Summary
Med effektorfunktioner adskiller sig fra andre T-celle delmængder, har Th17 celler blevet centralt impliceret i inflammatoriske autoimmunitet. Denne in vitro Th17 differentiering protokol giver et middel til at afgøre, om naive CD4 + T-lymfocytter kan differentiere sig Th17 celler, og for yderligere at undersøge deres rolle i autoimmunitet og vært reaktion.
Abstract
Th17 celler er et særskilt undersæt af T-celler, har vist sig at producere interleukin 17 (IL-17) og adskiller sig i funktion fra de andre T-celledelmængder, herunder Th1, Th2 og regulatoriske T-celler. Th17 celler er dukket op som en central synder i nidkære inflammatoriske immunrespons er forbundet med mange autoimmune sygdomme. I denne fremgangsmåde rense vi T-lymfocytter fra milt og lymfeknuder fra C57BL / 6 mus, og stimulerer oprensede CD4 + T-celler under kontrol og Th17-inducerende miljøer. Den Th17-inducerende miljø omfatter stimulering i nærvær af anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer, IL-6 og TGF-β. Efter inkubation i mindst 72 timer, og i op til fem dage ved 37 ° C, cellerne efterfølgende analyseret for evnen til at producere IL-17 ved hjælp af flowcytometri, qPCR og ELISA'er. Th17 differentierede CD4 + CD25-T-celler kan anvendes til yderligere at belyse den rolle, Th17 celler spiller i indtræden og progression af autoimmunitet og vært defense. Desuden kan Th17 differentiering af CD4 + CD25-lymfocytter fra forskellige murine knockout / sygdomsmodeller bidrage til vores forståelse af celle skæbne plasticitet.
Introduction
CD4 +-T-lymfocytter (T-celler) spiller en kritisk rolle i immunsystemet-medieret forsvar mod infektiøse mikroorganismer. Omvendt er T-celler også tæt forbundet med indtræden og progression af autoimmune sygdomme som type 1 diabetes, systemisk lupus erythematosus, og leddegigt. CD4 +-T-lymfocytter er blevet aktiveret ved en kombination af T-cellereceptor (TCR) interaktioner med dertil hørende antigen / major histocompatibility complex II (MHCII)-molekyler og CD28-receptor interaktioner med B7.1/B7.2 ligander 15. Ud over tilvejebringelse af TCR-stimulering og CD28 costimulering, antigenpræsenterende celler giver også et cytokin miljø, der bestemmer differentieringstilstanden af T-lymfocyt, hvorved dirigere T-lymfocyt respons på det givne antigen. Tydelige patogen / antigen-præsenterende celle interaktioner skabe distinkte cytokin-miljøer, som en skævhed T-lymfocytter ned adskilte veje fokuseret på elimelse af den initierende patogen. Desværre T lymfocyt effektor veje, der oprindeligt designet til at udrydde invaderende patogener, kan fejlagtigt rettet mod selv-væv 15. Derfor bedre forståelse af hvert enkelt CD4 + T-celle delmængde differentiering tilstand er kritisk for vores forståelse af, hvordan man kan modulere balancen mellem eliminering af patogener og tolerance over for selv.
Ud over Th1, Th2 og inducerbare regulatoriske T-celler veje kan naive T-lymfocytter også være drevet af cytokiner ned Th17 vej. Betragtninger Th1 celler bekæmpe intracellulære patogener, Th2 celler fjerne ekstracellulære patogener, og regulatoriske T-celler (tregs) minimere inflammatoriske reaktioner 1, 16, Th17 celler spiller en vigtig rolle i afskaffelsen af ekstracellulære bakterier og svampe. Th17 celler generelt betegnet ved ekspression af linjespecifikt transkriptionsfaktor RORγT og produktion af IL-17A, som fremmer aktiveringen af makrofager og neutrofiler 1, 7.
