Summary
Met effector functies te onderscheiden van andere T-cel subsets, zijn Th17 cellen centraal zijn betrokken bij inflammatoire auto-immuniteit. Deze in vitro Th17 differentiatie protocol verschaft een middel om te bepalen of naïeve CD4 + T-lymfocyten kunnen differentiëren in Th17 cellen en hun rol bij auto-immuniteit en gastheerrespons verder te onderzoeken.
Abstract
Th17 cellen zijn een afzonderlijke subset van T-cellen die zijn gevonden produceren interleukine 17 (IL-17) en verschillen in functie van het andere T-cel subsets zoals Th1, Th2 en regulatoire T-cellen. Th17 cellen hebben zich ontwikkeld tot een centrale boosdoener in overijverige inflammatoire immuunreacties geassocieerd met vele auto-immuunziekten. In deze methode zuiveren we T-lymfocyten uit de milt en lymfeknopen van C57BL / 6 muizen, en onder controle en Th17-inducerende omgevingen stimuleren gezuiverde CD4 + T-cellen. De Th17 inducerende omgeving omvat stimulatie in aanwezigheid van anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen, IL-6 en TGF-β. Na incubatie gedurende ten minste 72 uur en tot vijf dagen bij 37 ° C worden de cellen vervolgens geanalyseerd op het vermogen om IL-17 te produceren door middel van flowcytometrie, qPCR en ELISA. Th17 gedifferentieerde CD4 + CD25-T-cellen kunnen worden gebruikt voor de opheldering van de rol die Th17 cellen spelen in het ontstaan en de progressie van auto-immuniteit en de ontvangendefense. Bovendien kan Th17 differentiatie van CD4 + CD25-lymfocyten van verschillende muizen knockout / ziektemodellen tot ons begrip van cellot plasticiteit.
Introduction
CD4 + T-lymfocyten (T-cellen) spelen een cruciale rol in het immuunsysteem gemedieerde bescherming tegen infectieuze micro-organismen. Omgekeerd T-cellen zijn ook nauw verbonden met het begin en de progressie van auto-immuunziekten zoals type 1 diabetes, systemische lupus erythematosus en reumatoïde artritis. CD4 + T-lymfocyten geactiveerd worden door een combinatie van T-celreceptor (TCR) interacties met verwant antigeen / transplantatieantigenen II (MHCII) moleculen en CD28 receptor interacties met B7.1/B7.2 liganden 15. Naast het leveren van TCR stimulatie en CD28 co-stimulatie, antigeenpresenterende cellen ook een cytokine omgeving, waarin de differentiatie status van T lymfocyten bepaalt, waardoor de reactie van de T-lymfocyt aan de leiding bepaald antigeen. Verschillende pathogeen / antigeen-presenterende cel interacties maken verschillende cytokine omgeving, die scheef T lymfocyten beneden verschillende paden gericht op het eliling van het initiëren ziekteverwekker. Helaas, T-lymfocyten effector signaalwegen, oorspronkelijk ontworpen om te roeien binnendringende ziekteverwekkers, kunnen worden ten onrechte gericht tegen eigen weefsels-15. Daarom is een beter begrip van differentiatie staat elke afzonderlijke CD4 + T cel subsets is van cruciaal belang voor ons begrip van hoe de balans tussen de eliminatie van ziekteverwekkers en tolerantie om zelf te moduleren.
Naast de Th1, Th2 en induceerbare regulatoire T cel differentiatie signaalwegen, kan naïeve T-lymfocyten ook worden aangedreven door cytokinen door het Th17 weg. Dat Th1-cellen bestrijden intracellulaire pathogenen, Th2 cellen te elimineren extracellulaire pathogenen en regulerende T-cellen (Tregs) minimaliseren ontstekingsreacties 1, 16, Th17 cellen een belangrijke rol spelen bij de eliminatie van extracellulaire bacteriën en schimmels. Th17 cellen worden algemeen aangeduid door expressie van het geslacht-specifieke transcriptiefactor RORγT en productie van IL-17A, die de activatie van macrofagen en neutrofielen 1, 7 bevordert.
