Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية

Published: September 26, 2013 doi: 10.3791/50765
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Cell Science, The University of Florida
* These authors contributed equally

Summary

مع وظائف المستجيب متميزة عن غيرها فرعية الخلايا التائية والخلايا TH17 قد تورطت مركزيا في المناعة الذاتية للالتهابات. يوفر هذا البروتوكول في المختبر TH17 التمايز وسيلة لتحديد ما إذا كان من السذاجة اللمفاويات CD4 + T يمكن أن تفرق في خلايا TH17، ومواصلة دراسة دورها في المناعة الذاتية والاستجابة المضيف.

Abstract

الخلايا TH17 هي مجموعة فرعية متميزة من الخلايا T التي تم العثور عليها لإنتاج انترلوكين 17 (IL-17)، وتختلف في وظيفة عن غيرها من مجموعات فرعية الخلايا التائية بما في ذلك الاستجابة Th1، الاستجابة Th2، والخلايا التائية التنظيمية. ظهرت الخلايا TH17 باعتباره الجاني المركزية في الاستجابات المناعية الالتهابية المرتبطة مماحكة مع العديد من اضطرابات المناعة الذاتية. في هذه الطريقة نحن تنقية الخلايا اللمفية تي من الطحال والغدد الليمفاوية من C57BL / 6 الفئران، وتحفيز خلايا CD4 + T المنقى تحت السيطرة والبيئات TH17 الذي يحفز. وتشمل البيئة الذي يحفز TH17 التحفيز في وجود مكافحة CD3 ومكافحة CD28 الأجسام المضادة، IL-6، وTGF-β. بعد حضانة لمدة 72 ساعة على الأقل ومدة تصل إلى خمسة أيام عند 37 درجة مئوية، ويتم تحليل الخلايا بعد ذلك لديها القدرة على إنتاج IL-17 من خلال التدفق الخلوي، QPCR، وELISAs. TH17 متباينة CD4 + CD25-T الخلايا يمكن استخدامها لمزيد من إلقاء الضوء على الدور الذي تلعبه الخلايا TH17 في ظهور وتطور المناعة الذاتية والمضيف ديقمم تهدف. علاوة على ذلك، يمكن TH17 التفريق بين CD4 + CD25 الخلايا اللمفية من نماذج متميزة خروج المغلوب / مرض الفئران تسهم في فهمنا للمصير الخلية اللدونة.

Introduction

CD4 + T الليمفاوية (خلايا تي) تلعب دورا حاسما في الدفاع المناعي بوساطة نظام ضد الكائنات الدقيقة المعدية. على العكس، كما يرتبط ارتباطا وثيقا مع خلايا T ظهور وتطور أمراض المناعة الذاتية مثل مرض السكري من النوع 1، الذئبة الحمامية، والتهاب المفاصل الروماتويدي. CD4 + الخلايا اللمفية تي تصبح تفعيلها من خلال مجموعة من مستقبلات الخلايا التائية (TCR) التفاعل مع مستضد وما شابه ذلك / مجمع التوافق النسيجي الرئيسي الثاني (MHCII) جزيئات، والتفاعلات مستقبلات CD28 مع B7.1/B7.2 بروابط 15. بالإضافة إلى توفير التحفيز TCR وCD28 شارك في التحفيز، والخلايا العارضة للمستضد أيضا توفير بيئة خلوى، والذي يحدد الدولة تمايز تي اللمفاويات، وبالتالي توجيه استجابة الخلايا اللمفاوية T لمستضد معين. التفاعلات الممرض متميزة / خلية مستضد تقديم خلق بيئات خلوى متميزة، والتي تحرف الخلايا اللمفية تي أسفل مسارات متميزة تركز على ايليmination من مسببات المرض الشروع. للأسف، T مسارات الخلايا اللمفاوية المستجيب، صممت في الأصل للقضاء على غزو مسببات الأمراض، ويمكن أن توجه ضد أنسجة خطأ الذاتي 15. وبالتالي، فهم أفضل من كل دولة التمايز متميزة CD4 + T الخلية فرعية أمر بالغ الأهمية لفهمنا لكيفية لتعديل التوازن بين القضاء على مسببات الأمراض والتسامح في تقرير المصير.

بالإضافة إلى الاستجابة Th1، الاستجابة Th2، ومحرض T التنظيمية مسارات تمايز الخلايا، الخلايا الليمفاوية T السذاجة ويمكن أيضا أن تكون مدفوعة من قبل السيتوكينات أسفل مسار TH17. بينما TH1 الخلايا مسببات الأمراض بين الخلايا المقاتلة، وخلايا الاستجابة Th2 القضاء على مسببات الأمراض خارج الخلية، والخلايا التائية التنظيمية (Tregs) تقليل الاستجابات الالتهابية 1، 16؛ خلايا TH17 تلعب دورا هاما في القضاء على البكتيريا والفطريات خارج الخلية. يتم الرمز الخلايا TH17 عموما تعبير عن النسخ عامل النسب المحددة RORγT وإنتاج IL-17A، وهو ما يعزز تفعيل الضامة والعدلات 1، 7.

