Summary
Med effektorfunksjoner forskjellige fra andre T celle undergrupper, har Th17 celler er sentralt involvert i inflammatorisk autoimmunitet. Denne in vitro Th17 differensiering protokollen gir et middel for å bestemme om naive CD4 + T-lymfocytter kan differensiere til Th17-celler, og for ytterligere å undersøke deres rolle i autoimmunitet og vertsrespons.
Abstract
Th17-celler er en distinkt undergruppe av T-celler som har blitt funnet å produsere interleukin 17 (IL-17), og skiller seg i funksjon fra de andre T-celle-undergrupper inkludert TM1, TM2, og regulatoriske T-celler. Th17 celler har dukket opp som en sentral skyldige i overivrig inflammatoriske immunresponser forbundet med mange autoimmune lidelser. I denne metoden renser vi T-lymfocytter fra milten og lymfeknutene av C57BL / 6 mus, og stimulere rensede CD4 + T celler under kontroll og Th17-induserende miljøer. Den Th17-induserende miljø omfatter stimulering i nærvær av anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer, IL-6, og TGF-β. Etter inkubering i minst 72 timer og opp til fem dager ved 37 ° C, blir cellene deretter analysert for evnen til å produsere IL-17 ved flowcytometri, qPCR og ELISAs. Th17 differensiert CD4 + CD25-T-celler kan benyttes til å videre belyse den rollen som Th17 celler spiller i utbruddet og progresjon av autoimmunitet og vert defense. Videre kan Th17 differensiering av CD4 + CD25-lymfocytter fra forskjellige murine knockout / sykdom modeller bidra til vår forståelse av celle skjebne plastisitet.
Introduction
CD4 + T-lymfocytter (T-celler) spiller en avgjørende rolle i immunforsvaret-mediert forsvar mot smittsomme mikroorganismer. Omvendt, er T-celler også nært forbundet med angrep og progresjon av autoimmune sykdommer slik som type 1-diabetes, systemisk lupus erythematosus og reumatoid artritt. CD4 + T-lymfocytter bli aktivert gjennom en kombinasjon av T-celle reseptor (TCR) interaksjoner med beslektet antigen / store histocompatibility kompleks II (MHCII) molekyler, og CD28 reseptor interaksjoner med B7.1/B7.2 ligands 15. I tillegg til bestemmelse av TCR stimulering og CD28 ko-stimulering, antigen-presenterende celler gir også et cytokin miljø, som bestemmer differensiering tilstand av T-lymfocytter, for derved å dirigere T-lymfocytt respons på det gitte antigen. Tydelig patogen / antigen-presentasjon celle interaksjoner skape distinkte cytokin miljøer, som skew T-lymfocytter ned forskjellige veier fokusert på elimelse av initiere patogen. Dessverre, T-lymfocytter effektor trasé, opprinnelig utviklet for å utrydde invaderende patogener, kan feilaktig rettet mot selv vev 15. Det er derfor bedre forståelse av hver distinkt CD4 + T-celle-undersett er differensiering tilstand avgjørende for forståelsen av hvordan å modulere balanse mellom eliminering av patogener og toleranse mot seg selv.
I tillegg til den TM1, TM2, og induserbare regulatoriske T-celledifferensiering trasé kan naive T-lymfocytter også være drevet av cytokiner nedover Th17 pathway. Mens Th1 celler bekjempe intracellulære patogener, Th2-celler eliminere ekstracellulære patogener, og regulatoriske T-celler (Tregs) redusere inflammatoriske responser 1, 16; Th17 celler spiller en viktig rolle i eliminasjonen av ekstracellulære bakterier og sopp. Th17 celler er generelt angitt med ekspresjon av slekten-spesifikk transkripsjonsfaktor RORγT og produksjon av IL-17A, som fremmer aktiveringen av makrofager og neutrofiler 1, 7.
