Summary
Presentamos una preparación para la visualización y manipulación de la señalización del calcio en el endotelio microvascular intacta nativo. Tubos endoteliales recién aisladas de las arterias de resistencia de ratones que suministran el músculo esquelético a retener en la morfología vivo y señalización dinámica dentro y entre las células vecinas. Tubos endoteliales pueden prepararse a partir de los microvasos de otros tejidos y órganos.
Abstract
El control del flujo de sangre por la vasculatura resistencia regula el suministro de oxígeno y nutrientes concomitante con la eliminación de subproductos metabólicos, como se ejemplifica mediante el ejercicio del músculo esquelético. Las células endoteliales (EC) se alinean en la capa íntima de todos los vasos de resistencia y desempeñan un papel clave en el control de diámetro (por ejemplo, la vasodilatación endotelio-dependiente) y, por lo tanto, la magnitud y la distribución del flujo sanguíneo del tejido. La regulación de la resistencia vascular en un ECS se efectúa por intracelular de Ca 2 + de señalización, lo que conduce a la producción de autacoides difusibles (por ejemplo, óxido nítrico y metabolitos del ácido araquidónico) 1-3 y hiperpolarización 4,5 que provocan relajación de las células del músculo liso. Por lo tanto la comprensión de la dinámica de la endotelial Ca 2 + señalización es un paso clave para la comprensión de los mecanismos que rigen el control de flujo de la sangre. El aislamiento de tubos endoteliales elimina variables de confusión asociadas con BLOOD en la luz del vaso y con la que rodea las células del músculo liso y los nervios perivasculares, que de otro modo influir en la estructura y la función de las CE. Aquí presentamos el aislamiento de tubos endoteliales de la arteria epigástrica superior (SEA) utilizando un protocolo optimizado para este buque.
Para aislar los tubos endoteliales de un ratón anestesiado, la SEA se liga in situ para mantener la sangre dentro de la luz del vaso (para facilitar la visualización durante la disección), y toda la hoja de los músculos abdominales se extirpa. La EAE es disecado libre de rodea las fibras del músculo esquelético y del tejido conjuntivo, la sangre se vacía desde la luz, y la digestión enzimática leve se realiza para permitir la retirada de la adventicia, nervios y células musculares lisas utilizando trituración suave. Estas preparaciones aisladas recién-de endotelio intacto conservan su morfología nativa, con ECs individuo permaneciendo funcionalmente acoplado a uno del otro, capaz de transferir química y eléctrica SIgnals intercelularmente través de uniones 6,7. Además de ofrecer una nueva visión de la biofísica de señalización de calcio y de membrana, estas preparaciones permiten los estudios moleculares de la expresión génica y la localización de la proteína dentro de endotelio microvascular nativa.
Introduction
En este protocolo, se describe el aislamiento de tubos de células endoteliales de la SEA ratón. El MAR surge de la sangre de la arteria torácica interna y suministros oxigenada a la musculatura abdominal anterior. Nuestro trabajo con el mar como un modelo es atribuible a ella proporcionando relativamente largos, segmentos de microvasos no ramificados que son muy adecuados para el estudio de los eventos de señalización intercelular que subyacen a la función del endotelio en el gobierno y la coordinación de la relajación de las células musculares lisas. Para aquellos interesados en los tejidos distintos de músculo esquelético, hemos encontrado que esta técnica pueden adaptar fácilmente para la obtención de tubos endoteliales de los microvasos de cerebro, el intestino y el sistema linfático.
Las características principales de este método son que las longitudes intactos (1-3 mm) de endotelio microvascular son aislados, asegurado contra un cubreobjetos de vidrio en una cámara de flujo en el que se superfundieron con PSS, y la imagen para el Ca 2 + señalización 7-9 oempalado por 6,8 la señalización eléctrica. Dentro de la cámara de flujo, la mitad superior de un tubo se expone a la solución de superfusión y responde a intervenciones experimentales, mientras que la mitad inferior (en contacto con el cubreobjetos) está protegido y permanece en reposo. Además de estudiar ambos Ca 2 + eventos de señalización intra-e intercelulares, tubos endoteliales pueden ser utilizados para cuantitativa-PCR en tiempo real para evaluar la expresión génica 6,10, inmunohistoquímica para investigar la expresión de proteína de 6,10, y estudios electrofisiológicos para definir las propiedades biofísicas de 6,11 conducción eléctrica.