قد تورطت في عدة خلايا TH17 اضطرابات المناعة الذاتية، ونماذج القوارض المرتبطة بها. على سبيل المثال، فقد ثبت أن IL-23 (الذي هو مطلوب للحفاظ على النمط الظاهري TH17)، ولكن، لم يكن IL-12 المذنب المركزي في التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية (EAE)، نموذج المرض القوارض لMS. وفيما بعد تبين أن التخفيضات في إنتاج IL-17 ترتبط بالوقاية EAE 2 و 6 و 17. علاوة على ذلك، وقد ارتبطت الخلايا TH17 الذين يعانون من اضطرابات المناعة الذاتية الأخرى بما في ذلك التهاب المفاصل والذئبة الحمامية الجهازية (SLE) 10، 16. IL-23 P19 ناقصة - / - عرضت الفئران لديها أعداد قليلة جدا من الخلايا TH17، ومقاومة للتطوير ليس فقط EAE، ولكن أيضا التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين، وهو نموذج لالتهاب المفاصل الروماتويدي 10، 18. بالإضافة إلى ذلك، الفئران التي عولجت مع تحييد الأجسام المضادة IL-17A الخلفإيه عثر على بداية التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين أيضا أن يكون القرار من تلف المفاصل 18. تجدر الإشارة إلى أن دور الخلايا TH17 في تطور أمراض المناعة الذاتية ويبقى أن توصف بأنها أظهرت الأبحاث الحديثة أيضا دورا وقائيا من الخلايا TH17 في النوع 1 من مرض السكري 9 و 11 و التهاب الأمعاء 14. تؤكد هذه الدراسات على أهمية TH17 التمايز في المناعة الذاتية.

في المختبر TH17 التمايز هو وسيلة ضرورية في أبحاث الخلايا T لأن هناك اثنين على الأقل من الأسئلة المحيرة التي تتطلب مزيدا من التحقيق: 1) كيف بالضبط هل IL-6 تنظيم التوازن بين Treg وTH17 التمايز، و 2) ما هي الآليات الدقيقة وراء IL-17 التي يسببها الاضطرابات الالتهابية؟ لدينا وسيلة توظف خلايا CD4 + CD25-T من الطحال والغدد الليمفاوية من الفأرة C57BL / 6. من المهم أن نلاحظ أنه على الرغم من أنه من الممكن للحث على تمايز TH17 باستخدام النجاسةالسكان، والحصول على ما لا يقل عن 80٪ نقية CD4 + السكان الخلية CD25-T ينفي أي قلق من التلوث ويضمن نتائج TH17 التمايز أكثر نجاحا. من أجل تحقيق التمايز TH17 السليم، يتم تحضين الخلايا CD4 + CD25-T بحضور مكافحة CD3 ومكافحة CD28، والتي توفر إشارات التنشيط، 1 و 2 على التوالي، وIL-6، وTGF-β. على الرغم من أن تم الإبلاغ عن أن IL-23 وحده يمكن استخدامها لتحقيق TH17 التمايز، وقد تجلى ذلك في وقت لاحق أن IL-23 هو ضروري لاستقرار السكان الخلية TH17، ولكن IL-6 و TGF-β ضرورية لTH17 التمايز 3، 18، 19. وقد أظهرت الدراسات أن الفئران يتم التعبير عن مستقبلات IL-23 على خلايا CD4 + T فقط بعد أن تكون قد حفز مع IL-6 و TGF-β 13، 18. أيضا، سوف الخلايا TH17 تتطور بنجاح في حضور IL-23-منع الأجسام المضادة طالما IL-6 و TGF-β موجودة 18، 19. على هذا النحو، وهذا التمايز TH17 بروتوكول الأقليمايديس الظروف المناسبة للحث على TH17 التمايز بنجاح. تطوير فهم أفضل للآليات الأساسية TH17 التمايز وIL-17 إنتاج تقديم الفرصة لتطوير علاجات أفضل تهدف إلى اضطرابات المناعة الذاتية 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت جميع استخدام الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام.

1. إعداد خلطات وسائل الإعلام

  1. العقيمة PBS درجة الحموضة: 7.3 (1 L)
    ز 0.23 ناه 2 ص 4
    1.15 ز نا 2 هبو 4
    9.0 غرام كلوريد الصوديوم
    يستغرق حجم بالماء DI. تعقيم الأوتوكلاف مع.
  2. خلية الإعلام الثقافة (100 مل)
    89 مل RPMI
    10 مل 10٪ FBS
    1 مل مضاد حيوي فطري (ابام) 100 ميكروغرام 50 مم 2 المركابتويثانول (3.5 ميكروغرام الأوراق المالية 2 المركابتويثانول إلى 96.5 ميكروغرام PBS)
  3. FACS العازلة (الفرز نيون تفعيل خلية) (لاستخدامها خلال التدفق الخلوي) 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني العقيمة
  4. iTh17 ميكس (بناء على عدد من العينات، وتحديد حجم اللازمة لجميع خلطات ووسائل الإعلام)
    1.5 ميكروغرام / مل مكافحة CD28
    20 نانوغرام / مل IL-6
    5 نانوغرام / ملTGF-β

2. وستكون خلايا مطلي في ثلاث نسخ تحت الشروط التالية

  1. لوحة ملزمة لمكافحة CD3، ومكافحة CD28 (وهذا هو مزيج السيطرة التنشيط).
  2. iTH17: لوحة ملزمة لمكافحة CD3، ومكافحة CD28، IL-6، TGF-β.

3. مكافحة CD3 محدد لوحة (10 ميكروغرام / مل)

فمن المستحسن أن إعداد لوحات مكافحة CD3 محدد لوحة يتم على الأقل 4 ساعة قبل الوقت ستضاف الخلايا إلى لوحات.

