Summary
Мы представляем подготовку к визуализировать и манипулировать сигнализации кальция в родном, неповрежденной микрососудов эндотелия. Эндотелиальные трубки свежевыделенные от мыши артерий сопротивления, поставляющих скелетных мышц сохранить в естественных условиях морфологии и динамического сигнализации внутри и между соседними клетками. Эндотелиальные трубы могут быть получены из микрососудов других тканей и органов.
Abstract
Контроль кровотока по сопротивления сосудистой регулирует подачу кислорода и питательных веществ, одновременно с удалением продуктов метаболизма, о чем свидетельствует, осуществляя скелетные мышцы. Эндотелиальные клетки (ECS) выравнивают интиму всех резистивных сосудов и служить ключевую роль в контроле диаметра (например эндотелий-зависимой вазодилатации) и, тем самым, величина и распределение тканевого кровотока. Регулирование сосудистое сопротивление по ЭК осуществляется путем внутриклеточного Са 2 + сигналов, что приводит к производству диффундирующих физиологически активные вещества (например, окись азота и метаболитов арахидоновой кислоты) 1-3 и гиперполяризации 4,5, что вызывают расслабление гладкомышечных клеток. Таким образом понимания динамики эндотелиальной Ca 2 +-сигнализации является ключевым шагом на пути к пониманию механизмов, регулирующих управление потоком крови. Изоляция эндотелиальные трубки исключает вмешивающихся переменных, связанных с блOOD в просвете сосуда и с окружающими клетками гладких мышц и периваскулярными нервов, которые в противном случае влияют на структуру и функцию EC. Здесь мы представляем изоляцию эндотелиальных трубок от вышестоящего эпигастральной артерии (СЭО) с использованием протокола оптимизированный для этого судна.
Для выделения эндотелиальных трубок из под наркозом мыши, СЭО, лигирована месте для поддержания крови в просвете сосудов (для облегчения визуализируя ее во время вскрытия), а весь лист брюшной мышцы вырезали. СЭО отсекали от окружающих скелетных мышечных волокон и соединительной ткани, кровь очищается от просвета, и мягкий ферментативное расщепление выполняется для того, чтобы удаление адвентиции, нервов и клеток гладкой мускулатуры, используя мягкое растирание. Эти свежих изолированных препараты интактным эндотелием сохранить их родной морфологию, с индивидуальным ЭК остальные функционально соединены друг с другом, в состоянии передавать химических и электрических сиgnals межклеточно через щелевые контакты 6,7. В дополнение к предоставлению новому взглянуть на сигнальных кальция и биофизики мембран, эти препараты позволяют молекулярные исследования экспрессии генов и локализации белков в родном микрососудов эндотелия.
Introduction
В этом протоколе, мы описывают выделение эндотелиальных клеток труб от моря мыши. СЭО возникает из внутренней грудной артерии и поставок кислородом крови к передней брюшной мускулатуры. Наша работа с моря в качестве модели объясняется это обеспечить относительно длинные, неразветвленные сегменты микрососудов, которые хорошо подходят для изучения межклеточных сигнальных событий, лежащих в основе роли эндотелия в управлении и координации расслабление гладкомышечных клеток. Для тех, кто интересуется, кроме скелетных мышц тканей, мы нашли эту технику, чтобы быть легко адаптированы для получения эндотелиальных трубок из микрососудов мозга, кишечника и лимфатической системы.
Ключевыми особенностями этого метода в том, что неповрежденные длины (1-3 мм) из микрососудов эндотелия изолированы, защищены от покровным стеклом в проточной камере, в которой они орошали PSS, и отображается на Ca 2 + сигнализации 7-9 илипронзил для электрического 6,8 сигнализации. В проточной камере, верхняя половина трубки подвергается суперфузии раствора и реагирует на экспериментальных вмешательств, в то время как нижняя половина (в контакте с покровным) защищена и остается в состоянии покоя. В дополнение к изучению как внутри-и межклеточные Ca 2 + сигнальных событий, эндотелиальные трубки могут быть использованы для количественной ПЦР в реальном времени для оценки экспрессии генов 6,10, иммуногистохимия исследовать экспрессию белка 6,10 и электрофизиологических исследований, чтобы определить биофизические свойства электрической 6,11 проводимости.