Hay varias ventajas para la preparación de tubo endotelial para el estudio de la función endotelial. La primera es que el proceso de aislamiento proporciona una distinción simple entre dos poblaciones de células: células endoteliales (que permanecen en la formación de tubos) y células de músculo liso (disociado individualmente; típicamente "C" en forma cuandorelajado). Esto permite un muestreo selectivo y el estudio de las propiedades únicas subyacentes contribución respectivas células a la función de los vasos. En segundo lugar, este modelo permite la resolución de los eventos de señalización intrínseca al endotelio, independiente de la influencia del flujo de sangre, que rodea el músculo liso, nervios, y parénquima. En tercer lugar, el endotelio se estudió mientras recién aisladas, evitando de esta manera las alteraciones en la expresión de genes o proteínas asociadas con el cultivo de células.
Protocol
1. Preparación del Equipo: cámara de flujo, pipetas y Soluciones
- Cámara de flujo: Utilice una cámara de flujo con un 24 mm x 50 mm cubreobjetos de vidrio en la parte inferior de los tubos superfuse endoteliales aisladas (ver Figura 1A). Antes de montar la cámara, lavar los cubreobjetos de vidrio con ambos 3% de HCl y etanol al 70%, enjuague con agua ultrapura, y secar con gas nitrógeno.
- Pipetas: Tres tipos diferentes de las pipetas se utilizan durante el protocolo: canulación, trituración, y los clavos. Tanto la canulación y pipetas de colocación de clavos se pueden hacer antes de que el día del experimento, pero la pipeta de la trituración se deben hacer el día de, ya que requiere el conocimiento del diámetro del vaso con el tamaño del lumen apropiadamente.
- Pipetas de canulación: Con el fin de eliminar las células rojas de la sangre desde la luz, tirar los tubos capilares de vidrio borosilicato con un extractor micropipeta tener extremos largos y cónicos. Rompa los extremos con pinzas a un diámetro exterior ~ 30% leSS que la de las arterias (~ 50-80 M), y esmalte de fuego la punta para ser lisa (véase la Figura 1B). Es útil también ángulo de las puntas de las pipetas a aproximadamente 45 °.
- Pipetas Trituration: para disociar mecánicamente las células musculares lisas y adventicia de los tubos endoteliales, hacer pipetas trituración a partir de tubos capilares de vidrio de borosilicato. Preparar tubos capilares como anteriormente, y romper el extremo con fórceps. Consejo: Utilice un dispositivo de puntuación de vidrio para que sea más fácil para romper la pared más gruesa del vidrio pipeta trituración limpiamente. Romper la pipeta para el diámetro interno determinado en el día del experimento, aproximadamente 10-20 micras mayor que el del diámetro exterior del recipiente desde el que se pueden aislar tubos endoteliales. Esmalte de fuego los extremos rotos hasta que esté suave (Figura 1C).
- Fijación de pipetas: Para estabilizar el tubo endotelial dentro de la cámara de flujo, hacer pinning pipetas para asegurar el endotelio tUBE contra la parte inferior de la cámara de cubreobjetos. Tire de los tubos capilares de vidrio de la misma manera como las pipetas de canulación. Luego romper los extremos con pinzas para un diámetro de ~ 100 micras, y esmalte de fuego hasta que se sellan los consejos, redondeada y lisa (véase la Figura 1D). Nota: Si la punta de la pipeta fijar no está completamente sellado, el fluido entrará en el lumen y puede confundir los resultados experimentales.
- Soluciones: Preparar todas las soluciones en ultrapura (18.2 MΩ) H 2 O y esterilizar a través de un filtro de 0,2 micras. Asegúrese de que la osmolaridad de las soluciones es de entre 285-300 mOsm. Soluciones siguen siendo buenas por aproximadamente dos semanas cuando se almacenan a 4 ° C.
