Summary
Mit Effektor-Funktionen deutlich von anderen T-Zell-Untergruppen, Th17-Zellen wurden zentral bei entzündlichen Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Diese in vitro-Differenzierung Th17-Protokoll bietet die Möglichkeit, festzustellen, ob naiven CD4 +-T-Lymphozyten in Th17-Zellen zu differenzieren und ihre Rolle in der Autoimmun-und Wirtsantwort weiter zu prüfen.
Abstract
Th17-Zellen sind eine eindeutige Untergruppe von T-Zellen, die gefunden wurden, Interleukin 17 (IL-17), und unterscheiden sich in Abhängigkeit von den anderen T-Zell-Subpopulationen einschließlich Th1, Th2 und regulatorischen T-Zellen. Th17-Zellen als zentrale Täter in übereifrigen entzündlichen Immunreaktionen bei vielen Autoimmunerkrankungen assoziiert entstanden. Bei dieser Methode reinigen wir T-Lymphozyten aus der Milz und den Lymphknoten von C57BL / 6 Mäusen, und fördern gereinigten CD4 + T-Zellen unter Kontrolle und Th17-induzierende Umgebung. Die Th17-induzierende Umgebung umfasst Stimulation in Gegenwart von Anti-CD3 und Anti-CD28-Antikörper, IL-6 und TGF-β. Nach einer Inkubationszeit von mindestens 72 Stunden und für bis zu fünf Tage bei 37 ° C werden die Zellen anschließend für die Fähigkeit, IL-17 durch die Strömung zu erzeugen Zytometrie, qPCR und ELISAs analysiert. Th17 differenzierten CD4 + CD25-T-Zellen können genutzt werden, um weitere Aufklärung der Rolle, die Th17-Zellen bei der Entstehung und Progression von Autoimmun-und Host-de spielenfense. Darüber hinaus können Th17 Differenzierung von CD4 + CD25-Lymphozyten aus unterschiedlichen murinen Knockout / Krankheitsmodelle zu unserem Verständnis des Zellschicksals Plastizität beitragen.
Introduction
CD4 +-T-Lymphozyten (T-Zellen) spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunsystem-vermittelte Abwehr gegen infektiöse Mikroorganismen. Umgekehrt T-Zellen sind auch eng mit dem Auftreten und Fortschreiten von Autoimmunkrankheiten wie Typ-1-Diabetes, systemischer Lupus erythematodes und rheumatoide Arthritis. CD4 +-T-Lymphozyten aktiviert werden durch eine Kombination von T-Zell-Rezeptor (TCR)-Wechselwirkungen mit verwandten Antigen / II-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC II)-Moleküle, und CD28-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen mit B7.1/B7.2 15. Neben der Bereitstellung der TCR-Stimulation und CD28-Co-Stimulierung, Antigen-präsentierende Zellen zudem eine Zytokin-Umgebung, die den Zustand der Differenzierung von T-Lymphozyten bestimmt, und dadurch die Reaktion der T-Lymphozyten auf ein gegebenes Antigen zu lenken. Distinct Erreger / Antigen-präsentierenden Zelle Interaktionen schaffen unterschiedliche Zytokin-Umgebungen, die T-Lymphozyten nach unten neigen verschiedene Wege auf dem eli konzentriertmung des auslösenden Erregers. Leider Effektor-T-Lymphozyten-Bahnen, ursprünglich entworfen, um eindringende Krankheitserreger zu beseitigen, können irrtümlich gegen Selbst Gewebe 15 gerichtet werden. Daher ist ein besseres Verständnis der Differenzierungszustand jede unterschiedliche CD4 +-T-Zell-Untergruppe ist entscheidend für das Verständnis, wie das Gleichgewicht zwischen Eliminierung von Pathogenen und Toleranz gegenüber Selbst modulieren.
Neben der Th1, Th2 und induzierbare regulatorische T-Zellen-Differenzierungswege können naive T-Lymphozyten auch durch Cytokine auf der Th17 Bahn angetrieben werden. Während Th1-Zellen bekämpfen intrazelluläre Erreger, Th2-Zellen zu eliminieren extrazellulären Krankheitserregern und regulatorische T-Zellen (Tregs) zu minimieren Entzündungsreaktionen 1, 16; Th17-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Beseitigung von extrazellulären Bakterien und Pilze. Th17-Zellen sind in der Regel durch Expression der linienspezifischen Transkriptionsfaktor RORγT und Produktion von IL bezeichnet-17A, die die Aktivierung von Makrophagen und Neutrophilen 1, 7 fördert.