Th17 celler har vært implisert i flere autoimmune sykdommer, og deres tilknyttede gnager-modeller. For eksempel har det blitt vist at IL-23 (som er nødvendig for å opprettholde den Th17-fenotype), men ikke IL-12, var det sentrale årsaken i eksperimentell autoimmun encefalitt (EAE), en gnager sykdomsmodellen for MS. Det har i ettertid vist seg at reduksjoner i IL-17 produksjon er korrelert til EAE forebygging 2, 6, 17. Videre har Th17-celler er assosiert med andre autoimmune sykdommer, inkludert artritt og systemisk lupus erythematosus (SLE), 10, 16. IL-23 mangel p19 - / - mus ble vist å ha svært lavt antall Th17-celler, og er motstandsdyktige mot å utvikle ikke bare EAE, men også kollagen-indusert artritt, en modell for reumatoid artritt 10, 18. I tillegg, viste mus behandlet med nøytraliserende IL-17A antistoffer akteruteh angrep av kollagen-indusert artritt ble også funnet å ha oppløsning av leddskade 18.. Det bør bemerkes at rollen til Th17-celler i progresjonen av autoimmune sykdommer som gjen karakteriseres som nyere forskning har også vist en beskyttende rolle Th17-celler i type 1 diabetes 9, 11 og intestinal inflammasjon 14.. Disse studiene bekrefter viktigheten av Th17 differensiering i autoimmunitet.
In vitro Th17 differensiering er en nødvendig metode i T-celle forskning fordi det er minst to forvirrende spørsmål som krever videre undersøkelser: 1) Hvor nøyaktig gjør IL-6 regulerer balansen mellom Treg og Th17 differensiering, og 2) hva er de eksakte mekanismene bak IL-17-indusert inflammatoriske lidelser? Vår metode syssels CD4 + CD25-T-celler fra milt og lymfeknuter i C57BL / 6 mus. Det er viktig å merke seg at selv om det er mulig å indusere Th17 differensiering ved bruk av en urenbefolkningen, anskaffe minst en 80% ren CD4 + CD25-T celle befolkningen benekter enhver bekymring for forurensning og sikrer mer vellykkede Th17 differensiering resultater. For å oppnå riktig Th17 differensiering, er CD4 + CD25-T-celler inkubert i nærvær av anti-CD3 og anti-CD28, som gir aktiveringssignaler, 1 og 2, henholdsvis, og IL-6, og TGF-β. Selv om det er blitt rapportert at IL-23 alene kan brukes til å oppnå Th17 differensiering, ble det senere vist at IL-23 er nødvendig for stabiliteten av Th17 cellepopulasjon, men IL-6-og TGF-β er essensielle for Th17 differensiering 3, 18, 19. Murine studier har vist at IL-23 reseptoren uttrykt på CD4 + T-celler etter at de har blitt stimulert med IL-6-og TGF-β 13, 18. Dessuten vil Th17-celler med hell utvikles i nærvær av IL-23-blokkerende antistoffer, så lenge som IL-6-og TGF-β er til stede 18, 19. Som sådan, dette Th17 differensiering protokollen provIdes de riktige forhold for å lykkes indusere Th17 differensiering. Utvikling av en bedre forståelse av mekanismene bak Th17 differensiering og IL-17 produksjon presentere muligheten for utvikling av bedre legemiddelselskap rettet mot autoimmune lidelser 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All bruk dyret ble gjennomført i henhold til protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité.
En. Utarbeidelse av blandinger og Media
- Sterile PBS pH 7,3 (1 liter)
0,23 g NaH 2 PO 4
1,15 g Na 2 HPO 4
9,0 g NaCl
Ta opp volumet med DI vann. Steriliser med autoklav. - Cell Culture Media (100 ml)
89 ml RPMI
10 ml 10% FBS
1 ml Antibiotikum Anti-fungal (ABAM) 100 mg 50 mM 2-merkaptoetanol (3,5 ug lager 2-merkaptoetanol til 96,5 ug PBS) - FACS buffer (Fluorescent Aktivere Cell Sorting) (Brukes under flowcytometri) 2% FBS i sterile PBS
- iTh17 Mix (Basert på antall prøver, bestemme volumet som trengs for alle mikser og media)
1,5 ug / ml anti-CD28
20 ng / ml IL-6
5 ng / mlTGF-β
2. Celler vil bli belagt i tre eksemplarer under følgende forutsetninger
- Plate bundet anti-CD3, anti-CD28 (dette er aktiveringskontrollblanding).