Th17 cellen zijn betrokken bij verschillende auto-immuunziekten en bijbehorende diermodellen. Zo is aangetoond dat IL-23 (die nodig is om de Th17 fenotype sustain), maar niet IL-12, was de centrale schuldige in experimentele autoimmune encefalitis (EAE), het knaagdier ziektemodel voor MS. Het is vervolgens aangetoond dat een verlaging van IL-17 productie samenhangen met EAE preventie 2, 6, 17. Bovendien zijn Th17 cellen geassocieerd met andere auto-immuunziekten zoals artritis en systemische lupus erythematosus (SLE) 10, 16. IL-23 deficiënte p19 - / - muizen bleken zeer lage aantallen Th17 cellen, en zijn bestand tegen de ontwikkeling niet alleen EAE, maar ook collageen-geïnduceerde artritis, een model voor reumatoïde artritis 10, 18. Bovendien muizen behandeld met neutraliserende antilichamen IL-17A after het begin van de collageen-geïnduceerde artritis werden ook gevonden op de resolutie van gewrichtsschade 18 hebben. Opgemerkt zij dat de rol van Th17 cellen in de progressie van auto-immuunziekte nog worden gekarakteriseerd als recent onderzoek heeft ook aangetoond een beschermende rol van Th17 cellen bij type 1 diabetes 9, 11 en darmontsteking 14. Deze studies bevestigen het belang van Th17 differentiatie in auto-immuniteit.
In vitro Th17 differentiatie is een noodzakelijke methode in T-cel onderzoek, omdat er ten minste twee verwarrende vragen die nader onderzoek vereisen: 1) Hoe precies doet IL-6 regelen de balans tussen Treg en Th17 differentiatie, en 2) wat zijn de exacte mechanismen achter IL-17-geïnduceerde inflammatoire aandoeningen? Onze methode maakt gebruik van CD4 + CD25-T-cellen van de milt en de lymfeklieren van de C57BL / 6 muis. Het is belangrijk op te merken dat, hoewel het mogelijk is Th17 differentiatie induceren met een onzuiverebevolking, het verwerven van tenminste een 80% zuivere CD4 + CD25-T-cel populatie ontkent enige zorg van verontreiniging en zorgt voor meer succes Th17 differentiatie resultaten. Om een goede Th17 differentiatie bereiken zijn CD4 + CD25-T-cellen geïncubeerd in de aanwezigheid van anti-CD3 en anti-CD28, die activatie signalen, 1 en 2, respectievelijk, en IL-6, en TGF-β. Hoewel is beschreven dat IL-23 alleen kan worden gebruikt om Th17 differentiatie bereiken, werd later aangetoond dat IL-23 is noodzakelijk voor de stabiliteit van de Th17 celpopulatie, maar IL-6 en TGF-β zijn essentieel voor Th17 differentiatie 3, 18, 19. Murine studies hebben aangetoond dat IL-23 receptor tot expressie wordt gebracht op CD4 + T-cellen nadat ze zijn gestimuleerd met IL-6 en TGF-β 13, 18. Ook zal Th17 cellen succesvol ontwikkelen in de aanwezigheid van IL-23-blokkerende antilichamen zolang IL-6 en TGF-β heden 18, 19 zijn. Als zodanig is deze Th17 differentiatie protocol provIdes de juiste voorwaarden om Th17 differentiatie succes induceren. Ontwikkeling van een beter begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen Th17 differentiatie en IL-17 productie voor te stellen de mogelijkheid voor de ontwikkeling van betere therapieën die gericht zijn op auto-immuunziekten 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke gebruik werd uitgevoerd in overeenstemming met protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite.
1. Voorbereiding van mengsels en Media
- Steriele PBS pH: 7,3 (1 L)
0,23 g NaH 2PO 4
1,15 g Na 2 HPO 4
9,0 g NaCl
Nemen volume met DI water. Steriliseren met autoclaaf. - Celkweek media (100 ml)
89 ml RPMI
10 ml 10% FBS
1 ml Antibiotica Anti-schimmel (ABAM) 100 ug 50 mM 2-mercapto-ethanol (3,5 pg voorraad 2-mercapto-ethanol in 96.5 ug PBS) - FACS buffer (TL Activating Cell Sorting) (Te gebruiken tijdens flowcytometrie) 2% FBS in steriele PBS
- iTh17 Mix (Gebaseerd op aantal monsters, bepalen de benodigde volume voor alle mengsels en media)
1,5 ug / ml anti-CD28
20 ng / ml IL-6
5 ng / mlTGF-β
2. Cellen worden in drievoud uitgeplaat onder de volgende voorwaarden
- Plaat gebonden anti-CD3, anti-CD28 (dit is de bedieningseenheid mix).