Th17-Zellen in Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht, und ihre zugehörigen Nagetiermodellen. Beispielsweise wurde gezeigt, dass IL-23 (das erforderlich ist, um den Phänotyp zu erhalten Th17), aber nicht IL-12, war die zentrale Täter bei experimenteller Autoimmun-Enzephalitis (EAE), das Nagetier Krankheitsmodell für MS. Es wurde anschließend gezeigt, dass Kürzungen der IL-17 Produktion zu EAE Prävention 2, 6, 17 korreliert. Außerdem haben Th17 Zellen mit anderen Autoimmunerkrankungen wie Arthritis und systemischem Lupus erythematodes (SLE) 10, 16 verbunden. IL-23 p19-defiziente - / - Mäusen wurde gezeigt, dass eine sehr geringe Zahl von Th17 Zellen haben, und sind resistent gegenüber der Entwicklung der EAE nicht nur, sondern auch die Kollagen-induzierte Arthritis, ein Modell für rheumatoide Arthritis, 10, 18. Außerdem Mäuse mit neutralisierenden IL-17A Antikörper behandelt achterner das Auftreten von Kollagen-induzierter Arthritis wurden auch gefunden, um die Auflösung von Gelenkschäden 18 aufweisen. Es sei darauf hingewiesen, dass die Rolle von Th17 Zellen beim Fortschreiten der Autoimmunerkrankung bleibt, dadurch gekennzeichnet, da neuere Forschung hat auch eine schützende Rolle von Th17 Zellen in Diabetes Typ 1 9, 11 und 14 gezeigt Darmentzündung ist. Diese Studien bestätigen die Bedeutung der Th17 Differenzierung der Autoimmunität.
In-vitro-Th17 Differenzierung ist eine notwendige Methode in T-Zell-Forschung, denn es gibt mindestens zwei verwirrende Fragen, die weiterer Untersuchungen bedürfen: 1) Wie genau funktioniert IL-6 reguliert die Balance zwischen Treg und Th17 Differenzierung und 2) was sind die genauen Mechanismen hinter IL-17-induzierte Entzündungserkrankungen? Unser Verfahren verwendet CD4 + CD25-T-Zellen aus der Milz und den Lymphknoten der C57BL / 6 Maus. Es ist wichtig zu beachten, dass, obwohl es möglich ist, Th17 Differenzierung induzieren Verwendung eines unreinenBevölkerung, den Erwerb von zumindest 80% reines CD4 + CD25-T-Zellpopulation negiert Sorge der Verschmutzung und sorgt für mehr Erfolg Th17 Differenzierung Ergebnisse. Um die ordnungsgemäße Th17 Differenzierung zu erreichen, sind CD4 + CD25-T-Zellen in Gegenwart von Anti-CD3 und Anti-CD28, die Aktivierungssignale zu liefern, 1 bzw. 2 inkubiert und IL-6 und TGF-β. Obwohl berichtet wurde, dass IL-23 allein verwendet werden, um Th17 Differenzierung zu erreichen, wurde später gezeigt, dass IL-23 ist für die Stabilität des Th17 Zellpopulation notwendig, aber IL-6 und TGF-β sind für Th17 Differenzierung 3, 18, 19. Maus-Studien haben gezeigt, dass die IL-23-Rezeptors auf CD4 + T-Zellen exprimiert wird nur, nachdem sie mit IL-6 und TGF-β 13, 18 angeregt. Auch wird Th17 Zellen erfolgreich in Gegenwart von IL-23-blockierende Antikörper zu entwickeln, solange IL-6 und TGF-β vorhanden 18, 19 sind. Als solcher, diese Th17 Differenzierung Protokoll provIdes die geeigneten Bedingungen zu Th17 Differenzierung erfolgreich zu induzieren. Entwicklung eines besseren Verständnis der Mechanismen, die Th17 Differenzierung und IL-17 Produktion präsentieren die Chance für die Entwicklung besserer Therapien bei Autoimmunerkrankungen 13 ausgerichtet.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt durchgeführt.
1. Herstellung von Mischungen und Medien
- Sterile PBS pH 7,3 (1 l)
0,23 g NaH 2 PO 4
1,15 g Na 2 HPO 4
9,0 g NaCl
Nehmen Sie Volumen mit DI-Wasser. Sterilisieren mit Autoklaven. - Zellkulturmedium (100 ml)
89 ml RPMI
10 ml 10% FBS
1 ml Antibiotika-Antimykotika (ABAM) 100 ug 50 mM 2-Mercaptoethanol (3,5 ug Lager 2-Mercaptoethanol in 96,5 ug PBS) - FACS-Puffer (Fluorescent aktivieren Cell Sorting) (Um während der Durchflusszytometrie verwendet werden) 2% FBS in sterilem PBS
- iTh17 Mix (Basierend auf der Anzahl der Proben, bestimmen die für alle Mischungen und Medien benötigt Volumen)
1,5 ug / ml Anti-CD28-
20 ng / ml IL-6
5 ng / mlTGF-β
2. Zellen in dreifacher Ausfertigung unter den folgenden Bedingungen plattiert werden
- Platte gebundenen Anti-CD3, Anti-CD28 (dies ist die Aktivierungssteuer mix).