- iTH17: plate bundet anti-CD3, anti-CD28, IL-6, TGF-β.
Tre. Plate-bundet anti-CD3 (10 ug / ml)
Det anbefales at preparatet av plate-bundet anti-CD3 platene gjøres minst 4 timer før det tidspunkt cellene blir tilsatt til platene.
- Tilsett 30 mL anti-CD3 i brønner (anti-CD3 fortynnes i steril PBS) til en ny 96-brønners U-bunn Microtest vevskultur plate og trykker sidene av platen for å sikre et jevnt belegg av brønnene. Inkuber ved 37 ° C i 4 timer, og deretter i kjøleskap inntil det er tid for å legge til mikser og cellene til platen.
4. Mus Dissection
- Denne protokollen er basert på bruk av C57BL / 6 mike, 3-8 måneders alder, og kjøpt fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
- Sacrifice mus å bruke CO 2 kvelning, og bekreft død med påfølgende halshugging.
- Steriliser muse Disseksjonsverktøyer og innsnitt området med 70% etanol og begynne disseksjon.
- Fra ventral utsikt, ta tak i huden som er anterior til urinrørsåpningen og begynne å skjære med en saks opp ventral midtlinjen inntil nå haken området. Ta forholdsregler for ikke å rive eller skjære i slimhinnen i bukhinnen.
- Trekk tilbake på huden og peke ut for å tillate komfortabel tilgang til lymfeknuter under fjerning.
- De lymfeknuter og milt innsamlede vil alle bli fjernet med tang, og plassert i en steril petriskål inneholdende 5 ml av autoMACS rennende buffer kjøpt fra Miltenyi Biotec (se figurene 2 og 3 for lymfeknute-og milt fjerning diagrammer).
- Fjern aksillær lymfeknuter som erfunnet i nærheten av armhulen (armhulen) bak brystmuskulaturen av hver mus.
- Fjern brachialis lymfeknuter som er plassert i bindevev som ligger i nærheten av hver aksille.
- Fjerner overfladiske cervikale lymfeknuter funnet i halsen på hver mus.
- Fjern inguinal lymfeknuter som er plassert i hofteregionen på sammen av de tre blodårer.
- For å få tilgang mesenteric lymfeknuter, skar gjennom peritoneal fôr opp ventral midtlinjen. Mesenteriske lymfeknuter finnes i bindevevet som holder tarmen sammen. De er vanligvis funnet i en snor på 4-8 noder, og kan fremstå som en "perlerad". Sørg for å trekke ut hele strengen.
- Milten ligger i mageområdet, bak magesekken og tarmene. Fjern den ved å dra og løsne det fra bukspyttkjertelen.
- Grind organer under en steril hetten med 2 frostet objektglass. Plasser lymfeknuter eller milt påden mattsiden av en objektglass, og gni med mattsiden av den andre glide inntil oppløst. Gjenta til alle lymfeknuter og milt har vært bakken.
Merk: Det anbefales å starte med lymfeknutene og avslutt med milten, som blodet vil gjøre det vanskelig å se de resterende lymfeknuter i autoMACS buffer.
- For å filtrere bakkeorganene til en enkelt cellesuspensjon, begynner ved å brette over et 40 mikrometer nylonmateriale flere ganger, og å plassere på toppen av et 15 ml sentrifugerør. Den nylonmateriale bør være omtrent 3 x 3 tommer
- Bruk en 5 ml sprøyte og 21 G nål til å suge de 5 ml autoMACS buffer og bakke organer. Tilsett sakte inn i brettet nylon materiale. Pass på å unngå punktering av materialet med nålen.
Merk: Når enkeltcellesuspensjon blir oppnådd, bør oppløsningen ut som en blek, jevn løsning uten visible biter av solid vev. Hvis faststoffene forblir, re-aspirat og dispensere gjennom et nytt foldet stykke av nylon plasseres i et nytt 15 ml sentrifugerør.
- Alltid holde cellene på isen når den ikke er i bruk.