Есть несколько преимуществ для подготовки эндотелия трубки для изучения функции эндотелия. Во-первых, что процесс изоляции обеспечивает простое различие между двух клеточных популяций: эндотелиальные клетки (которые остаются в формировании трубки) и клеток гладкой мускулатуры (индивидуально диссоциированной; обычно "С" формы, когдарасслабленным). Это позволяет для селективного отбора проб и исследования уникальных свойств, лежащих в основе вклад соответствующих клеток к функции сосудов. Во-вторых, эта модель обеспечивает разрешение сигнальных событий присущи эндотелий, независимо от влияния кровотока, окружающих гладкие мышцы, нервы, и паренхиму. В-третьих, эндотелий изучается в то время как свежевыделенную, тем самым избегая изменений в гене или экспрессии белка, связанного с клеточной культуре.
Protocol
1. Подготовка оборудования: проточной камеры, пипетки, и решения
- Расход камеру: Используйте проточную камеру с 24 мм х 50 мм покровным стеклом на дне, чтобы переливать изолированные эндотелиальные трубки (см. Рисунок 1a). Перед сборкой камеру, мыть покровные стекла и с 3% HCl и 70% этанола, промыть сверхчистой водой и сушат газообразным азотом.
- Пипетки: три различных типа пипетки используются во время протокола: катетеризация, растирание и закрепление. Как катетеризации и пиннинга пипетки может быть сделано до день эксперимента, но растирание пипетки должны быть сделаны в день, так как требует знания о диаметра сосуда на просвет размером соответствующим образом.
- Катетеризации пипетки: Для того, чтобы избавиться эритроциты из просвета, тянуть из боросиликатного стекла капилляров с помощью микропипетки съемник иметь длинные, сужающиеся концы. Перерыв концы с пинцетом в наружным диаметром ~ 30% лесс, чем у артерий (~ 50-80 мкм) и пожарной ногтей кончиком быть гладкой (см. рисунок 1b). Это полезно также угол кончики пипеток примерно 45 °.
- Растирание пипетки: Для механически отделить гладкомышечных клеток и адвентиции из эндотелиальных трубок, делают растирания пипетки из боросиликатного стекла капилляров. Подготовка капиллярные трубки, как описано выше, и сломать конец щипцами. Совет: Используйте стекло забил устройство, чтобы сделать его проще сломать толстую стенку растирания пипетки стекла чисто. Перерыв пипетку с внутренним диаметром, определенной на день эксперимента, примерно 10-20 мкм больше, чем у наружного диаметра сосуда, из которого эндотелиальные трубки будут изолированы. Огонь польский сломанные концы до получения однородной массы (см. рисунок 1С).
- Закрепление пипетки: Для стабилизации эндотелия трубку в камере потока, сделать возлагают пипетки для обеспечения эндотелия тUbe против покровное нижней части камеры. Извлеките стеклянные капилляры таким же образом, как и катетеризации пипеток. Затем разбейте концы с пинцетом до диаметра ~ 100 мкм, и пожарной ногтей до кончики не запечатаны, округлые и гладкие (см. рисунок 1D). Примечание: Если кончик пиннинга пипетки не полностью герметична, жидкость будет ввести просвет и может вносить путаницу в результаты эксперимента.
- Решения: Подготовка всех решений в сверхчистых (18,2 МОм) H 2 O и стерилизовать их через фильтр 0,2 мкм. Убедитесь, что осмотическое давление растворов между 285-300 мосм. Решения остаются хорошими в течение примерно двух недель при хранении при 4 ° С.
- Препарирование раствор: раствор соли используется при вскрытии верхней эпигастральной артерии состоит из (в ммоль / л): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты ( HEPES), 10 глюкозы, 0,01 нитропруссид натрия (SNP),г 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) с рН 7,4. Донор SNP НЕТ входит, чтобы помочь расслабиться гладкомышечных клеток, что делает их легче иглу артерию и для облегчения удаления клеток гладкой мускулатуры во время растирания.