Th17 celler har været impliceret i flere autoimmune sygdomme og deres tilknyttede gnavermodeller. For eksempel er det blevet påvist, at IL-23 (som er nødvendig til at opretholde Th17 fænotype), men ikke IL-12, var den centrale årsag i eksperimentel autoimmun encephalitis (EAE), gnavere sygdom model for MS. Det har efterfølgende vist sig, at reduktioner i IL-17 produktion er korreleret til EAE forebyggelse 2, 6, 17. Desuden har Th17 celler blevet forbundet med andre autoimmune sygdomme, herunder arthritis og systemisk lupus erythematosus (SLE) 10, 16.. IL-23 deficient p19 - / - mus blev vist at have meget lave antal Th17 celler og er modstandsdygtig over for at udvikle ikke kun EAE, men også collagen-induceret arthritis, en model for rheumatoid arthritis 10, 18. Desuden mus behandlet med neutraliserende IL-17A antistoffer agtenis indtræden af kollagen-induceret arthritis blev også fundet at have opløsning af ledskader 18. Det skal bemærkes, at den rolle Th17 celler i udviklingen af autoimmun sygdom er fortsat at blive karakteriseret som nyere forskning har også vist en beskyttende rolle i Th17 celler i type 1 diabetes 9, 11 og tarmbetændelse 14. Disse undersøgelser bekræfter betydningen af Th17 differentiering i autoimmunitet.
In vitro Th17 skelnen er en nødvendig metode i T-celle forskning, fordi der er mindst to forvirrende spørgsmål, der kræver yderligere undersøgelse: 1) Hvor præcis er IL-6 regulerer balancen mellem Treg og Th17 differentiering, og 2) hvad er de nøjagtige mekanismer bag IL-17-inducerede inflammatoriske lidelser? Vores metode anvender CD4 + CD25-T-celler fra milt og lymfeknuder fra C57BL / 6 mus. Det er vigtigt at bemærke, at selvom det er muligt at inducere Th17 differentiering ved hjælp af en urenbefolkning, erhverve mindst en 80% ren CD4 + CD25-T-celle population negerer enhver bekymring for forurening og sikrer mere vellykkede Th17 differentiering resultater. For at opnå ordentlig Th17 differentiering, er CD4 + CD25-T-celler inkuberet i nærvær af anti-CD3 og anti-CD28, som giver aktiveringssignaler, 1 og 2, henholdsvis, og IL-6 og TGF-β. Selv om det er blevet rapporteret, at IL-23 alene kan anvendes til at opnå Th17 differentiering, blev det senere vist, at IL-23 er nødvendig for stabiliteten af Th17 cellepopulationen, men IL-6 og TGF-β er afgørende for Th17 differentiering 3, 18, 19. Murine undersøgelser har vist, at IL-23-receptoren udtrykkes på CD4 + T-celler, efter de er blevet stimuleret med IL-6 og TGF-β 13, 18. Desuden vil Th17 celler med succes udvikler sig i nærværelse af IL-23-blokerende antistoffer, så længe IL-6 og TGF-β er til stede 18, 19. Som sådan Th17 differentiering denne protokol provIdes de rette betingelser for en vellykket fremkalde Th17 differentiering. Udvikling af en bedre forståelse af de mekanismer, der ligger til grund Th17 differentiering og IL-17 produktion præsentere mulighed for udvikling af bedre lægemidler rettet mod autoimmune sygdomme 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr brug blev gennemført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1.. Udarbejdelse af Blandinger og medier
- Steril PBS pH: 7,3 (1 L)
0,23 g NaH 2 PO4
1,15 g Na 2 HPO 4
9,0 g NaCl
Tages op volumen med DI vand. Sterilisere med autoklavering. - Cell Culture Media (100 ml)
89 ml RPMI
10 ml 10% FBS
1 ml Antibiotisk antimykotisk (ABAM) 100 ug 50 mM 2-mercaptoethanol (3,5 ug lager 2-mercaptoethanol i 96,5 ug PBS) - FACS Buffer (Fluorescent Aktivering Celle Sortering) (skal bruges i løbet af flowcytometri) 2% FBS i sterilt PBS
- iTh17 Mix (Baseret på antallet af prøver, bestemme mængden nødvendig for alle blandinger og medier)
1,5 ug / ml anti-CD28
20 ng / ml IL-6
5 ng / mlTGF-β
2. Celler vil være belagt i tre eksemplarer på følgende betingelser
- Plate bundet anti-CD3, anti-CD28 (dette er kontrol aktiverings mix).