  1. إضافة 30 ميكرولتر مكافحة CD3 إلى الآبار (غير المخفف مكافحة CD3 في برنامج تلفزيوني العقيمة) من جديد 96 U جيدا أسفل MICROTEST الأنسجة لوحة الثقافة، والاستفادة من الجانبين من لوحة لضمان تغطية موحدة للآبار. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات، ثم بردت حتى حان الوقت لإضافة يمزج والخلايا إلى صفيحة.

4. الماوس تشريح

  1. ويستند هذا البروتوكول على استخدام C57BL / 6 هيئة التصنيع العسكريه، 3-8 أشهر من العمر، والتي تم شراؤها من مختبر جاكسون (بار هاربور، ME).
  2. التضحية الماوس باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 الاختناق، وتأكيد وفاة مع خلع عنق الرحم لاحقة.
  3. تعقيم أدوات تشريح الفئران ومنطقة شق مع الايثانول 70٪ ويبدأ تشريح.
  4. من وجهة النظر بطني، والاستيلاء على الجلد التي هي سابقة لفتح مجرى البول وتبدأ خفض مع مقص يصل خط الوسط بطني حتى وصلت إلى منطقة الذقن. اتخاذ الاحتياطات اللازمة وليس لتمزيق أو قطع في بطانة جدار البريتوني.
  5. سحب على الجلد وحصره للسماح بالوصول إلى الغدد الليمفاوية مريحة أثناء الإزالة.
  6. سيتم إزالة الغدد الليمفاوية والطحال جمع كل بالملقط، وتوضع في طبق بتري معقمة تحتوي على 5 مل من autoMACS تشغيل شراؤها من مخزن بيوتيك Miltenyi (يرجى الرجوع إلى أرقام 2 و 3 لالعقدة الليمفاوية والطحال إزالة الرسوم البيانية).
    1. إزالة الغدد الليمفاوية الإبطية التي هيوجدت بالقرب من الإبط (تحت الإبط) وراء عضلات الصدر من كل فأر.
    2. إزالة الغدد الليمفاوية العضدية التي تقع في الأنسجة الضامة التي تقع بالقرب من بعضها الإبطين.
    3. إزالة الغدد الليمفاوية العنقية سطحية وجدت في عنق كل فأر.
    4. إزالة الغدد الليمفاوية الأربية التي تقع في منطقة الورك في بالاشتراك في الأوعية الدموية 3.
    5. للوصول إلى الغدد الليمفاوية المساريقي، وقطع من خلال بطانة البريتوني حتى خط الوسط بطني. تم العثور على الغدد الليمفاوية المساريقي في النسيج الضام الذي يحمل الأمعاء معا. وجدوا عموما في سلسلة من 4-8 العقد، ويمكن أن تبدو وكأنها "سلسلة من اللآلئ". تأكد من سحب السلسلة بأكملها.
    6. يقع الطحال في منطقة البطن، خلف المعدة والأمعاء. إزالته عن طريق سحب وفصلها من البنكرياس.
  7. طحن الأجهزة تحت غطاء العقيمة باستخدام 2 شرائح المجهر بلوري. وضع الغدد الليمفاوية أو الطحال علىالجانب بلوري واحد شريحة المجهر، وفرك مع الجانب متجمد من الشريحة الثانية حتى تفككت. تكرار حتى يتم وقف جميع الغدد الليمفاوية والطحال.

ملاحظة: من المستحسن أن تبدأ مع الغدد الليمفاوية وتنتهي مع الطحال، والدم سوف تجعل من الصعب أن نرى الغدد الليمفاوية المتبقية في المخزن المؤقت autoMACs.

  1. لتصفية أجهزة الأرض في تعليق خلية واحدة، تبدأ من خلال للطي على قطعة من 40 ميكرومتر النايلون المواد عدة مرات، ووضع في أعلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي. يجب أن تكون مادة النايلون تقريبا 3 × 3 بوصة
  2. استخدام حقنة 5 مل و 21 إبرة G لنضح 5 مل من autoMACs تشغيل العازلة وأجهزة الأرض. الاستغناء ببطء في مادة النايلون مطوية. الحرص على تجنب ثقب المواد مع الإبرة.

وبمجرد تحقيق تعليق خلية واحدة، يجب أن يظهر الحل كما شاحب، حل يتسق مع عدم وجود visib: ملاحظةلو قطع من الأنسجة الصلبة. إذا بقيت المواد الصلبة، وإعادة نضح والاستغناء من خلال قطعة مطوية جديدة من النايلون وضعت في 15 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة.

  1. دائما حفاظ على الخلايا على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال.

5. فصل الخلايا

  1. لأفضل النتائج، يجب الحصول على الأقل CD4 محض 80٪ + السكان خلايا CD25 من خلال autoMACS برو فاصل خلية باستخدام MACS CD4 + CD25 + T التنظيمية العزلة الخلية عدة، الماوس. يتم الحصول على بروتوكول للاحتفاظ السلبية من السكان خلايا CD4 + CD25 من خلال بيوتيك Miltenyi.