- Диссоциации раствор: раствор соли используются при диссоциации эндотелиальной трубки состоит из (в ммоль / л): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 глюкозы, 2 CaCl 2 и 0,1% БСА, с рН 7,4. К 1 мл аликвоты этого буфера, добавьте: 0,62 мг / мл папаин, 1,5 мг / мл коллагеназы и 1,0 мг / мл дитиоэритритола. Поскольку ферменты от различных поставщиков могут иметь различные уровни активности ферментов, номера продуктов, которые используются для этой работы включены ссылки в таблице материалов для. Примечание: В протоколе как буфер диссоциации и диссоциации буфера с ферментами используются на различных этапах.
- Суперфузии решение: физиологический солевой раствор (PSS), используемый для superfusinг изолированный эндотелиальной трубки состоит из (в ммоль / л): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 глюкозы и 2 CaCl 2, с рН 7,4.
- Подготовка буферов и решения перед началом хирургических процедур. Удалите решения от 4 ° С и аликвоты 50 мл вскрытия буфера в колбу 200 мл Эрленмейера и поместить его на льду. Кроме того, аликвотные 50 мл диссоциации буфера без ферментов и поместить его на скамейке верхней, чтобы уравновесить до комнатной температуры. Снимите суперфузии решение от 4 ° С и позволить ему, чтобы уравновесить до комнатной температуры на поверхности стола.
2. Подготовка животных
Убедитесь, что все процедуры и протоколы с участием животных являются в соответствии с Национальными Институтами Руководство здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Процедуры, описанные здесь были утверждены уходу и использованию животных комитета университета поМиссури.
- Используйте мужской или женский мышей, по крайней мере 9 недель и изучать каждый в отдельности. Обезболить мышь пентобарбиталом натри (60 мг / кг) через внутрибрюшинно (IP) инъекции. Подсказка: Разбавление пентобарбитала 10 мг / мл в стерильном физиологическом растворе перед введением уменьшает возможность передозировки.
- Анестезия компромиссы регулирование температуры, так что держите мышь согреть сразу после первой инъекции пентобарбитала. Используя металлическую несущую (вентилируемые алюминиевая корзина) в верхней части нагревательной пластины (калиброванной до ~ 37 ° С) хорошо работает, чтобы держать стабильной температуры мыши. Вместо этого можно использовать инфракрасную лампу, заботясь, чтобы расположить его на соответствующем расстоянии от мыши. Монитор мышью каждые 5-10 минут, пока соответствующий уровень анестезии не будет достигнута (отсутствие вывода до пят или хвост щепотку). Дополнительный доза может потребоваться после 15-20 мин. Лучше всего, чтобы действовать медленно и осторожно, чтобы избежать передозировки, особенно с ожирением, в возрасте, или животногоы иначе подчеркнул.
- Удалить волосы с брюшной стороны, тщательно бритья его с небольшими ножницами шерсть домашних животных. Особое внимание должно быть принято, чтобы избежать травмы животного. Это полезно, чтобы удалить все волосы из области, охватывающей подмышки к лобковой области. Удалите свободно цепляясь волосы со свежим спиртовым тампоном.
- Поместите мышь на спине, лежа с обоих передних и задних конечностей разложенных выставить столько брюшной стенки, как это возможно. Если необходимо, используйте лабораторное ленту для фиксации ноги в орла с распростертыми крыльями образом.
3. Выделение артерии Улучшенный эпигастральной
- Сделать небольшой надрез через кожу чуть выше области лобковой области. Убедитесь, что только кожа сокращаются, избегая повреждения основного брюшной мышцы; продлить разрез с боков в каждом направлении, чтобы соответствующих задних конечностей. Продолжить разрез рострально вдоль вентральной срединной линии в верхней части грудной клетки ин продлить разрез в поперечном направлении в каждом направлении с соответствующими передних конечностей.
- Аккуратно поднимите кожу и используйте ножницы, чтобы разорвать соединительная ткань держит кожу к основной мышцы, тем самым подвергая всю поверхность брюшной мускулатуры (см. рисунок 3А). Промывать выставленный мышцы с комнатной температуры 0,9% солевого раствора.