- iTH17: plade bundet anti-CD3, anti-CD28, IL-6, TGF-β.
3. Pladebundet anti-CD3 (10 ug / ml)
Det anbefales, at fremstilling af plade-bundet anti-CD3 pladerne gøres mindst 4 timer forud for tidspunktet celler vil blive sat til pladerne.
- Der tilsættes 30 ul anti-CD3 til brønde (anti-CD3 fortyndes i sterilt PBS), i en ny 96-brønds U-bundet Microtest vævskulturplade og trykke siderne af pladen for at sikre en ensartet dækning af brøndene. Der inkuberes ved 37 ° C i 4 timer, og derefter opbevares i køleskab, indtil det er tid til at tilføje blandingerne og celler til pladen.
4.. Mus Dissection
- Denne protokol er baseret på anvendelsen af C57BL / 6 mice, 3-8 måneders alderen, og købt fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
- Sacrifice mus ved hjælp af CO 2 kvælning, og bekræft død med efterfølgende halsdislokation.
- Sterilisere mus dissektion værktøjer og indsnit område med 70% ethanol og begynde dissektion.
- Fra den ventrale opfattelse, tag fat i huden, der er forreste af urinrørets åbning og begynde at skære med en saks op den ventrale midterlinjen, indtil den når hagen området. Tag forholdsregler ikke at rive eller skæres i foring af bugvæggen.
- Træk tilbage på huden og pin ned for at give komfortabel adgang til lymfeknuder under fjernelsen.
- Lymfeknuder og milt indsamlede alle fjernes med pincet, og anbringes i en steril petriskål indeholdende 5 ml autoMACS Running Buffer købt fra Miltenyi Biotec (se figur 2 og 3 for lymfeknude og milt fjernelse diagrammer).
- Fjern de armhulen lymfeknuder, der erfundet nær armhulen (armhule) bag brystmuskel af hver mus.
- Fjern de brachialis lymfeknuder, der er placeret i bindevævet beliggende nær hver aksil.
- Fjern de overfladiske lymfeknuder fundet i halsen på hver mus.
- Fjern lyske lymfeknuder, som er placeret i hoften område ved sammenfaldet af de 3 blodkar.
- Du får adgang til mesenteriallymfeknuder, snydt peritoneal foring op den ventrale midterlinjen. Mesenteriallymfeknuder findes i bindevæv, der holder tarmene sammen. De er generelt fundet i en perlerække af 4-8 noder, og kan vises som en "perlerække". Sørg for at trække sig ud af hele strengen.
- Milten er placeret i maveregionen, bag maven og tarmene. Fjern det ved at trække og afmontere det fra bugspytkirtlen.
- Grind organer under en steril hætte med 2 matteret objektglas. Placer lymfeknuder eller milt påmatteret side af et objektglas, og gnid med matteret side af den anden slide indtil opløsning. Gentag, indtil alle lymfeknuder og milt er blevet malet.
Bemærk: Det anbefales at starte med lymfeknuder og slut af med milten, da blodet vil gøre det vanskeligt at se de resterende lymfeknuder i autoMACs buffer.
- At filtrere jorden organer i en enkelt cellesuspension, begynde med at folde et stykke 40 um nylon materiale flere gange, og anbringelse i toppen af en 15 ml centrifugerør. Den nylon materiale bør være ca 3 x 3 i.
- Brug en 5 ml sprøjte og 21 G kanyle at aspirere de 5 ml autoMACs løbebuffer og jord organer. Doser langsomt i den foldede nylon. Vær omhyggelig med at undgå at punktere materialet med nålen.
Bemærk: Når enkelt celle suspension er opnået, skal opløsningen fremstå som en bleg, ensartet løsning uden VISESle stykker af fast væv. Hvis faste stoffer tilbage, re-aspireres og dispensere gennem en ny foldet stykke nylon placeret i en ny 15 ml centrifugerør.
- Altid holde cellerne på is, når den ikke er i brug.