5. Cell Separation
- For optimale resultater, få minst en 80% ren CD4 + CD25-cellen befolkningen gjennom autoMACS Pro celleseparator bruke MACS CD4 + CD25 + regulatoriske T-celle isolasjon kit, mus. Protokollen for den negative oppbevaring av CD4 + CD25-cellepopulasjon er innhentet gjennom Miltenyi Biotec.
6. Th17 Differensiering
- Samle CD4 + CD25-cellepopulasjon etter separasjon med autoMACS Pro celleseparator.
- Telle celler utvannet i en 1:1000 forhold med trypanblått ved hjelp av en hemocytometer.
- Når konsentrasjonen er blitt bestemt fra celletall, fortynnet cellesuspensjon til en 6 x 10 celler / ml i cellekulturmediet.
- Fjern 96 brønners plater med plate bundet anti-CD3 etter 4 timer.
- Vask anti-CD3-belagte brønnene med 200 ul PBS. Gjenta to ganger.
- Å vaske tilsett 200 mikroliter sterilt PBS til anti-CD3-belagte brønner og fjerne PBS i en avfallsbeholder.
- Legg 100 mL av iTh17 mix eller aktivering kontroll mix (se punkt 2) til brønnene i tre eksemplarer.
- Tilsett 100 ul celler til hver brønn i hvilken enten Th17 blanding eller aktiveringskontroll blanding er blitt plassert.
- Inkuber cellene i minst 72 timer og opp til 5 dager (Th17 differensiering kan oppnås etter 72 timer og etter 5 dager.)
- Th17 differensiering kan vurderes ved intracellulær farging og flowcytometrisk analyse, ELISA, eller qPCR
7. Celleaktivering (bare nødvendig for Intracellulær Farging)
- Fjern 96 brønners plater fra inkubatorer ved slutten av enten 72 timer eller 5 dager
- Husker at Th17 differentiation kan oppnås etter enten 72 timer eller 5 dager.
- For hver tilstand (f.eks aktiveringskontroll eller iTh17), overføre celler som er i triplikat i en brønn av en 24 brønners cellekulturplate. Cellene til en tilstand har nå blitt slått sammen til en brønn av 24 brønners kulturplate, i motsetning til å være i triplikat i 96-brønners U bunnkulturplate.
- Det totale volum i hver brønn i 24-brønners cellekulturplate er nå 600 pl. Hev volumet av hver brønn til 1 ml med cellekulturmedier.
- Legg PMA (forbol-myristat-acetat) (50 ng / ml), ionomycin (1 uM), og BFA (Brefeldin-A) (10 ug / ml) til hver brønn i 24 brønners cellekulturplate i de nevnte konsentrasjoner.
- Inkuber ved 37 ° C i 4 timer.
8. Intracellulær Farging
- Stain celler med de ønskede ekstracellulære og intracellulære markører for flowcytometrisk analyse. For å detektere nærværet of IL-17, er intracellulær farging utført med anti-IL-17A-antistoffer. Anbefalt ekstracellulære overflate markører inkluderer CD4, CD8 og CD25.
- Bruk Intracellulær cytokin Farging Starter Kit-mus fra BD Biovitenskap for IL-17 Intracellulær farging.
- For hver prøve, pellet-celler, fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 200 ul FACS-buffer (2% FBS i PBS).
- Overfør resuspenderte celler til 96 celle flowcytometri plate.
- Spinn celler ned i 5 min ved 1200 rpm og kast supernatanten.
- Tilsett 200 mL PBS FACS buffer, sentrifuger i 5 min ved 1200 rpm, og kast supernatanten.
- Resuspender celler i 100 ul FACS-buffer og anvende 100 pl av ekstracellulært antistoff (Ab) blanding (ekstracellulære Ab blanding fremstilles i FACS-buffer). Inkuber i 15 min ved RT, dekket med folie.
- Gjenta trinn 8.1.4.
- Gjenta trinn 8.1.5 2x.
- Suspender cellene i 100 mL av BD Cytofix / Cytoperm Buffer. Incubspiste for 20 min ved RT, dekket med folie.
- Legg 100 mL av 1x BD Perm / vaskebuffer, sentrifuger for 5 min ved 1200 rpm, og kast supernatanten. Gjenta.