- Disección solución: La solución de sal que se usa durante la disección de la arteria epigástrica superior se compone de (en mmol / L): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico ( HEPES), 10 glucosa, 0,01 nitroprusiato de sodio (SNP), und 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) con un pH de 7,4. El donante SNP NO se incluye para ayudar a relajar las células musculares lisas, lo que los hace más fáciles de cateterizar la arteria y para facilitar la extracción de células musculares lisas durante la trituración.
- Solución de disociación: La solución de sal utilizada durante la disociación del tubo endotelial se compone de (en mmol / L): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 glucosa, 2 de CaCl 2, y 0,1% de BSA, con un pH de 7,4. A una alícuota de 1 ml de este tampón, añadir: papaína 0,62 mg / ml, 1,5 mg / ml de colagenasa y 1,0 mg / ml de ditioeritritol. Puesto que las enzimas de diferentes proveedores pueden tener diferentes niveles de actividad enzimática, se incluyen los números de los productos de los que se utilizan para este trabajo de referencia en la tabla de materiales. Nota: Durante el protocolo tanto de tampón de disociación y tampón de disociación con enzimas se utilizan en diferentes pasos.
- Solución de superfusión: La solución salina fisiológica (PSS) utilizado para superfusing del tubo endotelial aislado se compone de (en mmol / L): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 glucosa y 2 de CaCl 2, con un pH de 7,4.
- Preparar los tampones y soluciones antes de comenzar los procedimientos quirúrgicos. Retire las soluciones de 4 ° C y la alícuota de 50 ml de tampón de disección en un matraz Erlenmeyer de 200 ml y colocarlo en hielo. Además, alícuotas de 50 ml de tampón de disociación sin enzimas y la colocan en la mesa de trabajo que se equilibre a temperatura ambiente. Eliminar la solución de superfusión de 4 ° C y deje que alcance la temperatura ambiente en la mesa de trabajo.
2. Preparación de los animales
Asegúrese de que todos los procedimientos y protocolos que involucran animales están de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de la Universidad de Cuidado Animal y UsoMissouri.
- Utilice macho o hembras de ratón por lo menos 9 semanas de edad y estudiar cada uno individualmente. Anestesiar a un ratón con pentobarbital sódico (60 mg / kg) a través de inyección intraperitoneal (ip). Consejo: La dilución de la pentobarbital a 10 mg / ml en solución salina estéril antes de la inyección reduce la posibilidad de sobredosis.
- Anestesia compromete regulación de la temperatura, por lo que mantener el ratón calentar inmediatamente después de la primera inyección de pentobarbital. El uso de un soporte metálico (cesta de aluminio ventilada) en la parte superior de una placa de calentamiento (calibrada a ~ 37 ° C) funciona bien para mantener la temperatura del ratón estable. También puede utilizar una lámpara de calor, teniendo cuidado de colocarlo a una distancia apropiada desde el ratón. Monitorear el ratón cada 5-10 min hasta que se alcance el nivel adecuado de anestesia (falta de retirada a los pies o pellizcar la cola). Una dosis suplementaria puede ser necesaria después de 15-20 min. Es mejor proceder lentamente y con precaución para evitar sobredosis, especialmente con la obesidad, edad, o animals subrayado lo contrario.
- Retire el cabello de la cara ventral cuidadosamente afeitado con pequeñas máquinas de cortar el pelo del animal doméstico. Debe tenerse especial atención para evitar el trauma al animal. Es útil para eliminar todo el vello de un área que abarca las axilas a la zona púbica. Retire cualquier pelo suelto apego con un hisopo fresco alcohol.
- Coloque el ratón sobre su espalda, acostado con tanto a proa-y las extremidades traseras extendidas para exponer la mayor cantidad de la pared abdominal como sea posible. Si es necesario, use cinta de laboratorio para asegurar las piernas de una manera propagación águila.
3. El aislamiento de la arteria epigástrica superior
- Haga una pequeña incisión a través de la piel justo por encima del área de la región púbica. Asegúrese de que sólo la piel se corta, evitando daños en el músculo abdominal subyacente; extender la incisión lateralmente en cada dirección a respectivos miembros posteriores. Continuar la incisión rostral a lo largo de la línea media ventral a la parte superior de la caja torácica y elN extender la incisión lateralmente en cada dirección a las respectivas extremidades anteriores.