5.. Cell Separation
- For optimale resultater, opnå mindst en 80% ren CD4 + CD25-celle befolkning gennem autoMACS Pro celleseparator vha. MACS CD4 + CD25 + regulerende T-celle isolation kit, mus. Protokollen for den negative fastholdelse af CD4 + CD25-celle population opnås ved Miltenyi Biotec.
6.. Th17 Differentiering
- Saml CD4 + CD25-celle population efter separation med autoMACS Pro Cell Separator.
- Tæl celler fortyndet i en 1:1000 forhold med trypanblåt ved hjælp af et hæmocytometer.
- Når koncentrationen er blevet bestemt ud fra celletal, fortyndes cellesuspension til 1 x 10 6 celler / ml i cellekulturmediet.
- Tag 96 brønds plader med plade bundet anti-CD3 efter 4 timer.
- Vask anti-CD3-coatede brønde med 200 pi PBS. Gentag to gange.
- At vaske tilsættes 200 ul sterilt PBS til anti-CD3-coatede brønde og fjerne PBS i en affaldsbeholder.
- Tilsæt 100 ul af iTh17 mix eller aktivering kontrol blandes (se punkt # 2) til brøndene i tre eksemplarer.
- Tilsæt 100 ul celler til hver brønd, hvor enten Th17 blanding eller kontrol aktiverings blanding er blevet placeret.
- Cellerne inkuberes i mindst 72 timer eller op til 5 dage (kan Th17 differentiering opnås efter 72 timer eller efter 5 dage).
- Th17 differentiering kan vurderes ved intracellulær farvning og flowcytometrisk analyse, ELISA eller qPCR
7.. Cell Aktivering (kun nødvendigt for Intracellulær farvning)
- Fjern 96 brønde fra rugemaskinen i slutningen af enten 72 timer eller 5 dage
- Husk på, at Th17 differentiation kan opnås efter enten 72 timer eller 5 dage.
- For hver tilstand (f.eks kontrol aktiverings eller iTh17) overfører celler, der er i tre eksemplarer i en brønd i en 24 brønds celledyrkningsplade. Cellerne i en tilstand er nu blevet samlet i en brønd af 24-brønds dyrkningsplade, i modsætning til at være i tre eksemplarer på 96 brønds U-bundet dyrkningsplade.
- Den samlede mængde af hver brønd i 24 brønds cellekultur Pladen er nu 600 pi. Øge mængden af hver brønd til 1 ml med celledyrkningsmediet.
- Tilføj PMA (phorbolmyristatacetat) (50 ng / ml), ionomycin (1 uM), og BFA (brefeldin-A) (10 ug / ml) til hver brønd i 24-brønds celledyrkningsplade ved de anførte koncentrationer.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 4 timer.
8.. Intracellulær farvning
- Stain celler med de ønskede ekstracellulære og intracellulære markører for flowcytometrisk analyse. At påvise tilstedeværelsen of IL-17, er intracellulær farvning udført med anti-IL-17A antistoffer. Anbefalede ekstracellulære overflade markører indbefatter CD4, CD8 og CD25.
- Brug de intracellulære Cytokine Farvning Starter Kit-Mouse fra BD Bioscience for IL-17 Intracellular farvning.
- For hver prøve, pellet celler, fjerne supernatanten og resuspender cellepelleten i 200 ul FACS buffer (2% FBS i PBS).
- Overfør resuspenderede celler til 96 celle flowcytometri plade.
- Spin celler ned i 5 minutter ved 1.200 rpm og kassér supernatanten.
- Tilsæt 200 ul PBS FACS buffer, centrifuge i 5 minutter ved 1.200 omdrejninger i minuttet, og kassér supernatanten.
- Resuspender cellerne i 100 pi FACS buffer og anvende 100 pi ekstracellulære antistof (Ab) blandingen (ekstracellulær Ab blandingen foretages i FACS-buffer). Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur, dækket med folie.
- Gentag trin 8.1.4.
- Gentag trin 8.1.5 2x.
- Resuspender cellerne i 100 ul BD Cytofix / Cytoperm Buffer. Incubspiste i 20 minutter ved RT, dækket med folie.
- Tilsæt 100 ul 1x BD Perm / Wash buffer, centrifugeres i 5 minutter ved 1.200 omdrejninger i minuttet, og kassér supernatanten. Gentag.