- Tilsett 50 pl av intracellulær Ab blandingen. (Intracellulær Ab blanding fremstilles i 1x BD Perm / Wash) Inkuber i 15 min ved RT, dekket med folie.
- Gjenta trinn 8.1.10.
- Suspender cellene i 200 mL av BD Farging Buffer.
- Plasser resuspenderte celler i flowcytometri rør inneholdende 200 ul BD Staining buffer (sluttvolum 400 pl).
- Oppbevar ved 4 ° C før prøvene er klare til å bli lest.
9. Flowcytometrisk analyse
- Gate levende celle befolkningen.
- Fra den levende celle befolkningen, gate på CD4 + CD8-befolkningen.
- Fra CD4 + CD8-befolkningen, gate på IL-17A + befolkningen.
- Basert på våre tidligere eksperimentelle resultater, vil 100% av IL-17A + befolkningen være CD25 +.
* Samlede absolutte celletall ble innhentet etter pooling eksempel triplicates
** Absolutt antall CD4 + CD25 + IL-17A + celler ble bestemt ved å multiplisere det totale antall celler av den levende porten prosent, og prosentandel av alle celler som bærer de lineage-spesifikke markører, CD4, CD25 og IL-17A, som bestemt ved strømningscytometri.
10. qPCR og ELISA
- Plasser cellene ikke brukt for flowcytometrisk analyse i et 1,5 ml Eppendorf-rør og sentrifugert ved 13000 rpm i 5 til 10 min. De celler som finnes i cellepelleten etter sentrifugering vil bli brukt for qPCR analyse. qPCR analyser ble utført ved hjelp av PTC-200 Peltier Thermal cycler (Biorad).
- Samle supernatanten fra den sentrifugerte rør for ELISAs. IL-17A ELISAs ble utført ved hjelp av antistoff pair TC11-18H10 (fangst, katalognummer 555068) og TC11-8H4 biotin (deteksjon, katalognummer 555067) kjøpt fra BD Biosciences. IL-17A ELISA standards ble innhentet fra eBioscience (katalognummer 14-8171-80).
- Etter fjerning av supernatanten, resuspender den gjenværende celler som skal brukes for qPCR i 175 pl RNA lysis buffer (bruk straks for RNA-ekstraksjon, cDNA-syntese, og qPCR, eller lagres ved -80 ° C for senere bruk).
- Se tabell II for primersekvenser for IL-17A og aktin (vaktmester-genet)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette Th17 differensiering protokollen begynner med fjerning av milten og aksillære, brachialis, mesenterisk, cervical og inguinale lymfeknuter. En representasjon av stedene til hver kan finnes i figurene 2 og 3. Figurene 1 og 5 begge gir en visuell representasjon av de metoder som er beskrevet i denne protokollen.
Dette Th17 protokollen fokuserer på differensiering fra CD4 + CD25-T lymfocyttpopulasjonen. Det er viktig å være oppmerksom på hvor effektivt autoMACS Pro Cell separasjon beriker våre ønsket CD4 + CD25-befolkningen fra den samlede totale lymfeknute og milt (figur 4). Det ikke-fraksjonerte, samlede lymfeknute og splenocytter, og autoMACS-separerte fraksjoner ble farget med antiCD4 og antiCD25 antistoffer etterfulgt av flowcytometrisk analyse (Figur 4). Figur 4A viser en representativ profil av prosentandelen av CD4 + CD25 +og CD4 + CD25-lymfocytter som er tilstede i de ikke-fraksjonerte, sammenslåtte lymfeknuter og milt ved strømningscytometri. Isoleringsfremgangsmåten tilveiebringer også en anriket CD4 + CD25 + Treg populasjon fra C57BL / 6 mus, som kan brukes i flere eksperimenter (figur 4B). Figur 4C viser våre ønsket celle anrikning med en populasjon som er 84% CD4 + CD25-T-celler, med det store flertallet av CD4 + CD25 + Tregs fjernet. Vi konsekvent har en liten ikke-lymfoid cellepopulasjon som er tilstede i det anrikede CD4 + CD25-, men gjør det ikke forstyrrer den differensiering prosessen (figur 4C). Vår anriket CD4 + CD25-T-cellepopulasjonen med på å sikre en mer vellykket Th17 differensiering.