- iTH17: Platte gebundenen Anti-CD3-, anti-CD28, IL-6, TGF-β.
3. Platte gebundenen Anti-CD3 (10 &mgr; g / ml)
Es wird empfohlen, daß die Herstellung der Platte gebundenen Anti-CD3-Platten wird mindestens 4 Stunden vor dem Zeitpunkt, Zellen zu den Platten hinzugefügt werden, erfolgen.
- In 30 ul Anti-CD3-Vertiefungen einer neuen 96-Loch-U-Boden Microgewebekulturplatte (anti-CD3 wird in sterilem PBS verdünnt), und tippen Sie auf die Seiten der Platte, um eine gleichmäßige Abdeckung der Brunnen zu gewährleisten. Bei 37 ° C für 4 h und dann im Kühlschrank lagern, bis es Zeit ist, die Mischungen und die Zellen an der Platte hinzufügen.
4. Maus-Dissection
- Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung von C57BL / 6 mic basierende, 3-8 Monate alt, und von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) bezogen.
- Sacrifice Maus mit CO 2-Erstickung und bestätigen Tod mit anschließender Genickbruch.
- Sterilisieren Mäuse Dissektion Werkzeuge und Schnittbereich mit 70% Ethanol und beginnen Dissektion.
- Von der ventralen Ansicht, greifen die Haut, die vordere ist der Harnröhrenöffnung und beginnen mit einer Schere die ventralen Mittellinie bis zum Erreichen der Kinnbereich. Treffen Sie Vorkehrungen nicht zu reißen oder schneiden in der Auskleidung der Bauchwand.
- Ziehen Sie auf der Haut und festzunageln, um einen komfortablen Zugang zu den Lymphknoten bei der Entnahme zu ermöglichen.
- Die Lymphknoten und Milz gesammelt werden alle mit einer Pinzette entfernt und in eine sterile Petrischale mit 5 ml Laufpuffer autoMACS gekauft von Miltenyi Biotec (siehe Fig. 2 und 3 für die Lymphknoten und Milz Entfernungsbilder) platziert.
- Entfernen Sie die axillären Lymphknoten, die sindgefunden, in der Nähe der Achselhöhle (Achselhöhle), die hinter dem Brustmuskel jeder Maus.
- Entfernen der Brachial Lymphknoten, im Bindegewebe der Nähe jeder Achselhöhle entfernt befinden.
- Entfernen der oberflächlichen Lymphknoten im Hals jeder Maus gefunden.
- Entfernen Sie die Leistenlymphknoten, die im Bereich der Hüfte an der Verbindung der drei Blutgefäße befinden.
- Um die mesenterialen Lymphknoten, durch die Bauchfellfutter bis der ventralen Mittellinie geschnitten zugreifen. Mesenterialen Lymphknoten im Bindegewebe, die den Darm zusammenhält gefunden. Sie werden in der Regel in einer Kette von 4-8 Knoten gefunden, und kann als eine "Perlenkette" angezeigt. Achten Sie darauf, den gesamten String herauszuziehen.
- Die Milz ist in der Bauchgegend, hinter dem Magen und Darm. Entfernen Sie es durch Ziehen und Lösen aus der Bauchspeicheldrüse.
- Grind Organe unter einer sterilen Haube mit 2 bereift Objektträger. Zeigen Lymphknoten oder Milz aufdie mattierte Seite eines Mikroskop-Objektträger, und reiben mit Milch Seite der zweiten Folie, bis zerfallen. Wiederholen, bis alle Lymphknoten und Milz wurden gemahlen.
Hinweis: Es wird empfohlen, mit den Lymphknoten beginnen und enden mit der Milz, das Blut wird es schwierig, die übrigen Lymphknoten in der autoMACS Puffer zu sehen.
- Um irdischen Organen in eine Einzelzellsuspension zu filtern, beginnen durch Falten über ein Stück von 40 um Nylonmaterial mehrere Male, und Platzierung in der Spitze einer 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Das Nylon-Material sollte in etwa 3 x 3 in.
- Verwenden Sie eine 5-ml-Spritze und 21 G-Nadel, die 5 ml autoMACS Laufpuffer und Boden Organe abzusaugen. Dispense langsam in den gefalteten Nylon-Material. Achten Sie darauf, um zu vermeiden, Punktion des Materials mit der Nadel.