- iTH17: plaat gebonden anti-CD3, anti-CD28, IL-6, TGF-β.
3. -Plaat gebonden anti-CD3 (10 ug / ml)
Aanbevolen wordt de bereiding van plaat gebonden anti-CD3 platen geschiedt ten minste 4 uur voorafgaand aan het tijdstip cellen worden toegevoegd aan de platen.
- Voeg 30 pi anti-CD3 putjes (anti-CD3 wordt verdund in steriele PBS) van een nieuwe met 96 U bodem Microtest weefselkweekplaat en zijdelings op de plaat uniforme dekking van de putjes waarborgen. Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur en koel dan tot het tijd is om het mixen en cellen aan de plaat.
4. Muis Dissection
- Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van C57BL / 6 mice, 3-8 maanden oud, en gekocht van The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
- Sacrifice muis met behulp van CO 2 stikken, en bevestig de dood met aansluitend cervicale dislocatie.
- Steriliseren muizen dissectie-instrumenten en incisie met 70% ethanol en beginnen dissectie.
- Van de ventrale uitzicht, pak de huid die is juist voor de urethra opening en gaan knippen met een schaar van de ventrale middellijn tot aan de kin. Neem voorzorgsmaatregelen niet scheurt of gesneden in de voering van de peritoneale muur.
- Trek de huid en vastpinnen op comfortabele toegang naar de lymfeklieren mogelijk te maken tijdens het verwijderen.
- De lymfklieren en milten verzameld alle verwijderd met een pincet en geplaatst in een steriele petrischaal met 5 ml AutoMACS loopbuffer gekocht bij Miltenyi Biotec (zie figuren 2 en 3 voor lymfeklier en milt verwijdering diagrammen).
- Verwijder de oksellymfeknopen diegevonden in de buurt van de oksel (oksel) achter de borstspieren van elke muis.
- Verwijder de brachialis lymfeklieren die zich bevinden in het bindweefsel in de buurt van elke oksel.
- Verwijder de oppervlakkige cervicale lymfeknopen in de hals van elke muis.
- Verwijder de inguinale lymfeknopen die zich in de heup gebied bij de verbinding van de 3 bloedvaten.
- Voor toegang tot de lymfklieren, dwars door de peritoneale bekleding van de ventrale middellijn. Mesenteriale lymfeklieren in het bindweefsel dat de darmen elkaar houdt. Ze zijn meestal te vinden in een reeks van 4-8 knopen, en kan verschijnen als een "parelsnoer". Zorg ervoor te trekken uit de hele string.
- De milt is gelegen in de buikstreek, achter de maag en darmen. Verwijderen door te trekken en los te maken uit de alvleesklier.
- Grind organen onder een steriele kap met behulp van 2 mat microscoop dia's. Plaats lymfeknopen of milt opde matte kant van een microscoop dia, en wrijf met een matte kant van de tweede dia tot uiteengevallen. Herhaal dit tot alle lymfeknopen en milt werden gemalen.
Opmerking: Het wordt aanbevolen te beginnen met de lymfeklieren en eindig met de milt, terwijl het bloed zal het moeilijk maken om de resterende lymfeklieren in de AutoMACS buffer zien.
- Om gemalen organen filtreer in een enkele celsuspensie te beginnen door het vouwen van een vel 40 urn nylon materiaal meerdere malen, en het in de top van een 15 ml centrifugebuis. De nylon materiaal dient ongeveer 3 x 3 inch
- Gebruik een 5 ml spuit en 21 G naald om de 5 ml AutoMACS Running buffer en gemalen organen zuigen. Breng langzaam in de gevouwen nylon materiaal. Let er op dat aanprikken van het materiaal met de naald.
Opmerking: Wanneer enkele celsuspensie wordt bereikt, moet de oplossing weergegeven als een lichte, consistente oplossing zonder ZICHTBle stukjes vast weefsel. Indien vaste stoffen blijven opnieuw aspireren en afzien door een nieuwe opgevouwen nylon in een nieuwe 15 ml centrifugebuis.
- Altijd cellen op ijs wanneer niet in gebruik.