Figur 5 viser skjematisk vår Th17 differensiering prosedyre. Vår anriket CD4 + CD25-populasjon er enten inkubert henhold Th17 differensierende forhold (anti-CD3, anti-CD28, IL-6, og TGF-β) eller kontroll (anti-CD3, anti-CD28). Det kan ses i figur 6 at mens inkubasjon av CD4 + CD25-T-lymfocytter med anti-CD3, anti-CD28 i 5 dager overgitt CD25 + T-lymfocytter, inkubering i henhold Th17 induserende betingelser ga en undergruppe av IL17 produserende CD4 + CD25 +-lymfocytter. Se tabell 1 for eksempler på CD4 + CD25 + IL-17A + absolutte celle nummer avkastning etter fem dagers inkubasjon i henhold iTh17 forhold.
Th17 differensiering status kan videre bli vurdert gjennom kvantitativ PCR og ELISA. Figur 7 presenterer data fra beriket CD4 + CD25-T-lymfocytter ruges under kontroll eller Th17-induserende forhold. CD4 + CD25-T-lymfocytter inkubert henhold Th17 betingelser opp-regulere IL17A, noe som kan fastslås gjennom qPCR (figur 7A) og ELISA (figur 7B). Den Th17-spesifikk transkripsjonsfaktor RORγT også er oppregulert ved CD4 + CD25-T-celler inkubert i henhold til Th17-induserende betingelser, og kan fastslås through qPCR (figur 7A).
Figur 1. Th17 Differensiering skjematisk. 1. Coat brønner av U-bunnet 96-brønners plate med anti-CD3 (10 ug / ml) fortynnet i PBS. 2. Place plate i inkubator i 4 timer ved 37 ° C. Mens platen er ruger, dissekere lymfeknuter (LN) og milt fra mus. Grind organer og filtrer for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Isoler CD4 + CD25-T-celler ved hjelp av CD4 + CD25 + Regulatory T celle Isolation Kit og Miltenyi autoMACS Pro Separator. CD4 + CD25-celler fortynnes til 1 x 10 6 celler / ml. Tre. Når 4 timers inkubering i 96 brønn plate er fullført, vaskes brønnene med PBS (200 pl / brønn) 3 x. 4.. Tilsett 100 pl CD4 + CD25-T-celler til plate-bundet (PB) anti-CD3 belagte brønner. fem. Tilsett 100 ul anti-CD28 eller 100 pl iTh17 cocktail (antiCD28, TGF-β, og IL-6). 6.. Inkuber platen i 3 eller 5 dager ved 37 ° C. Etter inkubasjon vurdere differensiering av intracellulær farging, qPCR, og / eller ELISA.
Figur 2. LN Guide Dissection. A) en brachialis lymfeknute kan finnes i bindevevet som ligger i nærheten av hver aksille (armhulen) av musen. B) en aksillær lymfeknute kan bli funnet i hver armhule, bak brystmuskulaturen. C) mesenteric lymfeknuter er lokalisert i bindevevet i tarmen. De ligner en perlerad. D) 4 overfladiske cervical lymfeknuter er funnet i halsen av musen. E) 2 lyske lymfeknuter (en på hver side) kan være plassert i hofteregionen på stedet der tre blodkar møte .
. Innen-page = "always"> 
Figur 3. Spleen disseksjon guide. Muse Miltene finnes på venstre side av kroppen bak magen og tarmene. Bare fjerne ved å dra og skille med pinsett.
Figur 4. Cell fraksjoner fra samlet LN og miltceller før og etter autoMACS Pro separasjon. A) LN og miltceller ble farget, ex vivo, for å etablere baseline celle populasjoner før separasjon. Etter separasjon, CD4 + CD25 + (B) og CD4 + CD25-(C)-fraksjonene ble farget for å bedømme renheten av CD4 + CD25 + og CD4 + CD25-T-lymfocytt-populasjoner, respektivt. Alle prøver ble farget med CD4 + og CD25 +-antistoff og analysert ved strømningscytometri.
Figur 5. Th17 Differensiering. Inkuber cellene i opp til fem dager. Slakte celler for intracellulær farging og qPCR, høste Supernatanter for ELISA.