Hinweis: Nach Einzelzellsuspension erreicht ist, sollte die Lösung als eine blasse, durchgängige Lösung mit nicht visib erscheinenle Stücke von festem Gewebe. Wenn Feststoffe bleiben, wieder absaugen und durch eine neue zu verzichten gefaltetes Stück Nylon in ein neues 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben.
- Halten Sie immer Zellen auf Eis, wenn sie nicht in Gebrauch ist.
5. Zellseparation
- Für optimale Ergebnisse zu erhalten, zumindest eine 80% reinen CD4 + CD25-Zellpopulation durch autoMACS Pro Handy Separator mit Hilfe der MACS CD4 + CD25 + regulatorische T-Zell-Isolations-Kit, Maus. Das Protokoll für die negative Beibehaltung der CD4 + CD25-Zellpopulation durch Miltenyi Biotec erhalten.
6. Th17 Differenzierung
- Sammeln Sie die CD4 + CD25-Zellpopulation nach der Trennung mit dem autoMACS Pro Handy Separator.
- Zählen von Zellen in einem Verhältnis 1:1000 mit Trypanblau mit einer Zählkammer verdünnt.
- Sobald Konzentration von Zellzahlen wurden bestimmt, verdünnte Zellsuspension auf 1 x 10 6 Zellen / ml in Zellkulturmedien.
- Nehmen Sie 96-Well-Platten mit Platten gebundenen Anti-CD3 nach 4 Stunden.
- Mit 200 &mgr; l PBS waschen, Anti-CD3-beschichteten Vertiefungen. 2 mal wiederholt.
- Zum Waschen mit 200 ul sterilem PBS auf Anti-CD3-beschichteten Wells und entfernen PBS in einen Abfallbehälter.
- 100 l des iTh17 Mix oder Aktivierung Kontrollmischung (siehe Punkt 2) in die Vertiefungen in dreifacher Ausfertigung.
- 100 ul der Zellen in jede Vertiefung in dem entweder die Mischung Th17 oder der Aktivierungskontrollmischung platziert wurde.
- Inkubieren Zellen für mindestens 72 Stunden oder bis zu 5 Tage (Th17 Differenzierung nach 72 h oder nach 5 Tagen erhältlich.)
- Th17 Differenzierung kann durch intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie, ELISA, oder qPCR bewertet werden
7. Zell-Aktivierung (Nur Notwendig für die intrazelluläre Färbung)
- Entfernen Platten mit 96 Vertiefungen von Inkubatoren am Ende entweder 72 Stunden oder 5 Tage
- Daran erinnern, dass Th17 differentiation kann entweder nach 72 h oder 5 Tagen erreicht werden.
- Für jede Bedingung (zB Aktivierung Kontrolle oder iTh17), Transfer-Zellen, die in dreifacher Ausfertigung sind in eine Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte. Die Zellen für eine Bedingung sind nun in einer Vertiefung der 24-Well-Kulturplatte gebündelt, im Gegensatz zu in dreifacher Ausfertigung in der 96-Well-Kulturplatte U-Boden.
- Das Gesamtvolumen der in jede Vertiefung der 24-Well-Zellkulturplatte ist jetzt 600 ul. Erhöhen das Volumen jeder Vertiefung 1 ml der Zellkultur-Medien.
- Hinzufügen PMA (Phorbol-Myristat-Acetat) (50 ng / ml), Ionomycin (1 &mgr; M) und BFA (Brefeldin-A) (10 ug / ml) in jede Vertiefung der 24-Well-Zellkulturplatte bei den genannten Konzentrationen.
- Inkubieren bei 37 ° C für 4 Stunden.
8. Intrazelluläre Färbung
- Stain-Zellen mit den gewünschten extrazelluläre und intrazelluläre Marker für die Durchflusszytometrie. Um die Anwesenheit o erkennenf IL-17, ist die intrazelluläre Färbung mit Anti-IL-17A-Antikörper durchgeführt. Empfohlene extrazellulären Oberflächenmarker gehören CD4, CD8 und CD25.
- Verwenden Sie die intrazelluläre Zytokin-Färbung Starter Kit-Maus von BD Bioscience für IL-17 Intrazelluläre Färbung.
- Für jede Probe Pellet Zellen, entfernen Standes und Resuspension Zellpellet in 200 &mgr; l FACS Puffer (2% FBS in PBS).
- Übertragen resuspendierten Zellen zu 96 Zell Durchflusszytometrie Platte.
- Spin Zellen nach unten für 5 min bei 1.200 rpm und Überstand verwerfen.
- In 200 ul PBS FACS-Puffer, Zentrifuge für 5 min bei 1.200 rpm und Überstand verwerfen.