5. Cell Separation
- Voor een optimaal resultaat te verkrijgen ten minste een 80% zuivere CD4 + CD25-celpopulatie door AutoMACS Pro Cell Separator met de MACS CD4 + CD25 + regulatoire T-cel isolatie kit, muis. Het protocol voor de negatieve behoud van de CD4 + CD25-celpopulatie wordt verkregen door Miltenyi Biotec.
6. Th17 Differentiatie
- Verzamel de CD4 + CD25-celpopulatie na scheiding met de AutoMACS Pro Cell Separator.
- Tellen cellen verdund in een verhouding 1:1000 met trypaanblauw behulp van een hemocytometer.
- Na concentratie werd bepaald uit celtellingen Verdun celsuspensie tot 1 x 10 6 cellen / ml in celkweekmedium.
- Neem platen met 96 putjes met plaat gebonden anti-CD3 na 4 uur.
- Was anti-CD3-beklede putjes met 200 ui PBS. Herhaal 2 keer.
- Te wassen voeg 200 ul van steriele PBS om anti-CD3-beklede putjes en verwijder PBS in een afvalcontainer.
- Voeg 100 ul van het mengsel of iTh17 bedieningseenheid mengsel (zie punt nr. 2) aan de putjes in drievoud.
- Voeg 100 ul van cellen aan elk putje waarbij ofwel de Th17 mengsel of de bedieningseenheid mengsel is geplaatst.
- Incubeer cellen voor ten minste 72 uur of tot 5 dagen (Th17 differentiatie kan worden verkregen na 72 uur of na 5 dagen.)
- Th17 differentiatie kan worden beoordeeld door intracellulaire kleuring en flowcytometrische analyse, ELISA of qPCR
7. Cel activering (alleen nodig voor intracellulaire kleuring)
- Verwijder 96 putjes van broedmachines eind ofwel 72 uur of 5 dagen
- Bedenk dat Th17 differentiation kan worden bereikt na ofwel 72 uur of 5 dagen.
- Voor elke aandoening (bv. activering controle of iTh17), transfer cellen die in drievoud in een putje van een 24 wells celkweekplaat. De cellen van een voorwaarde zijn nu samengevoegd in een putje van de 24 putjes plaat, in tegenstelling tot zijn in drievoud in 96 well U bodem petrischaal.
- Het totale volume van elk putje in de 24 goed celkweekplaat is nu 600 pi. Verhoog het volume van elk putje om met de celkweek media 1 ml.
- Voeg PMA (forbolmyristaatacetaat) (50 ng / ml), ionomycine (1 uM) en BFA (Brefeldine-A) (10 ug / ml) aan elk putje in 24 putjes celkweek plaat bij de vermelde concentraties.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur.
8. Intracellulaire kleuring
- Stain cellen met de gewenste extracellulaire en intracellulaire merkers voor flowcytometrische analyse. Om de aanwezigheid o detecterenf IL-17 is intracellulaire kleuring uitgevoerd met anti-IL-17A antilichamen. Aanbevolen extracellulaire oppervlak merkers omvatten CD4, CD8 en CD25.
- Gebruik de intracellulaire cytokine kleuring Starter Kit-Muis uit BD Bioscience voor IL-17 intracellulaire kleuring.
- Voor elk monster pellet cellen verwijderen supernatant en resuspendeer celpellet in 200 ui FACS buffer (2% FBS in PBS).
- Transfer geresuspendeerd cellen tot 96 cel flowcytometrie plaat.
- Spin cellen naar beneden gedurende 5 min bij 1200 rpm en gooi supernatant.
- Voeg 200 ul PBS FACS buffer, gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 1200 rpm en gooi supernatant.
- Resuspendeer cellen in 100 ul FACS buffer en 100 gl extracellulaire antilichaam (Ab) mengsel (extracellulair Ab mengsel in FACS buffer) toegepast. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, bedekt met folie.
- Herhaal stap 8.1.4.
- Herhaal stap 8.1.5 2x.
- Resuspendeer cellen in 100 ul BD Cytofix / Cytoperm Buffer. Incubat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, bedekt met folie.
- Voeg 100 ul van 1 x BD Perm / Wash buffer, centrifugeer 5 min bij 1200 rpm en gooi supernatant. Herhalen.
- Voeg 50 ul van intracellulair Ab mengsel. (Intracellulaire Ab mengsel in 1x BD Perm / Wash) Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, bedekt met folie.
- Herhaal stap 8.1.10.