6. TH17 التمايز

  1. جمع السكان CD25 خلايا CD4 + بعد الانفصال مع autoMACS برو فاصل الخلية.
  2. عد الخلايا المخفف في نسبة 1:1000 مع الأزرق التريبان باستخدام عدادة الكريات.
  3. مرة واحدة وقد تم تحديد تركيز من عدد الخلايا، تمييع تعليق خلية إلى 1 × 10 6 خلية / مل في الخلية سائل الإعلام والثقافة.
  4. إخراج 96 لوحات جيدة مع لوحة ملزمة لمكافحة CD3 بعد 4 ساعة.
  5. غسل الآبار مكافحة CD3 المغلفة مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. كرر 2 مرات.
    1. لغسل إضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة لمكافحة CD3 الآبار المغلفة وإزالة PBS في حاوية النفايات.
  6. إضافة 100 ميكرولتر من مزيج iTh17 أو السيطرة تفعيل مزيج (انظر النقطة رقم 2) إلى الآبار في ثلاث نسخ.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر التي تم وضعها إما مزيج TH17 أو مزيج السيطرة التنشيط.
  8. احتضان الخلايا لمدة 72 ساعة على الأقل أو ما يصل إلى 5 أيام (TH17 التمايز يمكن الحصول عليها بعد 72 ساعة أو بعد 5 أيام.)
  9. يمكن تقييم TH17 تمايز الخلايا عن طريق تلطيخ وتدفق cytometric التحليل، ELISA، أو QPCR

7. تنشيط الخلية (فقط بين الخلايا اللازمة لتلطيخ)

  1. إزالة 96 لوحات جيدة من الحاضنات في نهاية إما 72 ساعة أو 5 أيام
    1. نذكر بأن TH17 التمايزلا يمكن أن يتحقق إما ن بعد 72 ساعة أو 5 أيام.
  2. لكل حالة (على سبيل المثال التحكم التنشيط أو iTh17)، ونقل الخلايا التي هي في ثلاث نسخ في بئر واحدة من 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية. وقد تم حتى الآن تجميع الخلايا لشرط واحد في بئر واحدة من 24 لوحة الثقافة جيدا، بدلا من كونها في ثلاث نسخ في 96 U جيدا أسفل لوحة الثقافة.
  3. الحجم الكلي للكل بئر في 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية هو الآن 600 ميكرولتر. رفع حجم كل بئر إلى 1 مل مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
  4. إضافة سلطة النقد الفلسطينية (phorbol ميريستات خلات) (50 نانوغرام / مل)، ionomycin (1 ميكرومتر)، ومنتدى بواو الاسيوى (Brefeldin-A) (10 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر في البئر لوحة 24 خلية ثقافة في تركيزات المدرجة.
  5. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.

8. تلطيخ الخلايا

  1. الخلايا وصمة عار مع علامات خارج الخلية وبين الخلايا المطلوب لتحليل تدفق cytometric. للكشف عن وجود سو IL-17، ويتم تلطيخ الخلايا مع أجسام مضادة لمكافحة IL-17A. وتشمل علامات سطح الخلية أوصت CD4، CD8، وCD25.
    1. استخدام داخل الخلايا تلطيخ خلوى كاتب كيت ماوس من العلوم البيولوجية دينار بحريني لIL-17 بين الخلايا تلطيخ.
    2. لكل عينة، وخلايا بيليه، وإزالة طاف، وبيليه الخلية resuspend في 200 ميكرولتر FACS العازلة (2٪ FBS في برنامج تلفزيوني).
    3. نقل خلايا معلق إلى 96 خلية تدفق الخلوي لوحة.
    4. تدور أسفل الخلايا لمدة 5 دقائق عند 1،200 دورة في الدقيقة وتجاهل طاف.
    5. إضافة 200 ميكرولتر العازلة PBS نظام مراقبة الأصول الميدانية، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،200 دورة في الدقيقة، وتجاهل طاف.
    6. خلايا resuspend في 100 ميكرولتر من FACS العازلة وتطبيق 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة خارج الخلية (أب) خليط (يتم خارج الخلية أب الخليط في المخزن FACS). احتضان لمدة 15 دقيقة في RT، مع تغطية احباط.
    7. كرر الخطوة 8.1.4.
    8. كرر الخطوة 8.1.5 2X.
    9. الخلايا resuspend في 100 ميكرولتر من BD Cytofix / Cytoperm العازلة. Incubأكل لمدة 20 دقيقة في RT، مع تغطية احباط.
    10. إضافة 100 ميكرولتر من 1X دينار بحريني بيرم / غسل العازلة، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1،200 دورة في الدقيقة، وتجاهل طاف. تكرار.
    11. إضافة 50 ميكرولتر من الخلايا أب الخليط. (يتم بين الخلايا أب الخليط في 1X دينار بحريني بيرم / غسل) احتضان لمدة 15 دقيقة في RT، مع تغطية احباط.
    12. كرر الخطوة 8.1.10.
    13. الخلايا resuspend في 200 ميكرولتر من تلطيخ العازلة دينار بحريني.
    14. وضع الخلايا معلق في التدفق الخلوي أنابيب تحتوي على 200 ميكرولتر تلطيخ العازلة دينار بحريني (الحجم النهائي هو 400 ميكرولتر).
    15. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى العينات جاهزة للقراءة.

9. تحليل تدفق Cytometric

  1. بوابة السكان الخلية الحية.
  2. من السكان الخلية الحية، البوابة على CD4 + CD8 السكان.
  3. من CD4 + CD8 السكان، على بوابة IL-17A + السكان.
    1. استنادا إلى النتائج التجريبية السابقة لدينا، وسوف 100٪ من IL-17A + CD25 + يكون السكان.