- Die Zellen in 100 &mgr; l FACS-Puffer und 100 ul gelten extrazelluläre Antikörper (Ab)-Gemisch (extrazelluläre Ab Gemisch in FACS-Puffer hergestellt). Inkubation für 15 min bei RT, mit Folie abgedeckt.
- Wiederholen Sie Schritt 8.1.4.
- Wiederholen Sie Schritt 8.1.5 2x.
- Die Zellen in 100 ul BD Cytofix / Cytoperm Puffer. Incubaß für 20 min bei RT, mit Folie abgedeckt.
- 100 l 1x BD Perm / Wash-Puffer, Zentrifugieren für 5 min bei 1.200 rpm und Überstand verwerfen. Wiederholen.
- In 50 ul der intrazellulären Ab-Mischung. Inkubation für 15 min bei RT (Intrazelluläre Ab Mischung wird in 1x BD Perm / Wash gemacht), mit Folie abgedeckt.
- Wiederholen Sie Schritt 8.1.10.
- Die Zellen in 200 ul Puffer BD Färbung.
- Zeigen resuspendierten Zellen in der Durchflusszytometrie Röhrchen mit 200 ul BD Färbepuffer (Endvolumen 400 ul).
- Lagerung bei 4 ° C bis Proben bereit sind, gelesen werden.
9. Durchflusszytometrische Analyse
- Tor Live-Zellpopulation.
- Von der Live-Zellpopulation, Tor auf CD4 + CD8-Bevölkerung.
- Von der CD4 + CD8-Bevölkerung, Tor auf IL-17A + Bevölkerung.
- Aufgrund unserer bisherigen Versuchsergebnisse werden mit 100% der IL-17A + CD25 +-Population sein.
* Gesamt absolute Zellzahlen wurden nach Bündelung der Probe dreifach erhalten
** Absolute Zahl der CD4 + CD25 + IL-17A +-Zellen wurde durch Multiplizieren der Gesamtzahl der lebenden Zellen durch das Gate-Anteil und der Anteil der gesamten Zellen, die das linienspezifischen Markern, CD4, CD25 und IL-17A, wie bestimmt mittels Durchflusszytometrie bestimmt.
10. qPCR und ELISA
- Ortszellen für die durchflusszytometrische Analyse in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und Zentrifugieren bei 13.000 rpm für 5-10 min verwendet. Die Zellen in dem Zellpellet wird nach der Zentrifugation gefunden für qPCR-Analyse verwendet werden. qPCR-Analyse wurde mit PTC-200 Peltier-Thermocycler (Biorad).
- Sammeln Stand aus den Röhrchen zentrifugiert ELISAs. IL-17A ELISAs wurden mit Antikörperpaar TC11-18h10 (Capture, Katalognummer 555068) und TC11-8H4 Biotin (Detektion, Katalognummer 555067) von BD Biosciences gekauft. IL-17A ELISA standards wurden von eBioscience (Katalognummer 14-8171-80) erhalten.
- Nach Entfernen des Überstandes, Resuspendieren der übrigen Zellen für qPCR in 175 ul RNA Lyse-Puffer verwendet werden (bitte sofort zur RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und qPCR oder bei -80 ° C zur späteren Verwendung).
- Siehe Tabelle II für die Primer-Sequenzen für die IL-17A und Aktin (Housekeeping-Gen)
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Representative Results
Diese Th17 Differenzierung Protokoll beginnt mit der Entnahme der Milz und dem Achsel, brachialis, mesenterialen, Gebärmutterhalskrebs und inguinalen Lymphknoten. Eine Darstellung der Orte der jeweils in den Fig. 2 und 3 entnommen werden. Fig. 1 und 5 sowohl eine visuelle Darstellung der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren.
Diese Th17-Protokoll konzentriert sich auf die Differenzierung von CD4 + CD25-T-Lymphozyten-Population. Es ist wichtig zu beachten, wie effizient die autoMACS Pro Zelltrennung bereichert unsere gewünschten CD4 + CD25-Population aus der gepoolten Gesamt Lymphknoten und Milz (Abbildung 4). Die fraktionierten, vereinigt Lymphknoten und Milzzellen und die autoMACS getrennte Fraktionen wurden mit Anti-CD4-Antikörper und antiCD25 gefolgt durch durchflusszytometrische Analyse (Fig. 4) gefärbt. Fig. 4A zeigt ein repräsentatives Profil der Prozentsatz von CD4 + CD25 +und CD4 + in den unfraktioniertem, gepoolten Lymphknoten und Milz mittels Durchflusszytometrie vorhanden CD25-Lymphozyten. Das Isolierungsverfahren ermöglicht auch eine angereicherte CD4 + CD25 + Treg Population von C57BL / 6 Mäusen, die in zusätzlichen Experimenten (4B) verwendet werden können. 4C zeigt unsere gewünschten Zellanreicherung mit einer Bevölkerung, 84% CD4 + CD25-T-Zellen ist, mit der überwiegenden Mehrzahl der CD4 + CD25 + Treg entfernt. Wir haben durchweg eine kleine nicht-lymphatischen Zellpopulation, die in der angereicherten CD4 + CD25-vorhanden ist, aber hat es nicht mit dem Differenzierungsprozess (4C) stören. Unsere angereicherten CD4 + CD25-T-Zellpopulation hilft, ein erfolgreicher Th17 Differenzierung zu gewährleisten.