- Resuspendeer cellen in 200 ul BD vlekken buffer.
- Plaats geresuspendeerd cellen in flowcytometrie buisjes die 200 ul BD vlekken buffer (eindvolume is 400 pi).
- Bewaren bij 4 ° C tot monsters zijn klaar om te worden gelezen.
9. Flowcytometrische Analyse
- Gate levende cellen bevolking.
- Van de levende cellen bevolking, poort op CD4 + CD8-bevolking.
- Van de CD4 + CD8-bevolking, poort op IL-17A + populatie.
- Op basis van onze eerdere experimentele resultaten, wordt 100% van de IL-17A + populatie CD25 + zijn.
* Totaal absolute cel-tellingen werden verkregen na het bundelen van het monster triplicaten
** Absolute aantal CD4 + CD25 + IL-17A +-cellen werd bepaald door het totale aantal cellen vermenigvuldigen met de levende poort percentage en het percentage van cellen die de lijn-specifieke merkers, CD4, CD25 en IL-17A, zoals bepaald door flow cytometrie.
10. qPCR en ELISA
- Plaats cellen niet gebruikt voor flowcytometrische analyse in een 1,5 ml eppendorfbuisje en gecentrifugeerd bij 13.000 rpm gedurende 5-10 minuten. De cellen in de celpellet na centrifugeren wordt gebruikt voor qPCR analyse. qPCR analyse werd uitgevoerd met behulp van PTC-200 Peltier PCR-apparaat (Biorad).
- Verzamel supernatant van het gecentrifugeerde buizen voor ELISA. IL-17A ELISA's werden uitgevoerd met behulp van antilichaam paar TC11-18h10 (capture, catalogusnummer 555068) en TC11-8H4 biotine (opsporing, catalogusnummer 555067) gekocht van BD Biosciences. IL-17A ELISA standards werden verkregen van eBioscience (catalogusnummer 14-8171-80).
- Na verwijdering van het supernatant, resuspendeer de resterende cellen worden gebruikt voor qPCR in 175 pl RNA lysisbuffer (onmiddellijk gebruikt voor RNA-extractie, cDNA-synthese en qPCR of bewaar bij -80 ° C voor later gebruik).
- Zie Tabel II voor primer sequenties voor IL-17A en actine (house-keeping gen)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze Th17 differentiatie protocol begint met het verwijderen van de milt en de axillaire, brachiale, mesenterische, cervicale en inguinale lymfeknopen. Een weergave van de plaats van elk kan worden in figuren 2 en 3. Figuren 1 en 5 beide een visuele representatie van de in dit protocol beschreven.
Deze Th17 protocol gericht op differentiatie van CD4 + CD25-T-lymfocyt populatie. Het is belangrijk om te weten hoe efficiënt de AutoMACS Pro Cell scheiding verrijkt ons gewenste CD4 + CD25-bevolking van de gepoolde totale lymfeklieren en de milt (figuur 4). De ongefractioneerde, samengevoegd lymfeklier en splenocyten, en de AutoMACS gescheiden fracties werden gekleurd met antiCD4 en antiCD25 antilichamen gevolgd door flowcytometrische analyse (Figuur 4). Figuur 4A toont een representatief profiel van het percentage van CD4 + CD25 +en CD4 + in de gefractioneerde, samengevoegd lymfklieren en milt door flowcytometrie CD25-lymfocyten. De isolatieprocedure ook een verrijkt CD4 + CD25 + Treg populatie van C57BL / 6 muizen die kunnen worden gebruikt in andere experimenten (Figuur 4B). Figuur 4C toont onze gewenste cel verrijking met een bevolking die 84% CD4 + CD25-T-cellen, met de meeste CD4 + CD25 + Tregs verwijderd. We hebben altijd een kleine niet-lymfoïde celpopulatie die in het verrijkte CD4 + CD25-is, maar deze niet interfereert met het differentiatieproces (Figuur 4C). De verrijkte CD4 + CD25-T-celpopulatie helpt om een succesvolle Th17 differentiatie verzekeren.