- Der tilsættes 50 ul af intracellulær Ab blanding. (Intracellulær Ab blandingen foretages i 1x BD Perm / Wash) inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur, dækket med folie.
- Gentag trin 8.1.10.
- Resuspendér celler i 200 pi BD Farvning Buffer.
- Placer resuspenderede celler i flowcytometri rør indeholdende 200 pi BD Farvning Buffer (endelig volumen er 400 ul).
- Opbevares ved 4 ° C, indtil prøverne er klar til at blive læst.
9.. Flowcytometrisk analyse
- Gate levende cellepopulation.
- Fra den levende cellepopulation, gate på CD4 + CD8-populationen.
- Fra CD4 + CD8-populationen, gate på IL-17A +-populationen.
- Baseret på vores tidligere eksperimentelle resultater, vil 100% af IL-17A +-populationen være CD25 +.
* Samlet absolutte celletal blev opnået efter at samle prøven tre eksemplarer
** Absolutte antal af CD4 + CD25 + IL-17A +-celler blev bestemt ved at multiplicere det samlede antal celler ved levende gate procentdel og procentdelen af totale celler, der bærer afstamning-specifikke markører, CD4, CD25 og IL-17A, som bestemmes ved flowcytometri.
10.. qPCR og ELISA
- Place cellerne ikke anvendes til flowcytometrisk analyse i et 1,5 ml Eppendorf-rør og centrifugeres ved 13.000 rpm i 5-10 min. Cellerne findes i cellepelleten efter centrifugering vil blive anvendt til qPCR analyse. qPCR analyse blev udført ved hjælp af PTC-200 Peltier Termocycler (Biorad).
- Saml supernatant fra de centrifugerede rør til ELISA'er. IL-17A ELISAs blev udført ved hjælp af antistof par TC11-18H10 (opsamling, katalognummer 555.068) og TC11-8H4 biotin (afsløring, katalognummer 555.067) købt fra BD Biosciences. IL-17A ELISA standards blev opnået fra eBioscience (katalognummer 14-8171-80).
- Efter fjernelse af supernatanten, opblande de resterende celler, der skal bruges til qPCR i 175 ul RNA lysisbuffer (brug straks for RNA ekstraktion, cDNA syntese, og qPCR, eller opbevares ved -80 ° C til senere brug).
- Der henvises til tabel II for primersekvenser for IL-17A og actin (hus-holder-gen)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne Th17 differentiering protokol begynder med fjernelse af milten og aksillær, brachialis, mesenterial, livmoderhalskræft, og lyske lymfeknuder. En repræsentation af placeringen af hver kan findes i figur 2 og 3.. Figur 1 og 5 både give en visuel repræsentation af de metoder, der er beskrevet i denne protokol.
Denne Th17 protokol fokuserer på differentiering fra CD4 + CD25-T-lymfocyt befolkning. Det er vigtigt at bemærke, hvor effektivt autoMACS Pro Celleseparation beriger vores ønskede CD4 + CD25-populationen fra de samlede totale lymfeknude og milt (figur 4). Den ufraktionerede, samlet lymfeknude og splenocytter og autoMACS adskilte fraktioner blev farvet med antiCD4 og antiCD25-antistoffer efterfulgt af flowcytometrisk analyse (Figur 4). 4A viser en repræsentativ profil af procentdelen af CD4 + CD25 +og CD4 + CD25-lymfocytter til stede i ufraktionerede, poolede lymfeknuder og milt efter flowcytometri. Isoleringen fremgangsmåde giver også en beriget CD4 + CD25 + Treg befolkning fra C57BL / 6 mus, der kan anvendes i yderligere forsøg (figur 4B). Figur 4C viser vores ønskede celle berigelse med en befolkning, der er 84% CD4 + CD25-T-celler, med det store flertal af CD4 + CD25 + tregs fjernet. Vi konsekvent har en lille ikke-lymfoide cellepopulation, der er til stede i den berigede CD4 + CD25-, men gør det ikke interfererer med differentiering proces (figur 4C). Vores beriget CD4 + CD25-T-cellepopulation medvirkende til at sikre en mere vellykket Th17 differentiering.