Figur 5 zeigt eine schematische Darstellung unserer Th17 Differenzierung Verfahren. Unsere angereicherten CD25 + CD4-Population wird entweder unter Th17 Differenzierungsbedingungen inkubiert (anti-CD3-, anti-CD28, IL-6 und TGF-β) oder Kontrolle (Anti-CD3, Anti-CD28-). Es kann in 6 gesehen werden, daß, während die Inkubation von CD4 + CD25-T-Lymphozyten mit Anti-CD3-, anti-CD28 für 5 Tage ergab CD25 +-T-Lymphozyten, die Inkubation unter Th17 induzierenden Bedingungen ergab eine Untergruppe von IL17 produzierenden CD4 + CD25 +-Lymphozyten. Bitte beachten Sie Tabelle 1 für Beispiele von CD4 + CD25 + IL-17A + absolute Zellzahl ergibt nach 5 Tagen Inkubation unter iTh17 Bedingungen.
Th17 Differenzierungsstatus kann weiter durch quantitative PCR und ELISA beurteilt werden. Abbildung 7 zeigt Daten aus angereicherten CD4 + CD25-T-Lymphozyten unter Kontrolle oder Th17-induzierenden Bedingungen inkubiert. CD4 + CD25-T-Lymphozyten unter Bedingungen inkubiert Th17 bis zu regulieren IL17A, die durch qPCR (7A) und ELISA (7B) festgestellt werden kann. Die Th17-spezifische Transkriptionsfaktor RORγT wird auch von CD4 + CD25-T-Zellen unter Th17-induzierenden Bedingungen inkubiert hochreguliert und kann festgestellt werden through qPCR (7A).
Fig. 1 ist. Th17 Differenzierung schematisch. 1. Coat Vertiefungen der U-förmigen 96-Well-Platte mit anti-CD3 (10 ug / ml) in PBS verdünnt. 2. Platte Platz in Inkubator für 4 Stunden bei 37 ° C Während Platte wird inkubiert, sezieren Lymphknoten (LN) und Milz von Maus. Grind Organe und filtern, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Isolieren CD4 + CD25-T-Zellen mit Hilfe der CD4 + CD25 + regulatorische T-Zell-Isolation Kit und Pro Miltenyi autoMACS Separator. CD4 + CD25-Zellen ist auf 1 x 10 6 Zellen / ml verdünnt werden. 3. Nach 4 Stunden Inkubation der 96-Well-Platte abgeschlossen ist, waschen Vertiefungen mit PBS (200 ul / Loch) 3x. 4. 100 l CD4 + CD25-T-Zellen an die Platte gebundene (PB) anti-CD3 beschichteten Vertiefungen. 5. 100 l anti-CD28 oder 100 ul iTh17 coc6 ktail (antiCD28, TGF-β und IL-6).. Platte einer Inkubationszeit von 3 oder 5 Tagen bei 37 ° C. Nach der Inkubation beurteilen Differenzierung durch intrazelluläre Färbung, qPCR und / oder ELISA.
2. LN Dissection Guide. A) 1 brachialis Lymphknoten können im Bindegewebe in der Nähe jedes Achselhöhle (Achselhöhle) der Maus. B befindet) gefunden werden 1 axillären Lymphknoten können in jeder Achsel gefunden werden, hinter den Brustmuskeln. C) Mesenteriale Lymphknoten befinden sich in das Bindegewebe des Darms. Sie ähneln einem Perlenkette. D) 4 oberflächliche Lymphknoten werden in den Hals der Maus gefunden. E) 2 Leistenlymphknoten (1 auf jeder Seite) kann im Bereich der Hüfte an der Stelle, wo drei Blutgefäße treffen befinden .
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3. Spleen Dissektion Führer. Maus-Milz wird auf der linken Seite des Körpers hinter dem Magen und Darm gefunden. Entfernen Sie einfach durch Ziehen und Trennen mit der Zange.