Figuur 5 toont een schema van onze Th17 differentiatie procedure. De verrijkte CD4 + CD25-populatie ofwel geïncubeerd onder Th17 differentiërende omstandigheden (anti-CD3, anti-CD28, IL-6 en TGF-β) of controle (anti-CD3, anti-CD28). Het kan worden gezien in figuur 6 dat dat incubatie van CD4 + CD25-T-lymfocyten met anti-CD3, anti-CD28 gedurende 5 dagen leverde CD25 + T-lymfocyten, incubatie onder Th17 inducerende omstandigheden leverde een subset van IL17 producerende CD4 + CD25 + lymfocyten. Zie tabel 1 voor voorbeelden van CD4 + CD25 + IL-17A + absolute aantal cellen opbrengst na 5 dagen incubatie onder iTh17 omstandigheden.
Th17 differentiatie status kan verder worden beoordeeld door middel van kwantitatieve PCR en ELISA. Figuur 7 toont gegevens uit verrijkte CD4 + CD25-T-lymfocyten geïncubeerd onder controle of Th17-inducerende omstandigheden. CD4 + CD25-T-lymfocyten geïncubeerd onder omstandigheden Th17 up-reguleren IL17A, die kan worden vastgesteld door qPCR (figuur 7A) en ELISA (fig. 7B). De Th17-specifieke transcriptiefactor RORγT wordt ook gereguleerd door CD4 + CD25-T-cellen geïncubeerd onder Th17-inducerende omstandigheden, en kan thr worden vastgestelddoorgedreven qPCR (Figuur 7A).
Figuur 1. Th17 Differentiatie schema. 1. Coat putjes U-bodem 96 wells plaat met anti-CD3 (10 ug / ml) verdund in PBS. 2. Plaats plaat incubator gedurende 4 uur bij 37 ° C. Terwijl de plaat wordt incubatie, ontleden lymfeklieren (LN) en de milt van de muis. Grind organen en filteren om een enkele celsuspensie te verkrijgen. Isoleer CD4 + CD25-T-cellen met behulp van de CD4 + CD25 + regulatoire T-cellen Isolation Kit en Miltenyi AutoMACS Pro Separator. CD4 + CD25-cellen worden verdund tot 1 x 10 6 cellen / ml. 3. Na 4 uur incubatie van de plaat met 96 putjes is voltooid, wassen putjes met PBS (200 ul / putje) 3x. 4. Voeg 100 ul CD4 + CD25-T-cellen aan plaat-gebonden (PB) anti-CD3 beklede putjes. 5. Voeg 100 ul anti-CD28 of 100 ul iTh17 cocktail (antiCD28, TGF-β en IL-6). 6. Incubeer dienblad 3 of 5 dagen bij 37 ° C. Na incubatie beoordelen differentiatie door intracellulaire kleuring, qPCR, en / of ELISA.
Figuur 2. LN Dissection Guide. A) 1 brachialis lymfeklieren kan worden gevonden in het bindweefsel in de buurt van elke oksel (oksel) van de muis. B) 1 okselklier zijn te vinden in elke oksel, achter de borstspieren. C) Mesenteriale lymfeklieren bevinden zich in het bindweefsel van de darmen. Ze lijken op een parelsnoer. D) 4 oppervlakkige cervicale lymfeklieren zijn te vinden in de hals van de muis. E) 2 lies lymfeklieren (1 aan elke kant) kan worden gevestigd in de heup regio op de plaats waar 3 bloedvaten ontmoeten .
. Binnen-page = "altijd"> 
Figuur 3. Milt dissectie gids. Muizenmilten bevinden zich aan de linkerkant van het lichaam achter de maag en darmen. Gewoon verwijderen door te trekken en te scheiden met de tang.
Figuur 4. Celfracties uit samengevoegde LN en de milt cellen voor en na AutoMACS Pro scheiding. A) LN en de milt cellen gekleurd, ex vivo, met baseline celpopulaties voorafgaand aan de separatie te bewerkstelligen. Na scheiding, CD4 + CD25 + (B) en CD4 + CD25-(C) fracties werden gekleurd zuiverheid van CD4 + CD25 + en CD4 + CD25-T-lymfocyt populaties respectievelijk beoordelen. Alle monsters werden gekleurd met CD4 + en CD25 antilichamen en geanalyseerd door flowcytometrie.
Figuur 5. Th17 Differentiatie. Incubeer cellen voor maximaal 5 dagen. Oogst cellen voor intracellulaire kleuring en qPCR, oogst bovenstaande vloeistof voor de ELISA.