Figur 5 viser en skematisk gengivelse af vores Th17 differentiering procedure. Vores beriget CD4 + CD25 populationen enten inkuberes under Th17 differentierende betingelser (anti-CD3, anti-CD28, IL-6 og TGF-β) eller kontrol (anti-CD3, anti-CD28). Det kan ses i figur 6, at mens inkubation af CD4 + CD25-T-lymfocytter med anti-CD3, anti-CD28 i 5 dage viste CD25 + T-lymfocytter, inkubation under Th17 inducerende betingelser gav en delmængde af IL17 producerende CD4 + CD25 +-lymfocytter. Der henvises til tabel 1 for eksempler på CD4 + CD25 + IL-17A + absolutte celle nummer udbytter efter fem dage inkubation under iTh17 forhold.
Th17 differentiering status kan yderligere vurderes gennem kvantitativ PCR og ELISA. Figur 7 præsenterer data fra berigede CD4 + CD25-T-lymfocytter inkuberet under kontrol eller Th17-inducerende betingelser. CD4 + CD25-T-lymfocytter inkuberes under Th17 betingelser opregulere IL17A, hvilket kan fastslås ved qPCR (figur 7A) og ELISA (figur 7B). Den Th17 transkriptionsfaktor RORγT også opreguleres af CD4 + CD25-T-celler inkuberet under Th17-inducerende betingelser, og kan konstateres THRdybdegående qPCR (figur 7A).
Figur 1. Th17 Differentiering skematiske. 1. Coat brønde i U-bundede 96 brønds plade med anti-CD3 (10 ug / ml) fortyndet i PBS. 2. Sæt plade i inkubator i 4 timer ved 37 ° C. Mens pladen inkubere, dissekere lymfeknuder (LN) og milt fra mus. Grind organer og filtreres til opnåelse af en enkelt cellesuspension. Isoler CD4 + CD25-T-celler ved hjælp af CD4 + CD25 + Regulatory T-celle Isolation Kit og Miltenyi autoMACS Pro Separator. CD4 + CD25-celler bør fortyndes til 1 x 10 6 celler / ml. 3.. Når 4 timers inkubation i 96 brønds plade er færdig, vaskes brøndene med PBS (200 ul / brønd) 3x. 4. Tilsæt 100 pi CD4 +. CD25-T-celler til plade-bundne (PB) anti-CD3 coatede brønde. 5. Tilsæt 100 ul anti-CD28 eller 100 ul iTh17 cocktail (antiCD28, TGF-β og IL-6). 6. Inkuber plade til 3 eller 5 dage ved 37 ° C. Efter inkubation vurdere differentiering ved intracellulær farvning qPCR og / eller ELISA.
Figur 2. LN Dissection Guide. A) 1 brachialis lymfeknude kan findes i bindevævet beliggende nær hver armhulen (armhule) på musen. B) 1 axillær lymfekirtel kan findes i hver armhulen, bag brystmuskel. C) Mesenteriske lymfeknuder er placeret i bindevæv tarmene. De ligner perler på en snor. D) 4 overfladiske lymfeknuder findes i halsen på musen. E) 2 inguinale lymfeknuder (1 på hver side) kan være placeret i hoften område ved det sted, hvor 3 blodkar mødes .
. Inden-side = "altid"> 
Figur 3. Spleen dissektion vejledning. Mus miltene findes på den venstre side af kroppen bag maven og tarmene. Du skal blot fjerne ved at trække og adskillelse med pincet.
Figur 4.. Cell fraktioner fra puljet LN og miltceller før og efter autoMACS Pro adskillelse. A) LN og miltceller blev farves, ex vivo, at etablere baseline cellepopulationer før adskillelse. Efter separation, CD4 + CD25 + (B) og CD4 + CD25-(C) fraktioner blev farvet for at vurdere renheden af CD4 + CD25 + og CD4 + CD25-T-lymfocyt-populationer, hhv. Alle prøver blev farvet med CD4 + og CD25 +-antistoffer og analyseret ved flowcytometri.