- Из-за небольшого размера Море, Направление животное под стереомикроскопом для дальнейших процедур. Лифт жировой ткани, расположенной в нижней части грудины щипцами, и сделать разрез через него. Продолжить разрез вдоль нижнего ребра, убедившись, что не зайти слишком далеко в основной ткани. СЭО должны быть видны; заботиться, чтобы не повредить его. После того, как разрез будет завершена, орошать подвергаются ткани с комнатной температуры 0,9% солевого раствора.
- После того, как верхний слой скелетных мышц была втянута, море и основной мышцы легко идентифицируются. Совет: Обратите внимание на длинуСЭО в естественных условиях до изоляции расширить эндотелиальные трубки (которые укорачивают вокруг своей оси, при изоляции), чтобы приблизить свою первоначальную длину. Использование щипцов и ножниц, тщательно вырезать тонкую мышечный слой под морем.
- Использование угловые щипцы, пройти длину 6-0 шелковых шва под морем и перевязывать артерию и прилегающих к ней вену, чтобы держать его под давлением и кровь удерживается в просвете сосуда, чтобы облегчить визуализацию во время последующего выделения и очистки.
- Повторите процедуру перевязки СЭО на противоположной стороне.
- Как только оба СЭО были лигированы, сделать надрез вдоль средней линии брюшной мышцы, чтобы отделить соответствующие стороны.
- Расширение разрез в поперечном направлении в каждом направлении, что и для кожи, а затем продолжить разрез по вертикали вдоль внешнего края, чтобы полностью отделить брюшной мышцы из организма. Избегайте повреждения сосудистой подается на берегу моря, чтобы сохранить под давлением просвет.
- Сут СЭО над перевязки для поддержания печать, и поместите изолированную мышцу и артерии в 50 мл стакан, содержащий 10 мл 4 ° C рассечение буфера.
- Повторите процедуру для другой стороны живота и инкубировать ткани в буфере рассечение в течение 10 мин.
- Поместите брюшной мышцы, содержащий СЭО в охлажденном (4 ° С) рассечение камеру, содержащую рассечение буфера (см. рисунок 3B). Рассечение камера состоит из чашки Петри со слоем Sylgard (полидиметилсилоксана [PDMS]) в нижней части.
- Использование насекомых булавками (0,15 мм), растянуть изолированную СЭО и брюшной мышцы, чтобы приблизить Vivo длины в (указанных выше) и закрепить ее на Sylgard. Совет: Ориентируемся мышцы такой, что тонкий слой, обращенный к брюшины находится на вершине делает МОРЕ хорошо видна с помощью просвечивания.
- Используя тонкие микродиссекции инструментов и работает от вышестоящего месте перевязки кВыходной конец, не будет очищена на море с парного вены и окружающих тканей до первого капитального сайте филиала (1-2 см). Тогда акцизного СЭО путем разрезания его чуть выше сайт филиала и чуть ниже перевязки.
- Для удаления крови удерживается в просвете сосуда, иглу на море и смыть его с ледяным рассечение буфера. Использование кусок силиконовой трубки, установите заднюю конец канюли пипетки до 5 мл шприц, содержащий ледяной буфер рассечение и закрепите микропипетки в микроманипулятора позиционировать его кончик в рассечение камеры в иглу море.
- Как только все эритроцитов вымываются, удалите моря от катетеризации пипетки, и поднимите пипетки из рассечение блюдо.
- Разрежьте СЭО на более мелкие сегменты каждый 1-3 мм в длину. Эти более короткие сегменты облегчать отделение эндотелиальных трубок.
4. Выделение эндотелиальной Tube
- Заполните 12 мм х 75 мм стекла культ вЮр трубка полпути ледяной буфера рассечение. Использование угловые щипцы, передать артериальные части в пробирку и поместите на льду. В это время объединить переваривании ферментами с диссоциацией буфера до конечного объема 1 мл в отдельном 12 мм х 75 мм пробирку (см. 1.3.2 растворов) и предварительного нагрева раствора до 37 ° С с нагревательном блоке.