Figur 6. Th17 differensiering vurderes av flowcytometri. CD4 + CD25-T-lymfocytter ble inkubert i nærvær av plate-bundet anti-CD3, anti-CD28, IL-6, og TGF-β (iTh17) eller plate-bundet anti-CD3 og anti-CD28 alene (kontroll) i 5 dager. Celler ble deretter aktivert med PMA og ionomycin i 4 timer ved 37 ° C. Etter aktivering, ble cellene farget med anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25, og anti-IL-17A antistoffer for flowcytometrisk analyse for å vurdere Th17 differensiering. iTh17 = Th17 induserende conditions.
Figur 7. Th17 differensiering vurdert ved qPCR og ELISA. Lymfocytter fra C57BL / 6 mus ble sortert og CD4 + CD25-T-celler ble inkubert i nærvær av plate-bundet anti-CD3 (10 ug / ml), anti-CD28 (1,5 ug / ml ), IL-6 (20 ng / ml), og TGF-β (5 ng / ml) eller plate-bundet anti-CD3 og anti-CD28 alene (kontroll) i 5 dager. A) Celler ble deretter høstet for å vurdere RORγT og IL-17A melding uttrykk via qPCR. B) Supernatanter ble høstet for å vurdere IL-17A protein uttrykk ved ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet protokollen for å oppnå in vitro Th17 differensiering. Studiet av Th17 differensiering er viktig, som differensiering av T-lymfocytter inn i Th17 undergruppe er avgjørende for effektiv eliminering av menneskelige patogener 13. Motsatt har IL17 produksjonen vært forbundet med autoimmune sykdomsprogresjon 13. Metoden for Th17 differensiering kan anvendes på mange forsknings innstillinger som det kan brukes på en rekke forskjellige murine modeller av immun regulering og autoimmunitet. Denne fremgangsmåten bidrar til å svare på spørsmål angående evnen til T-lymfocytter, for å skille ut et Th17 celle, betegnet i denne protokollen ved produksjon av IL-17A og ekspresjonen av transkripsjonsfaktor RORγT, for å modulere immunresponser. Videre har det blitt vist av andre, at Th17-celler kan også bli identifisert ved fremstilling av IL17F, Il22, og GM-CSF 8, 12. Denne protokollen er betydelig i forhold til andrekjente T-lymfocytter differensiering protokoller, for eksempel Th1 eller Th2 differensiering, fordi det kan brukes til å komplettere disse protokollene for å bedre forstå hvordan T-lymfocytter effektorfunksjoner forholde seg til immunsystemdrift.
Det er flere viktige skritt for å vurdere når du utfører disse eksperimentene. Th17 differensiering kan oppnås gjennom en uren CD4 + CD25-befolkningen, men for de mest effektive og pålitelige resultater, er en CD4 + CD25-befolkning på minst 80% renhet ønsket. Vår metode benytter protokollen levert av Miltenyi Biotec for deres autoMACS Pro celleseparator. Den autoMACS CD4 + CD25 + Regulatory T Cell Isolation Kit, er mus brukes for negativ seleksjon av CD4 + CD25-cellepopulasjon. Negativ valg tillater bruk av naive celler som ikke er blitt endret av potensielt antistoffinteraksjoner.
Bruk av visse markører på celleoverflaten i flowcytometrisk analyse kan bekrefte renheten av apopulation. De anbefalte overflatemarkører er CD4, CD8 og CD25 som de kan lett identifisere den ønskede CD4 + CD25-befolkningen. B220 og CD11b kan anvendes for å teste for B-celle-og makrofag forurensninger, henholdsvis. Prøvene gående fortynnet til 1 x 10 celler / ml til 6 er også anbefalt som vi har funnet at denne konsentrasjons utbytter optimal differensiering. I det siste har vi funnet at cellekonsentrasjoner som var for høyt eller for lavt ofte hadde opprørt cellular ekspansjon og partisk resultater (for eksempel skjev IL-17A produksjon).
