कार्य व्यवहार के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है. इसके अलावा, microvascular endothelium के लिए आंतरिक अंतर और कहनेवाला दोनों संकेत घटनाओं hemodynamic बलों (दबाव, प्रवाह), रक्त प्रवाह (जैसे हार्मोन) में किए गए vasoactive एजेंटों के प्रभाव से स्वतंत्र सुलझाया जा सकता है, या आसपास के चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से (जैसे60; myoendothelial युग्मन 14-16) के माध्यम से, नसों 17, या ऊतक पैरेन्काइमा 18.
अन्तःचूचुक हौसले नामित microvessels से अलग है क्योंकि महत्वपूर्ण बात है,, अन्यथा संवर्धन ईसीएस 19-21 के साथ जुड़ा हुआ है कि phenotype के कोई परिवर्तन नहीं है. उदाहरण के लिए, सुसंस्कृत ईसीएस muscarinic रिसेप्टर अभिव्यक्ति खो और इस तरह उनके संकेत कैल्शियम प्रोफाइल को बदल. इसके अलावा, ईसीएस के electrophysiological गुणों संस्कृति 22 में बदल सकते हैं. व्यक्तिगत ईसीएस कार्यात्मक अंतराल जंक्शन चैनलों के माध्यम से युग्मित रहते है क्योंकि, endothelial ट्यूब कोशिकाओं 6,7 के बीच बिजली और सीए 2 + संकेतों के चालन के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रस्तुत करता है. यह भी अलग चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को आसानी से microvascular समारोह 23 अंतर्निहित पूरक डेटा के लिए पैच दबाना तकनीक के साथ अध्ययन कर रहे हैं कि मान्यता प्राप्त होना चाहिए.
Endothelial ट्यूब एम के लिए एक प्रमुख सीमाODEL तापमान में वृद्धि के साथ तैयारी की अस्थिरता है. समुद्र से हमारी तैयारी परिवेश कमरे के तापमान (~ 24 डिग्री सेल्सियस) में और 32 डिग्री सेल्सियस पर कई घंटे के लिए स्थिर और स्वस्थ सिद्ध कर दिया है, रूपात्मक और कार्यात्मक गिरावट 37 डिग्री सेल्सियस 9 में एक घंटे से भी कम समय में होते हैं. Endothelial ट्यूब का एक दूसरा महत्वपूर्ण सीमा बरकरार पोत दीवार 14-16 में चुनाव आयोग के समारोह का अभिन्न अंग हैं कि myoendothelial जंक्शनों और अपने निहित संकेतन डोमेन का नुकसान हुआ है. यह भी मान्यता दी जानी चाहिए, कि अब ट्यूबों वे लंबे समय तक पाने के रूप में यह पूरी तरह से चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और बाह्यकंचुक आसपास अलग कर देना करने के लिए और अधिक कठिन हो जाता है क्योंकि ट्यूबों की तैयारी जटिल है अपेक्षाकृत काफी दूरी 6, पर अध्ययन किया जा कहनेवाला संकेतन सक्षम है. हम 1-2 मिमी से अधिक लंबी ट्यूब भी स्थिति और प्रवाह चैम्बर में सुरक्षित करने के लिए और अधिक कठिन हो पाया है. इसके विपरीत, छोटी नलियों (जैसे <1 मिमी) ENA जबकि8 अध्ययन किया जा ble सीए 2 + और विद्युत संकेतों, वे प्रवाह चैम्बर में superfusion दौरान बनाए रखने के लिए मुश्किल हो जाता है. Immunolabeling प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण का एक सूचकांक प्रदान करता है, हालांकि अंत में, यहाँ तक कि द्विपक्षीय ट्यूबों के इष्टतम अलगाव के साथ, पश्चिमी blots का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति की पारंपरिक मात्रा का ठहराव के लिए अपर्याप्त सामग्री, वहाँ है. ऐसी सीमाओं के बावजूद, endothelial ट्यूब विवो में microvascular endothelial सेल समारोह के तंत्र में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए एक उपन्यास तैयारी का प्रतिनिधित्व करता है.
Disclosures
नहीं.
Acknowledgments
लेखकों पांडुलिपि तैयार करने में संपादकीय टिप्पणियों के लिए डॉ. Pooneh Bagher और डॉ. एरिका Westcott धन्यवाद. इस काम के पुरस्कार संख्या R37-HL041026 और एसएसएस के लिए R01-HL086483 और MJS लिए F32-HL107050 के तहत राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के रक्त संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. इस सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
| Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
| Papain | Sigma | P-4762 | |
| Collagenase | Sigma | C-8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
| Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
| Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
| Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
| Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| 12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| 3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
| Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| 100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| 1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
| Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
| XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
| Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |
References
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