4. Zellfraktionen aus gepoolten LN und Milz-Zellen vor und nach der Trennung autoMACS Pro. A) LN und Milzzellen wurden gefärbt, ex vivo, zum Ausgangszellpopulationen vor der Trennung herzustellen. Nach der Trennung, CD4 + CD25 + (B) und CD4 + CD25-(C)-Fraktionen wurden angefärbt, um die Reinheit von CD4 + CD25 + und CD4 + CD25-T-Lymphozyten-Populationen zu beurteilen sind. Alle Proben wurden mit CD4 + und CD25 +-Antikörper gefärbt und durch Durchflusszytometrie analysiert.
5. Th17 Differenzierung. Zellen inkubieren bis zu 5 Tage. Ernten Sie die Zellen für die intrazelluläre Färbung und qPCR; Ernteüberstände für ELISA.
6. Th17 Differenzierung mittels Durchflusszytometrie bewertet. CD4 + CD25-T-Lymphozyten in Gegenwart von plattengebundene Anti-CD3 inkubiert, anti-CD28, IL-6 und TGF-β (iTh17) oder plattengebundener anti-CD3 und anti-CD28 allein (Kontrolle) 5 Tage. Zellen wurden dann mit PMA und Ionomycin für 4 h bei 37 ° C aktiviert Nach der Aktivierung wurden die Zellen mit anti-CD4, anti-CD8, Anti-CD25 und Anti-IL-17A-Antikörper für die durchflusszytometrische Analyse gefärbt Th17 Differenzierung zu beurteilen. iTh17 = Th17 Induktion cie Bedingungen.
Abbildung 7. Th17 Differenzierung durch qPCR und ELISA. Lymphozyten aus C57BL / 6 Mäusen geprüft wurden sortiert und CD4 + CD25-T-Zellen wurden in Gegenwart von plattengebundene anti-CD3 (10 &mgr; g / ml), anti-CD28 (1,5 &mgr; g / ml inkubiert, ), IL-6 (20 ng / ml) und TGF-β (5 ng / ml) oder plattengebundener anti-CD3 und anti-CD28 allein (Kontrolle) für 5 Tage. A) Die Zellen wurden dann geerntet, um zu beurteilen RORγT und IL-17A Nachricht Expression über qPCR. B) Die Überstände wurden geerntet, um IL-17A-Protein-Expression mittels ELISA beurteilen.
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Discussion
Hier haben wir das Protokoll, das in vitro Th17 Differenzierung zu erreichen beschrieben. Die Studie von Th17 Differenzierung wichtig ist, die Differenzierung von T-Lymphozyten in das Th17 Menge ist für die wirksame Eliminierung von menschlichen Pathogenen 13. Umgekehrt hat IL17-Produktion mit Autoimmunkrankheitsverlauf 13 in Verbindung gebracht. Das Verfahren von Th17 Differenzierung ist für viele Forschungseinstellungen, wie es zahlreiche verschiedene murine Modelle der Immunregulation und Autoimmunität angewendet werden. Diese Methode hilft, um Fragen hinsichtlich der Fähigkeit von T-Lymphozyten, die in einer Th17 Zellen zu differenzieren, in diesem Protokoll durch die Produktion von IL-17A und die Expression des Transkriptionsfaktors RORγT bezeichnet, um eine Immunantwort zu modulieren beantworten. Darüber hinaus wurde von anderen gezeigt, dass Th17-Zellen kann auch durch die Herstellung von IL17F, IL22, GM-CSF und 8, 12 identifiziert werden. Dieses Protokoll ist von Bedeutung in Bezug auf anderebekannte T-Lymphozyten-Differenzierung Protokolle wie Th1-oder Th2-Differenzierung, da es verwendet werden kann, um die Protokolle, um besser zu verstehen, wie T-Lymphozyten-Effektor-Funktionen beziehen sich auf das Immunsystem Betrieb ergänzt werden.
Es gibt mehrere wichtige Schritte, die bei der Durchführung dieser Experimente. Th17 Differenzierung kann durch eine unreine CD4 + CD25-Population erreicht werden, aber für die effektive und zuverlässige Ergebnisse wird eine CD4 + CD25-Population von mindestens 80% Reinheit erwünscht. Unsere Methode nutzt das Protokoll von Miltenyi Biotec für ihre autoMACS Pro Handy Separator zur Verfügung gestellt. Die autoMACS CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen-Isolation Kit, Maus ist für die negative Selektion der CD4 + CD25-Zellpopulation verwendet. Negative Selektion erlaubt die Verwendung von naiven Zellen, die nicht durch potentiell Antikörper-Wechselwirkungen verändert haben.