Figur 5. Th17 Differentiering. Cellerne inkuberes i op til 5 dage. Harvest celler til intracellulær farvning og qPCR, høst supernatanter til ELISA.
Figur 6. Th17 differentiering vurderet ved flowcytometri. CD4 + CD25-T-lymfocytter blev inkuberet i nærværelse af pladebundet anti-CD3, anti-CD28, IL-6 og TGF-β (iTh17) eller pladebundet anti-CD3 og anti-CD28 alene (kontrol) for 5 dage. Celler blev derefter aktiveret med PMA og lonomycin i 4 timer ved 37 ° C. Efter aktivering blev celler farvet med anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 og anti-IL-17A antistoffer til flowcytometrisk analyse for at vurdere Th17 differentiering. iTh17 = Th17 inducerende cETINGELSER.
Figur 7. Th17 differentiering vurderes ved qPCR og ELISA. Lymfocytter fra C57BL / 6 mus blev sorteret og CD4 + CD25-T-celler blev inkuberet i nærvær af plade-bundet anti-CD3 (10 ug / ml), anti-CD28 (1,5 ug / ml ), blev IL-6 (20 ng / ml), og TGF-β (5 ng / ml) eller pladebundet anti-CD3 og anti-CD28 alene (kontrol) i 5 dage. A) Celler høstes derefter at vurdere RORγT og IL-17A besked udtryk via qPCR. B) Supernatanter blev høstet for at vurdere IL-17A protein udtryk ved ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet protokollen for at opnå in vitro Th17 differentiering. Studiet af Th17 differentiering er vigtig, da differentiering af T-lymfocytter i Th17 delmængde er kritisk for effektiv eliminering af humane patogener 13. Omvendt har IL17 produktion blevet forbundet med autoimmun sygdom progression 13. Fremgangsmåden ifølge Th17 differentiering er anvendelig til mange forsknings indstillinger som den kan anvendes til mange forskellige murine modeller af immune regulering og autoimmunitet. Denne metode hjælper med at besvare spørgsmål om evne af T-lymfocytter, til at differentiere til en Th17 celle, betegnet i denne protokol ved produktionen af IL-17A og udtryk for transskription faktor RORγT, at modulere immunrespons. Desuden er det blevet vist af andre, at Th17 celler også kan identificeres ved produktionen af IL17F, Il22, og GM-CSF 8, 12. Denne protokol er signifikant med hensyn til andrekendte T-lymfocyt differentiering protokoller, såsom Th1 eller Th2-differentiering, fordi den kan bruges til at supplere disse protokoller med henblik på bedre at forstå hvordan T lymfocyt effektorfunktionerne vedrører immunsystemet operation.
Der er flere kritiske skridt til at overveje, når de foretager disse eksperimenter. Th17 differentiering kan opnås gennem en uren CD4 + CD25-befolkning, men for de mest effektive og pålidelige resultater, er en CD4 + CD25-befolkning på mindst 80% renhed ønskes. Vores metode anvender protokollen fra Miltenyi Biotec for deres autoMACS Pro Cell Separator. Den autoMACS CD4 + CD25 + regulatoriske T Cell Isolation Kit er mus brugt til negativ udvælgelse af CD4 + CD25-celle population. Negativ selektion giver mulighed for anvendelse af naive celler, der ikke er potentielt ændret af antistof interaktioner.
Brugen af visse celleoverflademarkører i flowcytometrisk analyse kan bekræfte renheden af apopulation. De anbefalede overflade markører er CD4, CD8 og CD25, da de let kan identificere den ønskede CD4 + CD25-population. B220 og CD11 kan anvendes til at teste for B-celle-og makrofag forurening, hhv. Prøver konsekvent fortyndet til 1 x 10 6 celler / ml anbefales også, da vi har fundet, at denne koncentration udbytter optimale differentiering. Tidligere har vi fundet, at cellekoncentrationerne, der var for høj eller for lav havde ofte forstyrres cellulær ekspansion og skæve resultater (såsom skæv IL-17A produktion).