Figuur 6. Th17 differentiatie beoordeeld door flowcytometrie. CD4 + CD25-T-lymfocyten werden geïncubeerd in aanwezigheid van plaat gebonden anti-CD3, anti-CD28, IL-6 en TGF-β (iTh17) of plaat-gebonden anti-CD3 en anti-CD28 alleen (controle) voor 5 dagen. Cellen werden vervolgens geactiveerd met PMA en lonomycine gedurende 4 uur bij 37 ° C. Na activering werden de cellen gekleurd met anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 en anti-IL-17A antilichamen voor flowcytometrische analyse Th17 differentiatie beoordelen. iTh17 = Th17 inducerende caarden.
Figuur 7. Th17 differentiatie bepaald door qPCR en ELISA. Lymfocyten uit C57BL / 6 muizen werden gesorteerd en CD4 + CD25-T-cellen werden geïncubeerd in aanwezigheid van plaat gebonden anti-CD3 (10 ug / ml), anti-CD28 (1,5 ug / ml ), IL-6 (20 ng / ml), en TGF-β (5 ng / ml) of plaat-gebonden anti-CD3 en anti-CD28 alleen (controle) gedurende 5 dagen. A) Cellen werden daarna geoogst op RORγT beoordelen en IL-17A bericht expressie via qPCR. B) Bovenstaande vloeistoffen werden geoogst aan IL-17A eiwit expressie te evalueren door middel van ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we het protocol om in vitro Th17 differentiatie bereiken beschreven. De studie van Th17 differentiatie is belangrijk, omdat differentiatie van T-lymfocyten in de Th17 deelverzameling is van cruciaal belang voor de effectieve uitbanning van menselijke ziekteverwekkers 13. Omgekeerd is IL17 productie geassocieerd met auto ziekteprogressie 13. Werkwijze Th17 differentiatie is toepasbaar op veel onderzoek instellingen kan worden toegepast op tal van verschillende muismodellen van immuunregulatie en autoimmuniteit. Deze methode helpt bevat over het vermogen van T-lymfocyten, te differentiëren in een Th17 cel, aangeduid in dit protocol door de productie van IL-17A en expressie van de transcriptiefactor RORγT, immuunreacties moduleren beantwoorden. Bovendien is aangetoond dat door anderen Th17 cellen ook kunnen worden geïdentificeerd door de productie van IL17F, IL22 en GM-CSF 8, 12. Dit protocol is van belang met betrekking tot anderebekende T-lymfocyt differentiatie protocollen zoals Th1 of Th2 differentiatie, omdat het kan worden gebruikt om die protocollen om beter te begrijpen hoe T lymfocyt effectorfuncties betrekking immuunsysteem besturingssysteem vullen.
Er zijn een aantal cruciale stappen te overwegen bij het uitvoeren van deze experimenten. Th17 differentiatie kan worden bereikt door een onzuivere CD4 + CD25-populatie, maar de meest effectieve en betrouwbare resultaten wordt een CD4 + CD25-populatie ten minste 80% zuiverheid gewenst. Onze methode maakt gebruik van het protocol door Miltenyi Biotec voor hun AutoMACS Pro Cell Separator. De AutoMACS CD4 + CD25 + regulatoire T cellen Isolation Kit, muis wordt gebruikt voor negatieve selectie van de CD4 + CD25-celpopulatie. Negatieve selectie maakt het gebruik van naïeve cellen die niet mogelijk zijn veranderd door antilichaam interacties.
Het gebruik van bepaalde celoppervlaktemerkers in flowcytometrische analyse kan de zuiverheid van ap bevestigenEVOLKING. De aanbevolen oppervlakte merkers CD4, CD8, CD25 en ze gemakkelijk kunnen identificeren de gewenste CD4 + CD25-populatie. B220 en CD11b kan worden gebruikt om te testen voor B-cellen en macrofagen verontreiniging respectievelijk. Monsters consequent verdund tot 1 x 10 6 cellen / ml wordt ook aanbevolen als we dat deze concentratie levert optimale differentiatie hebben gevonden. In het verleden hebben wij geconstateerd dat celconcentraties die te hoog of te laag waren vaak cellulaire expansie en vertekende resultaten (zoals scheef IL-17A productie) had verstoord.