Die Verwendung bestimmter Zelloberflächenmarker in durchflusszytometrischen Analyse kann die Reinheit der ap bestätigenEVÖLKERUNG. Die empfohlene Oberflächenmarker CD4, CD8 und CD25, da sie einfach zu identifizieren den gewünschten CD4 + CD25-Population. B220 und CD11b kann verwendet werden, um B-Zell-und Makrophagen-Kontamination zu testen sind. Proben durchweg bis 1 x 10 6 Zellen / ml verdünnt wird auch empfohlen, da wir, dass diese Konzentration ergibt optimale Differenzierung gefunden. In der Vergangenheit haben wir festgestellt, dass die Zellkonzentrationen, die zu hoch oder zu niedrig waren, hatten oft zelluläre Erweiterung und Verzerrung der Ergebnisse (wie verzerrt IL-17A-Produktion) gestört.
Es ist auch wichtig, daran zu erinnern, um die Proben auf Eis zu allen Zeiten zu halten, wenn nicht in Gebrauch ist. Die Lebensfähigkeit der Zellen ist ein wichtiger Faktor bei der Erreichung positive Th17 Differenzierung. Dies kann durch Zellzählung mit Trypanblau Verdünnungen bestätigt werden. Da dieses Protokoll beschäftigt manuelle Gewebehomogenisierung durch Schleifen der Lymphknoten und der Milz mit Milch Mikroskop-Objektträger, kann dies eine zeitaufwändige Methode. Ein Design modification ist die automatische Gewebe dissociators als Alternative zu nutzen.
Für den Fall, dass die gewünschte Th17 Differenzierung nicht erreicht wird, gibt es einige Tipps, die Fehlersuche berücksichtigt werden sollten. Zunächst müssen Kontrollen auch sorgfältig geprüft, so dass das wahre Ausmaß der Th17 Differenzierung richtig gemessen werden kann. Wir bestimmen typischerweise das Ausmaß der Th17 Differenzierung durch Vergleich dieser Ergebnisse mit den CD4 + T-Lymphozyten Empfangen nur anti-CD3 und anti-CD28-Stimulation. Denken Sie auch daran, dass CD4 + T-Lymphozyten müssen, um differenzieren aktiviert werden. Man sollte auch visuell inspizieren kultivierten Zellen unter dem Mikroskop auf die Anwesenheit von gestrahlt / aktivierte T-Zellen zu bestätigen. Aktivierte T-Zellen optisch deutlich größer erscheinen als die Zellen, die nicht stimuliert wurden. Klonale Expansion kann auch durch sichtbare Cluster von Strahlzellen, die aus einer T-Zell-Klon abgeleitet wurden, beobachtet werden. Zellaktivierung kann auch sein Verifikationed durch die Verwendung von Durchflußzytometrie-Analyse unter Verwendung von anti-CD4 und anti-CD25-Antikörper, um die CD4 + CD25 +-aktivierten Zellen 4 zu identifizieren
Es ist auch wichtig zu erwähnen, dass dieses Protokoll wurde zur Verwendung mit C57BL / 6 Mäusen optimiert, aber veröffentlichte Daten zeigen, dass Th17 Differenzierung kann in anderen Mausstämmen mit NOD-und BALB / c-Mäusen, 5, 11, 20 erreicht werden. Es sei darauf hingewiesen, dass Th17 Differenzierung, einschließlich Gesamtfrequenz und absolute Anzahl der CD4 +-T-Lymphozyten unterzogen Differenzierung, hängt genetische Faktoren (wie z. B. Mausstamm) 20 und Umweltfaktoren (z. B. Kolonie Lage) und 5 kann die Optimierung erfordert.
Diese Th17 Differenzierung Protokoll kann als ein unschätzbares Mittel, um weitere Fragen zu der Funktion der Zellen in der Teilmenge Th17 beantworten zu dienen. Unsere Methode der Th17 Differenzierung hat mehrere wesentliche Vorteile. Wie zuvor erwähnt die Verwendungvon mindestens 80% rein CD4 + CD25-Zellpopulation bietet eine kohärente und wirksame Differenzierung Ergebnis. Einfache Isolierung durch die Verwendung der autoMACS Pro Zellseparator ist ein zusätzlicher Vorteil. Weiterhin ist die Verwendung der optimalen Cytokin-Aktivierungssignale und liefert die T-Zellen mit der entsprechenden Umgebung in dem zu unterscheiden. Künftig für dieses Protokoll gehören die Bestimmung der mechanistischen Mittel, Th17-Zellen und die Produktion von IL-17A in der Entstehung und Progression von Autoimmunität beteiligt.
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Disclosures
Keine Angaben zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird zum Teil durch die NIH / NCATS Klinische und Translationale Wissenschaftspreise an die Universität von Florida und TL1 TR000066 UL1 TR000064, eine Vielfalt Ergänzung von Mutter R01AI056152 Zuschuss aus dem National Institute of Health, einem BD Biosciences Reagenz Zuschuss, und der Universität unterstützt von Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" x 1"1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt–thanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad | ||
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