* تم الحصول على إجمالي عدد الخلايا المطلقة بعد تجميع عينة يثلث
** تم تحديد العدد المطلق للCD4 + CD25 + IL-17A + الخلايا بضرب العدد الكلي للخلايا عن طريق نسبة بوابة الحي والنسبة المئوية لمجموع الخلايا التي تحمل علامات نسب محددة، CD4، CD25، وIL-17A، و يحددها التدفق الخلوي.

10. QPCR وELISA

  1. الخلايا مكان لا تستخدم لتحليل تدفق cytometric في أنبوب 1.5 مل إيبندورف وأجهزة الطرد المركزي في 13،000 دورة في الدقيقة لمدة 5-10 دقيقة. سيتم استخدام الخلايا الموجودة في الخلية بيليه بعد الطرد المركزي لتحليل QPCR. تم إجراء التحليل باستخدام QPCR PTC-200 بلتيير cycler الحرارية (BIORAD).
  2. جمع طاف من أنابيب طرد لELISAs. أجريت IL-17A ELISAs باستخدام زوج الأضداد TC11-18H10 (التقاط، وأنواع العدد 555068) وTC11-8H4 البيوتين (الكشف، وأنواع العدد 555067) تم شراؤها من العلوم البيولوجية دينار بحريني. IL-17A ELISA ستاتم الحصول عليها من ndards eBioscience (كتالوج عدد 14-8171-80).
  3. بعد إزالة طاف، resuspend الخلايا المتبقية لاستخدامها في QPCR في 175 ميكرولتر العازلة RNA تحلل (استخدامها على الفور لاستخراج الحمض النووي الريبي، والتوليف [كدنا]، وQPCR، أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق).
    1. الرجوع إلى الجدول الثاني لتسلسل التمهيدي لIL-17A والأكتين (مسك بيت الجينات)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هذا البروتوكول التمايز TH17 يبدأ مع إزالة الطحال والإبطين، العضدية، المساريقي، عنق الرحم، والغدد الليمفاوية الأربية. تمثيل من المواقع من كل يمكن العثور عليها في الشكلين 2 و 3. الأرقام 1 و 5 على حد سواء توفر تمثيل مرئي من الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول.

ويركز هذا البروتوكول TH17 على التمايز من السكان اللمفاويات CD4 + CD25-T. من المهم أن نلاحظ مدى كفاءة autoMACS برو فصل خلية يثري دينا CD4 + CD25 المطلوب السكان من العقدة الليمفاوية والطحال مجموع المجمعة (الشكل 4). كانت ملطخة، العقدة الليمفاوية وغير المجزأ المجمعة splenocytes، والكسور autoMACS فصل مع antiCD4 وantiCD25 الأجسام المضادة تليها تحليل تدفق cytometric (الشكل 4). ويبين الشكل 4A لمحة ممثل نسبة CD4 + CD25 +وCD4 + CD25 الخلايا اللمفية الموجودة في غير المجزأ، والعقد اللمفاوية والطحال المجمعة من قبل التدفق الخلوي. يوفر الإجراء العزلة أيضا المخصب السكان CD4 + CD25 + Treg من C57BL / 6 الفئران التي يمكن استخدامها في تجارب إضافية (الشكل 4B). ويبين الشكل 4C لدينا تخصيب الخلية المطلوبة التي يبلغ عدد سكانها الذي هو 84٪ CD4 + CD25-T الخلايا، مع أن الغالبية العظمى من CD4 + CD25 + Tregs إزالتها. لدينا باستمرار السكان الخلية غير اللمفاوية الصغيرة التي هي موجودة في CD4 + CD25 المخصب، لكن هل لا تتداخل مع عملية التمايز (الشكل 4C). يساعد دينا المخصب السكان خلايا CD4 + CD25-T لتأمين TH17 التمايز أكثر نجاحا.

ويبين الشكل 5 تخطيطي لدينا TH17 الإجراء التمايز. لدينا المخصب CD4 + CD25 السكان إما حضنت تحت ظروف التفريق TH17 (مكافحة CD3، ومكافحة CD28، IL-6، وTGF-β) أو التحكم (مكافحة CD3، ومكافحة CD28). يمكن أن ينظر إليه في الشكل 6 أنه في حين الحضانة من الخلايا الليمفاوية CD4 + CD25-T مع مكافحة CD3، ومكافحة CD28 لمدة 5 أيام أسفرت عن CD25 + الخلايا اللمفية تي، الحضانة تحت TH17 ظروف حمل أسفرت عن مجموعة فرعية من IL17 إنتاج CD4 + CD25 + الخلايا الليمفاوية. يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1 للحصول على أمثلة من CD4 + CD25 + IL-17A + غلة عدد الخلايا المطلقة بعد 5 أيام الحضانة في ظل ظروف iTh17.

يمكن كذلك أن تقيم TH17 حالة التمايز من خلال PCR الكمي وELISA. الشكل 7 يعرض البيانات من التخصيب الخلايا اللمفية CD4 + CD25-T حضنت تحت السيطرة أو شروط TH17 الذي يحفز. اللمفاويات CD4 + CD25-T المحتضنة في ظل ظروف TH17 يصل تنظيم IL17A، والتي يمكن التحقق منها من خلال QPCR (الشكل 7A) وELISA (الشكل 7B). وupregulated النسخ عامل TH17 محددة RORγT أيضا من قبل خلايا CD4 + CD25-T المحتضنة في ظل ظروف TH17 الذي يحفز، ويمكن التأكد عبتيOUGH QPCR (الشكل 7A).