- В то время как буфер диссоциация и ферменты прогревается, тщательно аспирации буфер рассечение из культуральной трубы, оставляя небольшой объем содержащий сегменты сосудов.
- Аккуратно добавить номера температуры диссоциации буфера без ферментов, чтобы смыть оставшийся рассечение буфера. Совет: Добавить буфер диссоциации медленно, так что артериальные частей остаются на нижней части пробирку, чтобы сэкономить время ожидая их переселить. Повышение температуры буфера в течение нескольких шагах от льда (4 ° C), до комнатной температуры (~ 24 ° C), до 37 ° С, чтобы минимизировать шок.
- Тщательно аспирата dissociation буфер из культуральной трубки, снова будучи уверенным оставить небольшой объем содержащий сегменты сосудов.
- Снимите подогрева диссоциации буфера в присутствии ферментов нагревательного блока, перенести 1 мл раствора фермента в пробирку, содержащую сегменты сосудов, и поместите пробирку обратно в нагревательном блоке. Инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин.
- Во время инкубации с ферментами, готовят растиранием пипетки засыпки его с минеральным маслом и закрепить его на микрошприцом, который установлен в микроманипулятор. Затем убрать микрошприцом поршень, чтобы заполнить пипетку с 2 NL диссоциации буфера и положение пипетки через проточную камеру.
- В конце 30-минутной инкубации, удалить пробирку из нагревательного блока и тщательно аспирата буфера, как указано выше.
- Вымойте артериальные сегменты с 4 мл комнатной температуры диссоциации буфера. Примечание: Это больше нет необходимости держать SEGM сосудовЭнты в нижней части культуральной трубки; артериальные нарушения части на самом деле помогает гарантировать, что остаточные ферменты эффективно удаляются.
- Передача сегмент одно судно в камеру потока, осторожно аспирационных его с 1 мл микропипетки, и поместить его в камеру потока 1 мл буфера диссоциации.
- Используя микроманипулятор содержащий микрошприца, поместите кончик тритурационного пипетки около одного конца сегмента сосуда.
- Аспирируйте сегмент сосудов (500 NL сняты) в растирая пипетки медленно (225 нл / сек), так, чтобы не вызвать механическое напряжение в ЭК, а затем извлечь ее обратно в камеру. Если пищеварение было успешным, гладкомышечные клетки и адвентиции будет отделена от эндотелиальной трубки.
- Повторите растирание, пока все клетки гладких мышц не разобщены. Имейте в виду, что чрезмерное растирание (4x или более) может привести к повреждению ECs и сделать их не реагируют на агонисты. Совет:с помощью растирания пипетки переместить адвентиции от эндотелия трубы как можно скорее, чтобы сохранить его от запутывания трубку. Примечание: Использование Растирание пипетку, изолированный эндотелиальных трубка может быть отсасывали и переносили в отдельную камеру.
- Установите эндотелиальную трубку в центре камеры потока, выровненной вдоль направления потока, и удалить растиранием пипетки.
- Безопасные пиннинга пипетки в микроманипуляторов установлен на любом конце проточной камеры, и позиционировать свои вершины на соответствующих концах эндотелиальной трубки.
- Нижняя закрепляющее пипетку в течение одного конца трубки к прижать ее к нижней части камеры. Поместите второй фиксации в пипетку так же, на противоположном конце трубки. Примечание: Размещение пиннинга пипеток является компромисс между обеспечения трубку (ставящий их дальше от конца трубы) и позволяет более изображений / экспериментальной области (размещая их ближе к концу трубки). Доступ ткромка ~ 50 мкм от каждого конца трубки работает хорошо. Так же, как пиннинга пипетка касается трубку, медленно втягивать его вдоль оси трубы, тем самым расширяя его аппроксимировать в естественных длину, а затем нажать пипетку с нижней камере, чтобы обеспечить трубки.