- Levante suavemente la piel y el uso de tijeras para cortar el tejido conectivo que sostiene la piel al músculo subyacente, exponiendo de este modo toda la superficie de la musculatura abdominal (véase la Figura 3A). Riegue el músculo expuesto a temperatura ambiente la solución salina al 0,9%.
- Debido al pequeño tamaño de la SEA, coloque el animal debajo de un microscopio estereoscópico para procedimientos adicionales. Levante la almohadilla de grasa localizada en la parte inferior del esternón con una pinza, y hacer una incisión a través de él. Continuar la incisión a lo largo de la costilla inferior, asegurándose de no cortar demasiado profundamente en el tejido subyacente. La EAE debe ser visible, teniendo cuidado para no dañarla. Una vez que la incisión es completa, irrigar el tejido expuesto a temperatura ambiente la solución salina al 0,9%.
- Después de la capa superior del músculo esquelético se ha retraído, la SEA y el músculo subyacente son fácilmente identificables. Consejo: Tenga en cuenta la longitud deEl mar en vivo antes de aislar para extender los tubos endoteliales (que acortan lo largo de su eje sobre el aislamiento) para aproximar su longitud original. El uso de pinzas y tijeras, extirpar con cuidado la capa de músculo delgado debajo de la SEA.
- Con unas pinzas anguladas, pasar una longitud de sutura de seda 6-0 por debajo de la SEA y ligar la arteria y su vena adyacente a mantenerlo presurizado y la sangre retenida dentro de la luz del vaso para facilitar la visualización durante el posterior aislamiento y limpieza.
- Repita el procedimiento de ligadura de mar en el lado contralateral.
- Una vez que ambos mares se han ligado, hacer una incisión en la línea media de los músculos abdominales para separar las respectivas partes.
- Extender la incisión lateralmente en cada dirección como se hizo para la piel, y luego continuar la incisión verticalmente a lo largo del borde exterior para separar completamente el músculo abdominal del cuerpo. Evite los daños a la vasculatura alimentado por la SEA para mantener el lumen a presión.
- Cut la SEA por encima de la ligadura de mantener el sello, y colocar el músculo y la arteria aislada en un vaso de 50 ml que contiene 10 ml de 4 ° C buffer de disección.
- Repetir el procedimiento para el otro lado del abdomen y se incuban los tejidos en el tampón de disección durante 10 min.
- Coloque el músculo abdominal que contiene la SEA en un (4 ° C) cámara de disección que contiene tampón de disección fría (ver Figura 3B). La cámara de disección consiste en una placa de Petri con una capa de Sylgard (polidimetilsiloxano [PDMS]) en la parte inferior.
- El uso de los pins de insectos (0,15 mm), estire el mar aislado y el músculo abdominal a cabo para aproximar vivo longitudes (mencionados anteriormente) y fijarlo a la Sylgard. Consejo: Orientar el músculo de tal manera que la capa delgada hacia el peritoneo es en la parte superior hace que el SEA fácilmente visibles mediante transiluminación.
- La utilización de instrumentos de microdisección finos y trabajar desde el sitio aguas arriba de la ligadura hacia elextremo de aguas abajo, desactive la SEA de su vena emparejado y el tejido circundante hasta el primer sitio de la sucursal principal (1-2 cm). Luego cortar el SEA cortándola justo por encima del sitio de sucursal y justo debajo de la ligadura.
- Para extraer la sangre retenida dentro de la luz del vaso, canular la SEA y lavarlo con tampón de hielo disección fría. El uso de un trozo de tubo de silastic, conecte el extremo posterior de una pipeta de canalización a una jeringa de 5 ml contiene hielo búfer disección en frío y asegurar la micropipeta en un micromanipulador para posicionar la punta dentro de la cámara de disección para canular la SEA.
- Una vez que todos los eritrocitos son expulsadas, retire la SEA de la pipeta canulación, y levante la pipeta del plato de disección.
- Cortar la SEA en segmentos más pequeños cada 1-3 mm de longitud. Estos segmentos más cortos facilitar el aislamiento de tubos endoteliales.