الشكل 1
الشكل 1. TH17 التمايز التخطيطي. 1. الآبار معطف من U-96 لوحة القاع جيدا مع مكافحة CD3 (10 ميكروغرام / مل) المخفف في برنامج تلفزيوني. 2. لوحة في مكان حاضنة لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية. بينما لوحة ويحتضنها، تشريح الغدد الليمفاوية (LN) والطحال من الماوس. طحن أجهزة وتصفية للحصول على تعليق خلية واحدة. عزل خلايا CD4 + CD25-T باستخدام CD4 + CD25 + T التنظيمية عزل الخلايا كيت وMiltenyi autoMACS برو فاصل. يجب تخفيفه CD4 + الخلايا CD25 إلى 1 × 10 6 خلية / مل. 3. مرة واحدة 4 ساعة حضانة لوحة جيدا 96 كاملة، وغسل الآبار مع برنامج تلفزيوني (200 ميكرولتر / جيد) 3X. 4. إضافة 100 ميكرولتر CD4 + خلايا CD25-T لوحة متجهة الى (PB) مكافحة CD3 المغلفة الآبار. 5. إضافة 100 ميكرولتر مكافحة CD28 أو 100 ميكرولتر iTh17 مدونة قواعد السلوك ktail (antiCD28، TGF-β، وIL-6). 6. احتضان لوحة لمدة 3 أو 5 أيام في 37 درجة مئوية. التالية الحضانة تقييم التمايز عن طريق تلطيخ الخلايا، QPCR، و / أو ELISA.

الرقم 2
الشكل 2. LN دليل تشريح. أ) العقدة الليمفاوية 1 العضدية يمكن العثور عليها في النسيج الضام تقع بالقرب من بعضها الإبط (تحت الإبط) من الفأرة. B) العقدة الليمفاوية الإبطية 1 يمكن العثور عليها في كل الإبطين، وراء عضلات الصدر. C) تقع الغدد الليمفاوية المساريقي في النسيج الضام للأمعاء. أنها تشبه سلسلة من اللآلئ. D) ​​تم العثور على 4 الغدد الليمفاوية العنقية سطحية في الرقبة من الفأرة. E) 2 الغدد الليمفاوية الأربية (1 على كل جانب) يمكن أن يكون موجودا في منطقة الورك في الموقع حيث يلتقي 3 الأوعية الدموية .

. في صفحة = "دائما"> الرقم 3
الرقم 3. الطحال دليل تشريح. تم العثور على الطحال الماوس على الجانب الأيسر من الجسم خلف المعدة والأمعاء. ببساطة عن طريق سحب وإزالة فصل مع ملقط.

الرقم 4
الشكل 4. كانت ملطخة الكسور خلية من LN المجمعة وخلايا الطحال قبل وبعد autoMACS برو خلايا الانفصال. A) LN والطحال، فيفو السابقين، لإنشاء خط الأساس السكان الخلية قبل الانفصال. كانت ملطخة بعد الانفصال، CD4 + CD25 + (B) وCD4 + CD25-(C) الكسور لتقييم نقاء CD4 + CD25 + CD25 + CD4 و-T السكان اللمفاويات، على التوالي. كانت ملطخة جميع العينات مع CD4 + CD25 + والأجسام المضادة وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي.

jove_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 5
الرقم 5. TH17 التمايز. احتضان الخلايا لمدة تصل إلى 5 أيام. خلايا الحصاد لتلطيخ الخلايا وQPCR؛ supernatants الحصاد لELISA.

الرقم 6
الرقم 6. TH17 التمايز المقررة من قبل التدفق الخلوي. وحضنت CD4 + CD25-T الخلايا الليمفاوية في وجود ربط لوحة مكافحة CD3، ومكافحة CD28، IL-6، وTGF-β (iTh17) أو لوحة متجهة الى مكافحة CD3 ومكافحة CD28 وحدها (السيطرة) 5 أيام. ثم تم تنشيط الخلايا مع سلطة النقد الفلسطينية وIonomycin لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد التنشيط، كانت ملطخة الخلايا مع مكافحة CD4، ومكافحة CD8، ومكافحة CD25، والأجسام المضادة للIL-17A لتحليل تدفق cytometric لتقييم TH17 التمايز. iTh17 = TH17 حمل جonditions.