- Начните поток суперфузии раствор, и дайте эндотелия трубка отдыхать не менее 20 мин, чтобы уравновесить и придерживаться (см. рис 3C). Использование перистальтического насоса для поддержания постоянного потока жидкости (суперфузии) через эндотелиальной трубки. Примечание: Закрепление пипетки может быть удалена после того, как эндотелиальный трубка прикреплен к нижней части камеры потока (~ 25 мин) или оставить на месте, чтобы обеспечить эндотелиальной трубки не смещаться.
5. Краска Погрузка и Кальций изображений
- Для визуализации внутриклеточных ответов кальция, загрузите эндотелия трубку с фтор-4 утра красителя при комнатной температуре (~ 24 ° С). Стоп потока текучей среды в ванне, а также добавить Fluo-4AM к камере при конечной концентрации 10 мкМ. Подождите 10 мин, чтобы позволить краситель проникать в клетки, а затем переливать эндотелиальную трубку свежим PSS в течение 20 мин, чтобы обеспечить внеклеточный краситель удаляется и что внутриклеточный краситель был полностью деэтерифицируют.
- Выполните визуализацию кальция. По этой работе, прямой микроскоп (см. фиг.2) снабжен конфокальной системы визуализации вращающийся диск был использован при комнатной температуре. Excite флуоресцентный краситель кальция с 491 нм лазера и получать изображения (при 500-550 нм излучения), используя усиленную цифровую камеру.
Representative Results
Ответы кальция может быть инициировано в свежевыделенных эндотелиальных трубок с использованием ацетилхолина (АХ). В этом фильме, эндотелия трубка загружен 10 мкМ Fluo-4 утра стимулируется суперфузии 1 мкМ АХ (Movie 1). Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм . Краситель возбуждается на 491 нм и эмиссии записывается с 500-550 нм, используя усиленную камеру устройства с зарядовой связью. Стеки изображения приобретаются на 120 кадров / сек в течение 25 сек и может быть в среднем (например, 40 кадр / с). Представительства флуоресцентные изображения с течением времени показаны на рисунке 4.
Рисунок 1. Расход камеру и пипетки, используемые в процессе выделения эндотелиальных трубок. B) Примеры вытащил (слева) и вытащил, сломанной, полированной и угловым (справа) катетеризации пипетки. Эта пипетка используется для промывки эритроцитов из просвета артерии следующее вскрытия. Шкала бар = 200 мкм. C) Примеры вытащил (слева) и вытащил, сломанные и полированной (справа) тритурационного пипетки. Внутренний диаметр этой пипетки определяется Внешний диаметр артерии. Шкала бар = 200 мкм. D) Примеры вытащил (слева) и вытащил, разбитого и полированной (справа) закрепления пипетки. Кончик этой пипетки округляется и полностью герметичен, чтобы закрепить эндотелия трубку в проточную камеру. Шкала бар = 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Вращающийся диск конфокальной микроскопии для визуализации Са 2 + сигналов.) Вертикальный микроскоп используется для работы с изображениями кальция. B) (а) блок конфокальной спиннинг диск с (б) усилились с зарядовой связью Камера устройства. C) Погружные целей (а) 63x ( NA = 1) и (б) 20X (NA = 0,5) используется для работы с изображениями. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Выделение брюшной мышцы и превосходит в эпигастрии артерии. (то есть где суда должны быть лигированный). Шкала бар = 1 см. Б) Изолированный мышца живота (в одностороннем порядке) и SEA возлагали в рассечение камеры для микродиссекции. Красная стрелка указывает первый крупный сайт бифуркации моря (т. е. точки, в которой очистка судна останавливается). Шкала бар = 1 см. C) Изолированный эндотелия трубка сотового от моря. Дифференциальный интерференционный контраст образ эндотелиальной трубки следующем 1 ч инкубации при комнатной температуре. Эндотелиальный трубку орошали буфером при суперфузии 3 мл / мин. Шкала бар = 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Флуоресценции кальция в эндотелиальной трубки клеток. Представительства флуоресцентные изображения эндотелиальных трубки в ответ на стимуляцию 1 мкМ ацетилхолина.) Флуоресценции до стимуляции. B) флуоресценции эндотелия трубка на момент введения ацетилхолина, т = 0 сек. C) эндотелия трубка флуоресценции при Т = 5 сек. D) эндотелия трубка флуоресценции при Т = 10 сек. Е) эндотелия флуоресценции трубки при Т = 15 сек. F) эндотелия флуоресценции трубки при Т = 20 сек. Масштабные бары = 40 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Discussion