4. Aislamiento del tubo endotelial
- Llenar un culto 12 mm x 75 mm de vidrioa mitad de camino del tubo Ure con hielo tampón de disección en frío. Con unas pinzas en ángulo, traslado de las piezas arteriales en el tubo de la cultura y el lugar en el hielo. En este momento, se combinan las enzimas de digestión con tampón de disociación a un volumen final de 1 ml en un tubo de cultivo de 12 mm x 75 mm separado (ver 1.3.2 Soluciones) y precalentar la solución a 37 ° C con un bloque de calentamiento.
- Mientras que el tampón de disociación y las enzimas están calentando, aspirar con cuidado el tampón de disección del tubo de cultivo dejando un pequeño volumen que contiene los segmentos de buques.
- Añadir suavemente tampón de disociación temperatura ambiente sin enzimas para lavar búfer disección restante. Consejo: Añada el tampón de disociación lenta de tal manera que las piezas arteriales se quedan en la parte inferior del tubo de cultivo para ahorrar tiempo esperando a reasentarse. Elevar las temperaturas de amortiguamiento a través de múltiples pasos de hielo (4 ° C), a temperatura ambiente (~ 24 ° C), a 37 ° C para minimizar el choque.
- Aspirar con cuidado la dissociation más protección contra el tubo de la cultura, de nuevo asegurándose de dejar un pequeño volumen que contiene los segmentos de buques.
- Eliminar el tampón de disociación de precalentamiento con enzimas de el bloque de calentamiento, transferir los 1 ml de solución de enzima al tubo de cultivo que contiene los segmentos de vasos, y colocar el tubo de cultivo de nuevo en el bloque de calentamiento. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
- Durante la incubación con enzimas, preparar la pipeta trituración, rellenar con aceite mineral y fijarlo en una microjeringa que se monta en un micromanipulador. Luego retraiga el émbolo microjeringa para llenar la pipeta con 2 nl de tampón de disociación y la posición de la punta de la pipeta sobre la cámara de flujo.
- Al final de la incubación de 30 minutos, retirar el tubo de cultivo desde el bloque de calefacción y cuidadosamente aspirar el tampón que antes.
- Lavar los segmentos arteriales con 4 ml de tampón de disociación temperatura ambiente. Nota: Ya no es necesario mantener el segm buquepadres en la parte inferior del tubo de cultivo; perturbar las piezas arteriales en realidad ayuda a asegurar que las enzimas residuales se eliminan eficazmente.
- Transferencia segmento de un recipiente a la cámara de flujo por aspiración suavemente con una micropipeta de 1 ml, y colocarlo en la cámara de flujo con 1 ml de la memoria intermedia de disociación.
- Utilizando el micromanipulador que contiene la microjeringa, posicionar la punta de la pipeta trituración cerca de un extremo del segmento de vaso.
- Aspirar el segmento de vaso (500 nl retirado) en la pipeta triturar lentamente (225 nl / seg), a fin de no causar la tensión mecánica a la EC, y luego expulsar de nuevo en la cámara. Si la digestión se ha realizado correctamente, las células del músculo liso y la adventicia se pueden disociar de tubo endotelial.
- Repita la trituración hasta que se disocian todas las células del músculo liso. Tenga en cuenta que la trituración excesiva (4x o más) puede dañar el EC y hacerlos insensibles a agonistas. Consejo:usando la pipeta trituración, mover la adventicia de distancia desde el tubo endotelial tan pronto como sea posible para evitar que el tubo de enredo. Nota: El uso de la pipeta de la trituración, el tubo endotelial aislado puede ser aspirado y se transfiere a una cámara separada.
- Coloque el tubo endotelial en el centro de la cámara de flujo, alineados a lo largo de la dirección del flujo, y retirar la pipeta trituración.
- Pipetas de colocación de clavos seguros en micromanipuladores montados en cada extremo de la cámara de flujo, y la posición de sus puntas en los extremos respectivos del tubo endotelial.