Det er også viktig å huske på å holde prøvene på is hele tiden når den ikke er i bruk. Celleviabilitet er en viktig faktor for å oppnå positive Th17 differensiering. Dette kan bli bekreftet gjennom celletelling ved hjelp av trypanblått-fortynninger. Fordi denne protokollen benytter manuell vev homogenisering av sliping lymfeknuter og milt med frostet objektglass, kan dette være en tidkrevende metode. En utforming modification er å utnytte automatiske vev dissociators som et alternativ.
I det tilfelle at den ønskede Th17 differensiering ikke er oppnådd, er det flere problemer med skyte tips som bør vurderes. Først kontroller må også vurderes nøye, slik at det virkelige omfanget av Th17 differensiering kan være riktig målt. Vi vanligvis bestemme graden av Th17 differensiering ved å sammenlikne disse resultater til CD4 + T-lymfocytter som kun fikk anti-CD3 og anti-CD28-stimulering. Husk også at CD4 + T-lymfocytter må aktiveres for differentiate. Man bør også visuelt inspisere dyrkede celler under mikroskopet for å bekrefte tilstedeværelse av sprengt / aktiverte T-celler. Aktiverte T-celler visuelt synes betydelig større enn celler som ikke er stimulert. Klonal ekspansjon kan også observeres gjennom synlige klynger av sprengnings celler som er blitt utledet fra en enkelt T-celle-klonen. Celleaktivering kan også være verifiseringed ved bruk av strømningscytometrisk analyse ved å bruke anti-CD4-og anti-CD25-antistoffer for å identifisere CD4 + CD25 + celler aktiverte 4
Det er også viktig å nevne at denne protokollen er optimalisert for bruk med C57BL / 6 mus, men publiserte data viser at Th17 differensiering kan oppnås på andre musestammer inkludert NOD og BALB / c mus 5, 11, 20. Det bør bemerkes at Th17 differensiering, inkludert total frekvens og absolutte antall CD4 + T-lymfocytter som gjennomgår differensiering, er avhengig av genetiske faktorer (slik som mus-stamme) 20, samt miljøfaktorer (slik som koloni plassering) 5 og kan kreve optimalisering.
Dette Th17 differensiering protokollen kan tjene som en uvurderlig måte å ytterligere svare på spørsmål angående funksjonen til cellene i Th17 undergruppe. Vår metode for Th17 differensiering har flere viktige fordeler. Som tidligere nevnt er brukenav minst 80% rent CD4 + CD25-cellepopulasjon gir en mer jevn og effektiv differensiering resultat. Enkel isolering ved bruk av autoMACS Pro celleseparatoren er en ekstra fordel. Videre er bruk av de optimale cytokin-og aktiveringssignaler gir T-celler med det passende miljø å differensiere. Fremtidige konsekvenser for denne protokollen inkluderer fastsettelse av mekanistiske middel som Th17 celler og produksjon av IL-17A er involvert i utbruddet og progresjon av autoimmunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen opplysninger for å fortolle.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes delvis av NIH / NCATS Kliniske og translasjonell forskning Awards til University of Florida TL1 TR000066 og UL1 TR000064, et mangfold supplement fra Parent Grant R01AI056152 fra National Institute of Health, en BD Biosciences reagens stipend, og universitetet av Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" x 1"1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt–thanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad | ||
References
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421, 742-748 (2003).
- El-Behi, M., Rostami, A., et al. Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
- Inaba, K., Kroide, S., et al. Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction. Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).
- L, I. vanovF. rutosR., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).
- Jager, L. D., Dabelic, R., et al. The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).
- Kimura, A., Kishimoto, T.
- Korn, T., Bettelli, E., et al.
- Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice. PNAS. 108, 11548-11553 (2011).
- Langrish, C. L., Chen, Y., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).
- Lau, K., Benitez, P., et al. Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias. J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).
- Lee, Y., Awasthi, A., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).
- Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell. 140, 845-858 (2010).
- O'Connor, W. Jr, Kamanaka, M., et al. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).
- Picca, C. C., Larkin, J., et al. Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection. Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).
- Shah, K., Lee, W. W., et al. Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research & Therapy. 12, R53 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R.
- Stockringer, B., Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, 179-189 (2006).
- Zou, Y., Zhang, H., et al. Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis. Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).