Здесь мы опишем изоляцию эндотелиальных трубок от моря и использование этого препарата для визуализации Ca 2 + сигнализации события в своем учредительном ЭК. Эта процедура была приспособлена от одного первоначально разработанной для изоляции эндотелиальные трубки от артериол хомяк мышц кремастер 8. Используя незначительные изменения в техниках здесь, мы выделили эндотелиальные трубки из различных сосудистых бассейнах, в том числе: кормовых артерий хомяк втягивающего мышцы и щеку мешок артериол 10, мыши высшего эпигастральной артерии 6,7,9, мыши брыжеечной и церебральная артерии и лимфатические микрососудов (неопубликованные наблюдения; ссылки включены для изоляции сосудов брыжейки 12 и сосудов головного мозга 13). Изоляция эндотелиальные трубки от новых сосудистых бассейнах может потребовать изменения в оригинальной протокола. Если изоляция не удалась, то лучше начать с изменения раз пищеварения:Увеличение времени пищеварение, если эндотелиальные трубки трудно отделить от гладкомышечных клеток и адвентиции и сократить время пищеварения, если эндотелиальной трубки не остается неповрежденной. Если изменения раз пищеварения неудачно, регулируя концентрацию пищеварения ферментов или температуру пищеварения должны предстать перед судом. Другой вариант заключается в уменьшении внутреннего диаметра растиранием пипетки, что увеличивает усилие сдвига при удалении гладкомышечных клеток. Увеличение скорости выброса жидкости может быть также пытались с тем же эффектом, но, скорее всего, привести к повреждению препарат. Следует признать, что оно не может быть возможным выделить неповрежденные эндотелиальные трубки из сосудов, в которых эндотелиальные клетки не очень хорошо соединены друг с другом с помощью соединительных белков.
Разобщенность гладкомышечных клеток следующем ферментативного расщепления был первоначально осуществляется с помощью ручной стиль пипетки 8. Мы усовершенствовали процедуру растирания с помощью microsyrСистема Инге, что позволило последовательно изоляцию более эндотелиальных трубок (до 3 мм) 6. При использовании этой системы, растирание пипетки заполняют минеральным маслом, чтобы обеспечить непрерывную столба жидкости между поршнем управления перемещением жидкости и PSS, содержащий сегмент сосуда. Несжимаемости жидкости вместе с постоянной движущей силой микрошприцом результатов поршень в постоянном сдвиге в качестве сосуда продавливают через кончика пипетки. В противоположность этому, методы руки часто используемые для диссоциации клеток (например, сжимая резиновую грушу в конце пипетки Пастера) включает сжатие воздуха, который вводит изменчивость в давлении вождения и, таким образом, сдвиг, оказываемое на кончика пипетки.
Есть несколько преимуществ для подготовки труб для изучения функции эндотелия в микрососудов. Во-первых, процесс изоляции обеспечивает различные однородные родные клеточные популяции ЭК и гладкой муSCLE клетки. Поскольку ЭК остаются физически подключен как трубы, они отличаются от индивидуальных клеток гладких мышц, которые сохраняют конфигурацию "C", если они остаются расслабился во время растирания. Таким образом соответствующие типы клеток легко отличить, например, при получении образцов для молекулярных методов, таких как ПЦР в реальном времени и иммуногистохимии 10. Поскольку несколько труб изолированы от одного сосуда (или из двусторонних сосудов, что и для SEA), молекулярные данные и функциональные данные могут быть получены из тех же самых сосудах данного животного. Таким образом молекулярная выражение может быть связано с функциональной поведения микрососудистой эндотелия. Кроме того, события и внутри-и межклеточные сигнальные присущие микрососудов эндотелия могут быть решены независимым от влияния гемодинамических сил (давления, расхода), вазоактивных агентов, проведенных в крови (например, гормонов), или от окружающих клеток гладкой мускулатуры (например,60; через myoendothelial связи 14-16), нервы 17, или ткань паренхимы 18.
Важно отметить, что так как эндотелий недавно выделен из указанных микрососудов, нет изменение фенотипа, который в противном случае связан с культивирования ECS 19-21. Например, культивируемые ЭК потерять мускариновый экспрессии рецептора и тем самым изменить свои профили сигнализации кальция. Кроме того, электрофизиологические свойства ЭК можете изменить в культуре 22. Поскольку отдельные ЭК остаются соединены через функциональных щелевых контактов каналов, эндотелия трубка представляет собой идеальную модель для изучения проводимость электрических и Са 2 + сигналов между клетками 6,7. Следует также признать, что диссоциированные гладкомышечных клеток легко учился с методами патч-зажим для дополнительных данных, лежащих в основе микрососудов функцию 23.
Основным ограничением в эндотелиальных трубки мOdel является неустойчивость препарата с увеличением температуры. В то время как наши препараты от моря доказали стабильной и здоровой при комнатной температуре окружающей среды (~ 24 ° C) и в течение нескольких часов при 32 ° С, морфологических и функциональная деградация происходят в менее чем за час при 37 ° С 9. Вторым важным ограничением эндотелиальной трубки является потеря myoendothelial развязок и присущих им доменов передачи сигналов, которые являются неотъемлемой частью функции ЕС в неповрежденной стенки сосуда 14-16. Следует также признать, что, в то время как более длинные трубки позволяют межклеточной сигнализации должны быть изучены в течение относительно большие расстояния 6, подготовка труб осложняется, поскольку они становятся больше, потому что она становится все более трудно полностью отделить окружающих клетки гладких мышц и адвентиции. Мы обнаружили, что трубы длиной более 1-2 мм и более трудно расположить и закрепить в проточную камеру. В противоположность этому, в то время как более короткие трубы (например, <1 мм) ЕСАBLE Ca 2 + и электрические сигналы подлежащие изучению 8, их трудно поддерживать в течение суперфузии в проточную камеру. Наконец, даже при оптимальном изоляции труб в двустороннем, недостаточно материала для традиционной количественной оценки экспрессии белка с помощью вестерн-блот, хотя иммуномечение обеспечивает индекс экспрессии белка и локализации. Несмотря на такие ограничения, эндотелия трубка представляет собой новый препарат для предоставления новому взглянуть на механизмы микрососудов эндотелиальной функции клетки в естественных условиях.
Disclosures
Ни один.
Acknowledgments
Авторы благодарят доктора Pooneh Багер и доктора Эрика Уэсткотта в редакционных комментариев в подготовке рукописи. Эта работа была поддержана крови Института Национальных Институтов Здоровья Национального сердца, легких и под номерами премии R37-HL041026 и R01-HL086483 к SSS и F32-HL107050 чтобы MJS. Этот контент исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
| Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
| Papain | Sigma | P-4762 | |
| Collagenase | Sigma | C-8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
| Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
| Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
| Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
| Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| 12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| 3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
| Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| 100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| 1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
| Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
| XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
| Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res. 78, 415-423 (1996).
- Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists. Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).
- Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).
- Busse, R., et al. EDHF: bringing the concepts together. Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).
- Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium. J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, 757-770 (2012).
- Cohen, K. D., Jackson, W. F. Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells. Microcirculation. 12, 169-182 (2005).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).
- Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries. Microcirculation. 15, 503-514 (1908).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).
- Bagher, P., et al. Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).
- Faraci, F. M., et al. Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).
- Emerson, G. G., Segal, S. S. Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ. Res. 87, 474-479 (2000).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).
- Tran, C. H., et al. Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).
- Nausch, L. W., et al. Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).
- Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction. J Physiol. 555, 459-469 (2004).
- Colden-Stanfield, M., et al. Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 61, 632-640 (1987).
- Brunner, F., Kukovetz, W. R. Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).
- Tracey, W. R., Peach, M. J. Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 70, 234-240 (1992).
- Adams, D. J., Hill, M. A. Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).
- Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles. Microcirculation. 4, 35-50 (1997).