- Bajar el fijar una pipeta sobre un extremo del tubo para presionarlo contra la parte inferior de la cámara. Coloque la segunda pipeta de colocación de clavos de la misma manera en el extremo opuesto del tubo. Nota: La colocación de las pipetas colocación de clavos es un equilibrio entre asegurar el tubo (colocándolos más lejos del extremo del tubo) y permitiendo una mayor formación de imágenes / área experimental (colocándolos más cerca del extremo del tubo). Localización de tdobladillo ~ 50 m de cada extremo del tubo funciona bien. Así como la pipeta fijar toca el tubo, lentamente retraer a lo largo del eje del tubo, extendiendo así a aproximar en longitud in vivo y, a continuación pulse la pipeta contra el fondo de la cámara para asegurar el tubo.
- Comience el flujo de la solución de superfusión, y permitir que el tubo endotelial en reposo durante al menos 20 min para equilibrar y cumplir (ver Figura 3C). Utilizar una bomba peristáltica para mantener el flujo de fluido constante (superfusión) a través del tubo endotelial. Nota: pipetas del Prendedor pueden eliminarse una vez que el tubo endotelial se ha adherido a la parte inferior de la cámara de flujo (~ 25 min) o hacia la izquierda en el lugar para asegurar el tubo endotelial no se desaloja.
5. Tinte Carga y Imagen de calcio
- Para visualizar las respuestas de calcio intracelular, cargar el tubo endotelial con Fluo-4 a.m. colorante a temperatura ambiente (~ 24 ° C). Detener el flujo de fluido en el baño, y añadir Fluo-4AM a la cámara a una concentración final de 10 mM. Espere 10 min para permitir que el tinte entre en las células, a continuación, superfuse el tubo endotelial con PSS fresca durante 20 minutos para asegurar que se retira de tinte extracelular y que tinte intracelular ha sido esterificado de Fully.
- Realizar imágenes de calcio. Para este trabajo, un microscopio vertical (ver Figura 2) equipado con un sistema de imagen confocal de disco giratorio se utiliza a temperatura ambiente de la habitación. Excite el colorante fluorescente de calcio con un láser de 491 nm y adquirir imágenes (a 500-550 nm de emisión) mediante una cámara digital intensificado.
Representative Results
Respuestas de calcio pueden ser iniciados en tubos endoteliales aisladas recientemente utilizando la acetilcolina (ACh). En esta película, un tubo endotelial cargado con 10 mM fluo-04 a.m. se estimula con superfusion de 1 M ACh (Película 1). Haga clic aquí para ver la película . El colorante se excitó a 491 nm y emisión se registra 500-550 nm utilizando una cámara de dispositivo de carga acoplada intensificado. Pilas de imágenes son adquiridas a 120 fotogramas / segundo durante un periodo de 25 segundos y luego se pueden promediar (por ejemplo, a 40 cuadros / seg.) Imágenes de fluorescencia representativos lo largo del tiempo se muestran en la Figura 4.
Figura 1. Cámara y pipetas utilizadas durante el aislamiento de tubos endoteliales de flujo. A) La cámara de flujo montado con un 24 mm x 50 mm cubreobjetos de vidrio como la base. B) Ejemplos de una tirada, rota, pulido y en ángulo (derecho) de la pipeta canulación tirado (izquierda) y. Esta pipeta se utiliza para eliminar los eritrocitos de la luz de la arteria después de la disección. Barra de escala = 200 m. C) Ejemplos de una tirada, rota y pulida (derecha) de la pipeta trituración tirado (izquierda) y. El diámetro interno de esta pipeta se determina por el diámetro exterior de la arteria. Barra de escala = 200 m. D) Ejemplos de una pipeta derecha) fijando tirado, roto y pulido (tirado (izquierda) y. La punta de este pipeta se completa y completamente sellado para asegurar el tubo endotelial en la cámara de flujo. Barra de escala = 200 micras. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Spinning disco microscopio confocal de imágenes de Ca 2 + señales. A) microscopio vertical utilizado para imágenes de calcio. B) (a) unidad de disco giratorio confocal con un (b) la intensificación de la cámara del dispositivo de carga acoplada. C) objetivos de inmersión (a) 63X ( NA = 1) y (b) 20X (NA = 0,5) utilizó para la imagen. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. El aislamiento del músculo abdominal y la arteria epigástrica superior. Una (es decir, donde los buques deberían estar ligados). Barra de escala = 1 cm. B) músculo aislado abdominal (unilateral) y SEA clavado en una cámara de disección para microdisección. La flecha roja indica el primer lugar de la bifurcación principal de la evaluación ambiental estratégica (es decir, el punto en que se detiene la limpieza del buque). Barra de escala = 1 cm. C) tubo aislado de las células endoteliales a partir de una evaluación ambiental estratégica. Imagen de contraste de interferencia diferencial de un tubo endotelial siguiente 1 h de incubación a temperatura ambiente. El tubo endotelial se superfused con tampón de superfusión a 3 ml / min. Barra de escala = 50 micras. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 4. La fluorescencia de calcio en un tubo celular endotelial. Imágenes fluorescentes representativos de un tubo endotelial en respuesta a la estimulación con 1 M de acetilcolina. Un) de fluorescencia antes de la estimulación. B) de fluorescencia de tubo endotelial en el momento de la administración de acetilcolina, t = 0 seg. C) de la fluorescencia de tubo endotelial en t = 5 seg. D) la fluorescencia de tubo endotelial en t = 10 seg. E) de fluorescencia de tubo endotelial en t = 15 seg. F) de fluorescencia de tubo endotelial en t = 20 seg. Las barras de escala = 40 micras. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Discussion
Aquí se describe el aislamiento de tubos endoteliales de la SEA y el uso de este preparado para visualizar Ca 2 + señalización de eventos dentro de su constitutiva ECs. Este procedimiento fue adaptado de uno originalmente desarrollado para aislar tubos endoteliales de las arteriolas del músculo cremáster hámster 8. Utilizando pequeñas variaciones de las técnicas presentadas aquí, hemos aislado tubos endoteliales de una variedad de lechos vasculares, entre ellos: las arterias de alimentación del músculo retractor del hámster y la mejilla arteriolas bolsa 10, ratón de la arteria epigástrica superior 6,7,9, mesentérica y cerebral del ratón arterias y microvasos linfáticos (observaciones no publicadas; referencias se incluyen para aislar los vasos mesentéricos 12 y 13 vasos cerebrales). Aislar los tubos endoteliales de nuevos lechos vasculares puede requerir modificaciones en el protocolo original. Si el aislamiento no es satisfactoria, lo mejor es comenzar por la alteración de los tiempos de digestión:Aumentar el tiempo de digestión si tubos endoteliales son difíciles de aislar a partir de células de músculo liso y la adventicia y reducir el tiempo de digestión si el tubo endotelial no permanece intacta. Si la alteración de los tiempos de digestión no se realiza correctamente, el ajuste de la concentración de enzimas de digestión o la temperatura de digestión debe ser juzgado. Otra opción es reducir el diámetro interno de la pipeta de la trituración, lo que aumenta la fuerza de cizallamiento en la eliminación de células del músculo liso. El aumento de la velocidad de eyección de fluido también puede ser juzgado por el mismo efecto, pero es más probable que dañe la preparación. Se debe reconocer que puede que no sea posible aislar los tubos endoteliales intactas de los vasos en los que las células endoteliales no están bien conectados entre sí por las proteínas de unión.
La disociación de las células musculares lisas después de la digestión enzimática se llevó a cabo inicialmente utilizando una pipeta de estilo mano 8. Hemos perfeccionado el procedimiento de trituración utilizando un microsyrsistema de inge, lo que ha permitido el aislamiento constante de tubos endoteliales más largos (hasta 3 mm) 6. Cuando se utiliza este sistema, la pipeta de la trituración se rellena con aceite mineral para proporcionar una columna de fluido continuo entre el pistón para controlar el movimiento de fluido y PSS que contiene el segmento de vaso. La incompresibilidad del fluido a lo largo con la fuerza de accionamiento constante de los resultados de pistón en microjeringa de cizallamiento constante a medida que el recipiente es forzado a través de la punta de la pipeta. En contraste, las técnicas de mano a menudo utilizados para las células de disociación (por ejemplo, apretando el bulbo de goma en el extremo de una pipeta Pasteur) implica la compresión de aire, que introduce variabilidad en la presión de conducción y, por lo tanto, de cizallamiento ejercidas en la punta de la pipeta.