Det er også vigtigt at huske at holde prøverne på is på alle tidspunkter, når den ikke er i brug. Cellelevedygtigheden er en vigtig faktor for at opnå positiv Th17 differentiering. Dette kan bekræftes ved celletælling under anvendelse af trypanblåt fortyndinger. Fordi denne protokol beskæftiger manuel væv homogenisering ved formaling af lymfeknuder og milt med matteret objektglas, kan dette være en tidskrævende metode. Et design modification er at udnytte automatiske væv dissociators som en alternativ mulighed.
I tilfælde af, at den ønskede Th17 differentiering ikke er nået, er der flere problemer skydning tips, der bør overvejes. Først kontroller skal også overvejes nøje, således at det sande omfang af Th17 differentiering kan måles korrekt. Vi afgør typisk omfanget af Th17 differentiering ved at sammenligne disse resultater på CD4 + T-lymfocytter, der kun fik anti-CD3 og anti-CD28-stimulering. Husk også, at CD4 + T-lymfocytter skal aktiveres for at differentiere. Man bør også visuelt inspicere dyrkede celler under mikroskop for at bekræfte tilstedeværelsen af sprængte / aktiverede T-celler. Aktiverede T-celler vises visuelt betydeligt større end celler, der ikke er blevet stimuleret. Klonal ekspansion kan også iagttages gennem synlige klynger af sprængning celler, som er blevet afledt fra en enkelt T-celle-klon. Celleaktivering kan også verifikationed ved hjælp af flowcytometrisk analyse ved anvendelse af anti-CD4 og anti-CD25 antistoffer for at identificere CD4 + CD25 + aktiverede celler 4
Det er også vigtigt at nævne, at denne protokol er blevet optimeret til brug med C57BL / 6 mus, dog offentliggjorte data viser, at Th17 differentiering kan opnås i andre musestammer herunder NOD og BALB / c mus 5, 11, 20,. Det skal bemærkes, at Th17 differentiering, herunder samlede frekvens og det absolutte antal af CD4 + T-lymfocytter undergår differentiering er afhængig genetiske faktorer (såsom musestamme) 20 og miljømæssige faktorer (såsom koloni placering) 5 og kan kræve optimering.
Denne Th17 differentiering protokol kan tjene som et værdifuldt instrument til yderligere at besvare spørgsmål om funktionen af celler i Th17 delmængde. Vores metode Th17 differentiering har flere væsentlige fordele. Som tidligere nævnt brugpå minimum 80% ren CD4 + CD25-cellepopulationen giver en mere sammenhængende og effektiv differentiering resultat. Nem isolation ved brug af autoMACS Pro celleseparator er en yderligere fordel. Desuden anvendelse af de optimale cytokin og aktiveringssignaler giver T-celler med den passende miljø til at differentiere. Fremtidige konsekvenser for denne protokol omfatter fastlæggelse af de mekanistiske middel, som Th17 celler og produktionen af IL-17A er involveret i opståen og udvikling af autoimmunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen oplysninger for at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde er delvist understøttet af NIH / NCATS klinisk og translationel Science Awards til University of Florida TL1 TR000066 og UL1 TR000064, en mangfoldighed supplement fra Parent Grant R01AI056152 fra National Institute of Health, en BD Biosciences reagens tilskud, og University Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" x 1"1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt–thanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad | ||
References
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421, 742-748 (2003).
- El-Behi, M., Rostami, A., et al. Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
- Inaba, K., Kroide, S., et al. Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction. Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).
- L, I. vanovF. rutosR., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).
- Jager, L. D., Dabelic, R., et al. The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).
- Kimura, A., Kishimoto, T.
- Korn, T., Bettelli, E., et al.
- Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice. PNAS. 108, 11548-11553 (2011).
- Langrish, C. L., Chen, Y., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).
- Lau, K., Benitez, P., et al. Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias. J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).
- Lee, Y., Awasthi, A., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).
- Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell. 140, 845-858 (2010).
- O'Connor, W. Jr, Kamanaka, M., et al. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).
- Picca, C. C., Larkin, J., et al. Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection. Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).
- Shah, K., Lee, W. W., et al. Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research & Therapy. 12, R53 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R.
- Stockringer, B., Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, 179-189 (2006).
- Zou, Y., Zhang, H., et al. Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis. Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).