الرقم 7
الرقم 7. تم فرز TH17 التمايز المقررة من قبل QPCR وELISA. الخلايا اللمفاوية من C57BL / 6 الفئران وحضنت الخلايا CD4 + CD25-T بحضور مكافحة CD3 (10 ميكروغرام / مل) ملزمة لوحة، ومكافحة CD28 (1.5 ميكروغرام / مل )، IL-6 (20 نانوغرام / مل)، وTGF-β (5 نانوغرام / مل) أو لوحة متجهة الى مكافحة CD3 ومكافحة CD28 وحدها (التحكم) لمدة 5 أيام. A) خلايا ثم تم حصادها لتقييم RORγT تم حصادها وIL-17A رسالة عبر التعبير QPCR. B) Supernatants لتقييم IL-17A البروتين التعبير عن طريق ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا وصفناها بروتوكول لتحقيق التمايز في المختبر TH17. دراسة TH17 التمايز هو المهم، وتمايز الخلايا اللمفية تي في فرعية TH17 أمر بالغ الأهمية من أجل القضاء الفعال لمسببات الأمراض البشرية 13. على العكس، ارتبط إنتاج IL17 مع تطور المرض المناعة الذاتية 13. طريقة TH17 التمايز ينطبق على العديد من إعدادات البحث كما يمكن تطبيقها على العديد من نماذج الفئران متميزة من التنظيم المناعي والمناعة الذاتية. يساعد هذا الأسلوب للرد على أسئلة بشأن قدرة الخلايا اللمفية تي، على التمايز إلى خلية TH17، تدل في هذا البروتوكول من قبل إنتاج IL-17A والتعبير عن عامل النسخ RORγT، لتعديل استجابات المناعة. علاوة على ذلك، فقد تبين من قبل الآخرين أن الخلايا TH17 يمكن أيضا حددها إنتاج IL17F، Il22، وGM-CSF 8، 12. هذا البروتوكول هو كبير فيما يتعلق الأخرىالمعروف T بروتوكولات اللمفاويات التمايز، مثل الاستجابة Th1 أو الاستجابة Th2 التمايز، لأنها يمكن أن تستخدم لتكمل هذه البروتوكولات من أجل فهم أفضل لكيفية ربط T ظائف الخلايا اللمفاوية المستجيب لتشغيل النظام المناعي.

وهناك العديد من الخطوات الحاسمة في الاعتبار عند إجراء هذه التجارب. لا يمكن أن يتحقق من خلال التمايز TH17 نجس ​​CD4 + CD25 السكان، ولكن لنتائج أكثر فعالية وموثوق بها، هو المطلوب CD4 + CD25 السكان لا يقل عن 80٪ النقاء. يستخدم أسلوب لدينا بروتوكول تقدمها بيوتيك Miltenyi الخاصة بهم autoMACS برو فاصل الخلية. وautoMACS CD4 + CD25 + T التنظيمية عزل خلية كيت، يتم استخدام الماوس لاختيار السلبية من السكان CD25 خلايا CD4 +. اختيار السلبية يسمح للاستخدام الخلايا الساذجة التي لم يتم تعديلها من قبل يحتمل أن تكون التفاعلات الأجسام المضادة.

يمكن استخدام بعض علامات سطح الخلية في تحليل تدفق cytometric تأكيد نقاء ا ف بopulation. علامات السطح الموصى بها CD4، CD8، وCD25 كما يمكن التعرف بسهولة على CD4 + CD25 المطلوب السكان. وB220 CD11b يمكن استخدامها لاختبار الخلايا B والتلوث بلعم، على التوالي. عينات المخفف باستمرار إلى 1 × 10 6 خلية / مل ويوصى أيضا كما وجدنا أن هذا التمايز غلة تركيز الأمثل. في الماضي وجدنا أن تركيزات الخلية التي كانت مرتفعة جدا أو منخفضة جدا في كثير من الأحيان قد مضطرب التوسع الخلوية ونتائج متحيزة (مثل الانحراف إنتاج IL-17A).

من المهم أيضا أن نتذكر أن تبقي العينات على الجليد في جميع الأوقات عندما لا تكون قيد الاستعمال. بقاء الخلية هو عامل مهم في تحقيق التمايز TH17 إيجابية. ويمكن التأكد من ذلك من خلال عد الخلايا باستخدام التخفيفات التريبان الأزرق. لأن هذا البروتوكول توظف دليل التجانس الأنسجة عن طريق طحن الغدد الليمفاوية والطحال مع شرائح المجهر بلوري، وهذا يمكن أن يكون طريقة تستغرق وقتا طويلا. تصميم واحد موdification هو الاستفادة dissociators الأنسجة التلقائي كخيار بديل.

في حال أن TH17 التمايز المطلوب لم يتحقق، وهناك العديد من النصائح اطلاق النار المتاعب التي ينبغي النظر فيها. أولا، يجب أيضا النظر في الضوابط بعناية بحيث المدى الحقيقي لTH17 التمايز يمكن قياسها بشكل صحيح. نحن عادة تحديد مدى TH17 التمايز من خلال مقارنة هذه النتائج إلى الخلايا اللمفية CD4 + T فقط تلقي مكافحة CD3 والتحفيز مكافحة CD28. تذكر أيضا أن CD4 + الخلايا اللمفية تي تحتاج إلى تنشيط من أجل التفريق. ينبغي للمرء أيضا بصريا فحص الخلايا المستزرعة تحت المجهر للتأكد من وجود انتقد / تنشيط خلايا تي. تنشيط خلايا تي تظهر بصريا بشكل كبير أكبر من الخلايا التي لم حفز. ويمكن أيضا ملاحظة التوسع نسيلي من خلال مجموعات واضحة على نسف الخلايا التي استمدت من نفس واحدة استنساخ الخلايا التائية. تنشيط الخلايا ويمكن أيضا أن يكون verifiإد من خلال استخدام تحليل تدفق cytometric استخدام الألغام المضادة للCD4 والأجسام المضادة لمكافحة CD25 لتحديد CD4 + CD25 + الخلايا تفعيلها 4

من المهم أيضا أن نذكر أن هذا البروتوكول تم الأمثل للاستخدام مع C57BL / 6 الفئران، ومع ذلك نشرت بيانات تبين أن TH17 التمايز قد يتحقق في سلالات الفئران الأخرى بما في ذلك NOD وBALB / ج الفئران 5، 11، 20. تجدر الإشارة إلى أن TH17 التمايز، بما في ذلك تردد الشاملة والعدد المطلق من الخلايا الليمفاوية CD4 + T تمر التمايز، تعتمد على عوامل وراثية (مثل سلالة الماوس) 20، والعوامل البيئية (مثل موقع مستعمرة) 5 و قد تتطلب التحسين.