Hay múltiples ventajas a la preparación tubo para el estudio de la función endotelial en microvasos. La primera es que el proceso de aislamiento proporciona distintas poblaciones celulares nativas homogéneos de ECS y mu suavecélulas SCLE. Dado que la EC permanecen conectados físicamente como tubos, que son distintas de las células musculares lisas individuales, que conservan una configuración en "C" si permanecen relajados durante la trituración. Por lo tanto respectivos tipos de células se distinguen fácilmente, por ejemplo, en la obtención de muestras para técnicas moleculares tales como PCR en tiempo real e inmunohistoquímica 10. Desde múltiples tubos están aislados de un solo vaso (o de buques bilaterales como se hizo para la EAE), los datos moleculares y funcionales de datos se pueden obtener de los mismos buques de un animal determinado. Por lo tanto la expresión molecular puede ser correlacionada con el comportamiento funcional del endotelio microvascular. Además, los eventos de señalización tanto intra e intercelular intrínsecas al endotelio microvascular se pueden resolver independiente de la influencia de fuerzas hemodinámicas (presión, caudal), agentes vasoactivos realizadas en el flujo de la sangre (por ejemplo, hormonas), o a partir de células de músculo liso que rodean (por ejemplo,60; mediante acoplamiento mioendoteliales 14-16), los nervios 17, o del parénquima del tejido 18.
Es importante destacar que, puesto que el endotelio está recién aisladas de microvasos designados, no hay alteración de fenotipo que está asociado de otro modo con el cultivo de EC 19-21. Por ejemplo, los CE cultivadas pierden la expresión de los receptores muscarínicos y por ende alteran en sus perfiles de señalización de calcio. Además, las propiedades electrofisiológicas de las EC pueden cambiar en la cultura 22. Debido a que los CE individuales permanecen acoplados a través de canales de unión funcional brecha, el tubo endotelial presenta un modelo ideal para el estudio de la conducción de señales eléctricas 2 + y Ca entre las células 6,7. También debe reconocerse que las células del músculo liso disociadas se estudian fácilmente con técnicas de patch-clamp para los datos complementarios subyacentes función microvascular 23.
Una limitación clave al tubo endotelial mOdel es la inestabilidad de la preparación con el aumento de temperatura. Mientras los preparativos de la SEA ha demostrado estable y sano a temperatura ambiente (~ 24 º C) y durante varias horas a 32 ° C, la degradación morfológica y funcional ocurre en menos de una hora a 37 ° C 9. Una segunda limitación importante del tubo endotelial es la pérdida de las uniones mioendoteliales y sus dominios de señalización inherentes que son esenciales para la función de la CE en la pared del vaso intacto 14-16. También debe reconocerse que, mientras que los tubos más largos permiten la señalización intercelular a ser estudiado sobre distancias relativamente grandes 6, preparación de tubos es complicada, ya que se hacen más largos, ya que se vuelve más difícil de disociar completamente rodea las células del músculo liso y la adventicia. Hemos encontrado que los tubos de más de 1-2 mm también son más difíciles de colocar y asegurar en la cámara de flujo. Por el contrario, mientras que los tubos más cortos (por ejemplo, <1 mm) enables Ca 2 + y eléctricos señales a ser estudiados 8, que son difíciles de mantener durante superfusión en la cámara de flujo. Finalmente, incluso con aislamiento óptimo de tubos bilateralmente, hay material suficiente para la cuantificación tradicional de expresión de la proteína usando transferencias Western, aunque inmunomarcaje proporciona un índice de expresión de la proteína y la localización. A pesar de estas limitaciones, el tubo endotelial representa una nueva preparación para proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de la función celular endotelial microvascular en vivo.
Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Dr. Pooneh Bagher y la Dra. Erika Westcott los comentarios editoriales en la preparación del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre de los Institutos Nacionales de Salud de los números de los premios R37-HL041026 y R01-HL086483 de SSS y F32-HL107050 de MJS. Este contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
| Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
| Papain | Sigma | P-4762 | |
| Collagenase | Sigma | C-8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
| Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
| Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
| Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
| Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| 12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| 3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
| Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| 100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| 1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
| Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
| XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
| Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |
References
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