Het is ook belangrijk om te onthouden om de monsters op ijs te allen tijde wanneer niet in gebruik. Levensvatbaarheid van de cellen is een belangrijke factor in het bereiken van positieve Th17 differentiatie. Dit kan worden bevestigd door middel van tellen van cellen met behulp trypaanblauw verdunningen. Omdat dit protocol hanteert handleiding weefsel homogenisatie door het malen van de lymfeklieren en de milt met mat microscoop dia's, kan dit een tijdrovende methode. Een ontwerp van modification is om automatische weefsel dissociators gebruiken als een alternatieve optie.
In het geval dat de gewenste Th17 differentiatie niet wordt bereikt, zijn er verschillende trouble shooting tips die moeten worden overwogen. Eerst controles moet zorgvuldig overwogen worden, zodat de ware omvang van Th17 differentiatie behoorlijk te meten. We bepalen meestal de omvang van Th17 differentiatie door vergelijking van deze resultaten aan de CD4 + T-lymfocyten die alleen anti-CD3 en anti-CD28 stimulatie. Bedenk ook dat CD4 + T-lymfocyten moeten ingeschakeld te zijn om te differentiëren. Men moet ook visueel gekweekte cellen onder de microscoop op de aanwezigheid van gestraald / geactiveerde T-cellen bevestigen. Geactiveerde T-cellen visueel aanzienlijk groter lijken dan cellen die niet zijn gestimuleerd. Klonale expansie kan worden waargenomen door clusters van zichtbare stralen cellen die zijn afgeleid van een T cel kloon. Activering cel kan ook verificatie wordened door middel van flowcytometrische analyse met anti-CD4 en anti-CD25 antilichamen tegen het CD4 + CD25 + geactiveerde cellen 4 identificeren
Het is ook belangrijk om te vermelden dat dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met C57BL / 6 muizen echter gepubliceerde gegevens blijkt dat Th17 differentiatie in andere muizenstammen inclusief NOD-en BALB / c muizen 5, 11, 20 worden bereikt. Opgemerkt zij dat Th17 differentiatie, waaronder totale frequentie en absolute aantal CD4 + T-lymfocyten differentiatie ondergaan, is afhankelijk van genetische factoren (zoals muizenstam) 20 en omgevingsfactoren (zoals kolonie locatie) 5 en kunnen optimalisatie vereisen.
Dit Th17 differentiatie protocol kan dienen als een waardevol middel om vragen met betrekking tot de functie van cellen in het Th17 deelverzameling verder te beantwoorden. Onze methode van Th17 differentiatie heeft een aantal belangrijke voordelen. Zoals eerder vermeld het gebruikvan minimaal 80% pure CD4 + CD25-cel populatie zorgt voor een meer consistente en effectieve differentiatie resultaat. Gemak van isolatie door het gebruik van de AutoMACS Pro celseparator is een bijkomend voordeel. Verder is het gebruik van de optimale cytokine en activering signalen geeft de T-cellen met de geschikte omgeving om differentiëren. Toekomstige implicaties voor dit protocol zijn de bepaling van de mechanische wijze waarop Th17 cellen en de productie van IL-17A zijn betrokken bij het ontstaan en de progressie van auto-immuniteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen onthullingen te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk wordt mede ondersteund door de NIH / NCATS klinisch en translationeel Science Awards aan de Universiteit van Florida TL1 TR000066 en UL1 TR000064, een diversiteit supplement van Parent Grant R01AI056152 van het National Institute of Health, een BD Biosciences reagens subsidie, en de Universiteit van Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" x 1"1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt–thanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad | ||
References
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421, 742-748 (2003).
- El-Behi, M., Rostami, A., et al. Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
- Inaba, K., Kroide, S., et al. Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction. Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).
- L, I. vanovF. rutosR., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).
- Jager, L. D., Dabelic, R., et al. The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).
- Kimura, A., Kishimoto, T.
- Korn, T., Bettelli, E., et al.
- Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice. PNAS. 108, 11548-11553 (2011).
- Langrish, C. L., Chen, Y., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).
- Lau, K., Benitez, P., et al. Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias. J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).
- Lee, Y., Awasthi, A., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).
- Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell. 140, 845-858 (2010).
- O'Connor, W. Jr, Kamanaka, M., et al. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).
- Picca, C. C., Larkin, J., et al. Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection. Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).
- Shah, K., Lee, W. W., et al. Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research & Therapy. 12, R53 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R.
- Stockringer, B., Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, 179-189 (2006).
- Zou, Y., Zhang, H., et al. Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis. Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).