هذا البروتوكول التمايز TH17 يمكن أن تكون بمثابة وسيلة لا تقدر بثمن لمزيد من الإجابة على أسئلة بخصوص وظيفة الخلايا في فرعية TH17. لدينا طريقة TH17 التمايز ديها العديد من المزايا الهامة. كما ذكرنا سابقا استخدامالحد الأدنى للCD4 محض 80٪ + يوفر السكان خلايا CD25 نتيجة التمايز أكثر اتساقا وفعالية. سهولة العزلة من خلال استخدام فاصل خلية برو autoMACS هي ميزة إضافية. وعلاوة على ذلك استخدام خلوى وتفعيل الأمثل إشارات يوفر خلايا T مع البيئة المناسبة التي تفرق. وتشمل الآثار المستقبلية لهذا البروتوكول تحديد الوسائل الآلية التي يتم من خلالها المشاركة الخلايا TH17 وإنتاج IL-17A في ظهور وتطور المناعة الذاتية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا الإفصاحات لتعلن.

Acknowledgments

ويدعم هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة / NCATS جوائز العلوم السريرية وبالحركة لجامعة فلوريدا TL1 TR000066 وUL1 TR000064، ملحق التنوع من الأصل غرانت R01AI056152 من المعهد الوطني للصحة، منحة كاشف العلوم البيولوجية دينار بحريني، وجامعة من ولاية فلوريدا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri Dish Fisher Scientific 0875713A 60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Premium Microscope Slides, Frosted Fisher Scientific 12-544-3 3" x 1"1 mm
5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle BD Biosciences 309632
Corning 15 ml Centrifuge Tubes Sigma-Aldrich CLS430791
Nylon 40 microns Miami Aquaculture Nylon 40/26
Microtest tissue culture plate 96 well U bottom BD Biosciences 35-3077
Corning Costar 24 well cell culture plates Sigma-Aldrich CL3524
Eppendorf Tubes 1.5 ml Fisher Scientific 05-408-129
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e BD Biosciences 553057
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 BD Biosciences 553294
Mouse IL-6 Recombinant Protein eBioscience 14-8061-62
TGFbeta R&D Systems 240-B-002
Trypan blue solution 0.4 % Sigma-Aldrich 66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 BD Biosciences 558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a BD Biosciences 553035
PE Conjugated Anti-mouse CD25 eBioscience E01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 BD Biosciences 560820
Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse BD Biosciences 51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse Miltenyi Biotec 130-091-221
ABAM Cellgro 30-004-CI
RPMI Corning, Cellgro 10-040-CM
B 2-Mercapt–thanol MP Biomedical 194834 Hazardous
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)
Ionomycin Calcium Salt Sigma-Aldrich 13909-1ML Hazardous
Brefeldin A (BFA) MP Biomedicals 159027
ELISA IL-17A Capture mAb BD Biosciences 555068
ELISA IL-17A Detection mAb BD Biosciences 555067
ELISA IL-17A Standard eBioscience 14-8171-80
IL-2 ELISA Kit BD Biosciences 555148
TMB Substrate Reagent Set BD Biosciences 555214
Equipment
autoMACS Pro Cell Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
Sorvall Legend RT+ Centrifuge ThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 Incubator ThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal Cycler Biorad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
  2. Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421, 742-748 (2003).
  3. El-Behi, M., Rostami, A., et al. Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  4. Inaba, K., Kroide, S., et al. Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction. Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).
  5. L, I. vanovF. rutosR., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).
  6. Jager, L. D., Dabelic, R., et al. The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).
  7. Kimura, A., Kishimoto, T. IL-6: regulator of Treg/Th17 balance. Eur. J. Immunol. 40, 1830-1835 (2010).
  8. Korn, T., Bettelli, E., et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  9. Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice. PNAS. 108, 11548-11553 (2011).
  10. Langrish, C. L., Chen, Y., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).
  11. Lau, K., Benitez, P., et al. Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias. J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).
  12. Lee, Y., Awasthi, A., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).
  13. Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell. 140, 845-858 (2010).
  14. O'Connor, W. Jr, Kamanaka, M., et al. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).
  15. Picca, C. C., Larkin, J., et al. Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection. Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).
  16. Shah, K., Lee, W. W., et al. Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research & Therapy. 12, R53 (2010).
  17. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of Multiple Sclerosis. Annu. Rev. Immunol. 23, 683-747 (2005).
  18. Stockringer, B., Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).
  19. Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, 179-189 (2006).
  20. Zou, Y., Zhang, H., et al. Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis. Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).

Tags

علم المناعة، العدد 79، البيولوجيا الخلوية، البيولوجيا الجزيئية والطب والعدوى والخلايا TH17، IL-17، TH17 التمايز، وخلايا T، المناعة الذاتية، والخلية، والعزلة، والثقافة
العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bedoya, S. K., Wilson, T. D.,… More

Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin III, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naïve CD4 T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765, doi:10.3791/50765 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter