Summary
Diğer T hücresi alt kümelerinin farklı efektör işlevleri ile, Th17 hücreleri merkezi inflamatuar otoimmün implike edilmiştir. Bu in vitro Th17 farklılaşma protokolü naif CD4 + T lenfositleri Th17 hücrelerine ayırt edebilir, ve daha fazla otoimmün ve konak cevabı rollerini incelemek belirlemek için bir araç sağlar.
Abstract
Th17 hücreleri 17 (IL-17), interlökin üretmek için tespit edilmiştir T hücrelerinin bir alt kümesi ayrı olan ve Th1, Th2 ve düzenleyici T hücreleri dahil olmak üzere, diğer T hücre alt ikinci fonksiyon farklıdır. Th17 hücreler çok oto-bağışıklık hastalıkları ile ilişkili çok istekli inflamatuar immün cevapların merkezi bir suçlu olarak ortaya çıkmıştır. Bu yöntemde biz C57BL / 6 farelerinin dalak ve lenf düğümleri T lenfositleri arındırmak ve kontrol ve Th17 uyaran ortamlarda saflaştırılmış CD4 + T hücrelerini teşvik eder. Th17 uyaran ortam anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları, IL-6 ve TGF-β varlığında uyarımı içerir. En az 72 saat süre ile inkübe edildikten sonra ve 37 ° C'de en fazla beş gün boyunca, hücreler daha sonra sitometrisi, QPCR, ELISA ve akış boyunca IL-17 üretmek için yeteneği açısından analiz edilir. Th17 farklılaşmış CD4 + CD25-T hücreleri daha Th17 hücreleri otoimmün ve ev sahibi de başlangıcı ve ilerlemesinde oynadığı rolü aydınlatmak için kullanılabilirfense. Ayrıca, farklı kemirgen nakavt / hastalık modellerinde CD4 + CD25-lenfosit Th17 farklılaşma hücre kaderi plastisite anlamamıza katkıda bulunabilir.
Introduction
CD4 + T lenfositler (T hücreleri), bulaşıcı mikroorganizmalara karşı bağışıklık sistemi aracılı savunma önemli bir rol oynamaktadır. Tersine, T-hücreleri, aynı zamanda iyice bu tip 1 diyabet, sistemik lupus eritematozus, romatoid artrit gibi otoimmün hastalıkların başlaması ve ilerlemesi ile ilişkilidir. CD4 + T lenfositleri, T hücresi reseptörü kognat antijeni / majör histokompatibilite kompleksi II (MHC II) molekülleri ile (TCR) etkileşimlerinin bir kombinasyonu ile aktif hale gelir ve B7.1/B7.2 ile CD28 reseptör etkileşimleri 15 ligandları. TCR ve CD28 uyarımı ko-stimülasyon sağlanmasına ek olarak, antijen sunan hücreler de bu şekilde belirli bir antijene T lenfosit yanıtı yönlendirme, T lenfosit farklılaşması durumunu belirleyen bir sitokin ortam sağlar. Farklı patojen / antijen sunan hücre etkileşimleri T eli odaklanmış farklı yollar aşağı lenfosit çarpık ayrı sitokin ortamları oluşturmak,başlatılması patojen ele almaktadır. Ne yazık ki, orijinal olarak, istila eden patojenlere ortadan kaldırmak için tasarlanmış T lenfosit efektör yolları, hatalı kendi dokularına 15 karşı yönlendirilebilir. Bu nedenle, her farklı CD4 + T hücre alt sitesini farklılaşması durumunun daha iyi anlaşılması patojenlerin ortadan kaldırılması ve kendini hoşgörü arasındaki dengeyi düzenleyen nasıl anlayışımız için çok önemlidir.
Th1, Th2 ve indüklenebilir düzenleyici T hücresi farklılaşma yollarının ek olarak, naiv T lemfositleri aynı zamanda Th17 yolunun aşağı sitokinler tarafından tahrik edilebilir. Th1 hücreleri, hücre içi patojenlere mücadele ise, Th2 hücreleri, hücre-dışı patojenlerin uzaklaştırılması ve düzenleyici T hücreleri (Tregs) enflamatuar tepkileri 1, 16, en aza indirmek, Th17 hücre dışı bakteri ve mantar yok edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Th17 hücreler genel olarak soy spesifik transkripsiyon faktörü ve IL RORγT üretim ifadesi ile gösterilirMakrofajlar ve nötrofiller 1, 7 aktivasyonunu teşvik-17A.
Th17 hücreler çeşitli otoimmün hastalıklarda rol oynadığı ve bunların ilişkili kemirgen modelleri edilmiştir. Örneğin, IL-23 (Th17 fenotipi sürdürmek için gerekli olan) olduğu gösterilmiştir, ancak IL-12, deneysel otoimmün ensefalitte (EAE) 'de, merkezi suçlu olduğu, MS için kemirgen hastalık modeli. Bu, daha sonra IL-17 üretiminde azalma EAE önleme 2, 6, 17 ilişkili olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, Th17 hücreleri arterit ve sistemik lupus eritematosus (SLE) 10, 16 dahil olmak üzere diğer oto-bağışıklık hastalıkları ile ilişkili olmuştur. IL-23 p19 eksikliği olan - / - fareler Th17 hücrelerinin çok az sayıda olduğu gösterilmiştir ve EAE sadece gelişen karşı dirençli olan, ama aynı zamanda kollajen ile indüklenen artrit, romatoid artrit 10, 18 için bir model. Buna ek olarak, fare kıç IL-17A, nötralize edici antikor ile işleme tabier kollajen kaynaklı arterit başlangıcı da eklem hasarı 18 çözünürlüğe sahip olduğu bulunmuştur. Bu son araştırmalar aynı zamanda, Tip 1 diyabet 9, 11 ve bağırsak iltihabı 14 Th17 hücre koruyucu bir rol gösterildiği gibi otoimmün hastalık ilerlemesinde Th17 hücrelerinin rolünün, özelliği gerekmektedir unutulmamalıdır. Bu çalışmalar otoimmünitede Th17 farklılaşma önemini doğrulamaktadır.
1) tam olarak nasıl IL-6 Treg ve Th17 farklılaşma arasındaki dengeyi düzenleyen etmez ve 2) kesin mekanizmaları nelerdir: daha fazla araştırılması gereken en az iki kafa karıştırıcı soru vardır çünkü in vitro Th17 farklılaşma T hücre araştırmalarındaki gerekli bir yöntemdir IL-17 kaynaklı enflamatuvar hastalıkların arkasında? Bizim yöntem olup, C57BL / 6 fare dalak ve lenf düğümleri CD4 + CD25-T hücreleri kullanır. Şunu belirtmek önemlidir ki bir saf olmayan kullanılarak Th17 farklılaşmasını teşvik etmek mümkün olmasına rağmenNüfus, en az bir% 80 saf CD4 + CD25-T hücresi popülasyonu elde herhangi bir kirlenme ortadan endişe ve daha başarılı Th17 farklılaşma sonuçlar sağlar. Uygun Th17 farklılaşma elde etmek için, CD4 + CD25-T-hücreleri, sırasıyla, anti-CD3 ve anti-CD28, aktivasyon sinyalleri sağlamak, 1 ve 2 varlığında inkübe edilir, ve IL-6 ve TGF-β. IL-23 tek başına Th17 farklılaşma elde etmek için kullanılabilir olduğunu rapor edilmiş olmasına rağmen, bu daha sonra IL-23 Th17 hücre popülasyonunun istikrarı için gerekli olduğu gösterilmiştir, ancak, IL-6 ve TGF-β Th17 farklılaşması için gerekli olan 3, 18, 19. Murin çalışmalar, IL-23 reseptör IL-6 ve TGF-β 13, 18 ile uyarılmış sonra CD4 + T hücreleri üzerinde ifade olduğunu göstermiştir. Ayrıca, Th17 hücreleri başarılı olduğu sürece, IL-6 ve TGF-β 18, 19 mevcut olduğu gibi IL-23 bloke edici antikorların varlığı gelişecektir. Bu nedenle, bu Th17 farklılaşma protokol atabaşarıyla Th17 farklılaşma ikna etmek için uygun koşullar Ides. Otoimmün hastalıklar 13 hedefleyen daha iyi terapötik maddelerin geliştirilmesi için fırsat sunmaktadır Th17 farklılaşması ve IL-17 üretimini altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması geliştirilmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan kullanımı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1.. Karışımları ve Medya hazırlanması
- Steril PBS pH 7.3 (1 L)
0.23 g NaH 2 PO 4
1.15 g Na 2 HPO 4
9.0 g NaCl
DI su ile sesini alın. Otoklav ile sterilize edin. - Hücre Kültürü Ortamı (100 mi)
89 ml RPMI
10 mi% 10 FBS
1 ml antibiyotik antimikotik (ABAM) 100 ug, 50 mM 2-merkaptoetanol (96.5 ug PBS'ye 3,5 ug stok 2-merkaptoetanol) - , Steril PBS içinde FACS tampon (Floresan sokma Hücre Ayırma) (akış sitometrisi sırasında kullanılmak üzere)% 2 FBS
- iTh17 Mix (numune sayısına dayanarak, tüm karışımları ve medya için gerekli hacmi belirlemek)
1.5 ug / ml anti-CD28
20 ng / ml IL-6
5 ng / mlTGF-β
2. Hücreler aşağıdaki koşullar altında, üç nüsha olarak Tabakta Olacak
- Anti-CD3 bağlı Plate, anti-CD28 (bu aktivasyon kontrol karışımıdır).
- iTH17: levha anti-CD3 bağlı, anti-CD28, IL-6, TGF-β.
3. Levha-bağlı anti-CD3 (10 ug / ml)
Bu plaka bağlı anti-CD3 plakaların hazırlanması önce hücreler plakalardan eklenecek zaman için en az 4 saat yapılması önerilir.
- Kuyulara 30 ul anti-CD3 ekleme yeni bir 96 oyuklu U tabanlı bir Microtest doku kültür plakasının (anti-CD3, steril PBS içerisinde seyreltilmektedir) ve kuyu yeknesak bir şekilde kaplanmasını sağlamak için levhanın kenarlarını dokunun. Bu plaka karışımları ve hücreleri ekleme zamanı gelinceye kadar buzdolabında daha sonra 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir ve.
4. Fare Diseksiyon
- Bu protokol, C57BL / 6 mikrofon kullanımına dayanıre, 3-8 aylık, ve The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) satın alınmıştır.
- CO 2 boğulma kullanarak fare Kurban ve sonraki servikal dislokasyon ile ölüm onaylayın.
- % 70 etanol ile fareler diseksiyon araçları ve kesi alan sterilize ve diseksiyon başlamak.
- Ventral görünümünde, üretral açılış anterior olan cildi kapmak ve çene alanı ulaşana kadar makas ile ventral orta hat kesmeye başlar. Önlemleri gözyaşı veya periton duvarı zarının içine kesmek için değil almak.
- Ciltte geri çekin ve çıkarılması sırasında lenf düğümlerine rahat erişim sağlamak için aşağı pin.
- Toplanan lenf düğümleri ve dalak tüm forseps ile çıkarılır, ve tampon (lenf bezi ve dalak kaldırma diyagramları için, Şekil 2 ve 3'e bakınız) Miltenyi Biotec satın Running autoMACS 5 ml ihtiva eden steril bir Petri tabağına yerleştirilir.
- Olan aksiller lenf düğümleri kaldırmakHer fare göğüs kaslarının arkasında aksilla (koltuk altı) yanında bulundu.
- Her aksillaya yakınında bulunan bağ dokularında bulunan brakiyal lenf düğümleri kaldırın.
- Her bir fare boyun bulunan yüzeysel servikal lenf düğümleri çıkarın.
- 3 kan damarlarının bağlantılı olarak kalça bölgesinde bulunan kasık lenf düğümleri çıkarın.
- Periton zarının yukarı ventral orta hat kesti mezenterik lenf düğümleri, erişmek için. Mezenterik lenf düğümleri bağırsakları arada tutan bağ dokusu bulunur. Genellikle 4-8 düğümleri bir dizesinde bulunan ve bir "inci string" olarak görünebilir. Tüm dize çekin emin olun.
- Dalak, mide ve bağırsakların arkasında, karın bölgesinde yer almaktadır. Pankreas çekerek ve ayırarak çıkarın.
- 2 buzlu mikroskop slaytlar kullanılarak steril bir başlık altında organlarını eziyet. Lenf düğümleri veya dalak üzerine yerleştirinparçalanmış kadar ikinci sürgünün buzlu tarafı ile bir mikroskop lamı, ve ovmak buzlu tarafı. Tüm lenf düğümleri ve dalak toprağa kadar tekrarlayın.
Not: Kan zor autoMACS tamponunda kalan lenf düğümleri görmek için yapacak gibi, lenf düğümleri ile başlar ve dalak ile bitirmek için tavsiye edilir.
- Tek bir hücre süspansiyonu halinde öğütülmüş organları filtre etmek için, 40 um naylon bir parça üzerinde bir kaç kez katlanır ve bir 15 ml santrifüj tüpünün üst yerleştirilmesiyle başlar. Naylon malzeme kabaca 3 x 3 inç olmalıdır
- Tampon ve toprak organları Koşu autoMACS içinde 5 ml aspire bir 5 ml şırınga ve 21 G iğne kullanın. Katlanmış naylon malzeme yavaşça koyun. Iğne ile malzemeyi delinmesiyle önlemek için özen gösterin.
Not: tek bir hücre süspansiyonu elde edildikten sonra, çözelti visib hiç sahip, açık ve tutarlı bir çözüm olarak görünmelidirkatı doku le adettir. Katı maddeler, yeniden aspire kalır ve yeni bir 15 ml santrifüj tüpüne yerleştirilmiş naylon yeni bir katlanmış parça aracılığıyla dağıtım edin.
- Kullanılmadığı zaman her zaman buz üzerinde hücre tutmak.
5. Hücre Ayırma
- En iyi sonuçlar için, MACS CD4 + CD25 + düzenleyici T hücre izolasyon kiti, fareyi kullanarak autoMACS Pro Hücre Ayırıcı ile en az% 80 oranında saf CD4 + CD25-hücre popülasyonu edinin. CD4 + CD25-hücre popülasyonu negatif tutulması için protokol Miltenyi Biotec ile elde edilir.
6. Th17 Farklılaşma
- AutoMACS Pro hücre ayırıcı ile ayrıldıktan sonra CD4 + CD25-hücre popülasyonu toplayın.
- Bir hemasitometre kullanarak, tripan mavisi ile 1:1000 oranında seyreltilmiş hücre sayımı.
- Yoğunluğu hücre sayısı tespit edildikten sonra, hücre kültür ortamı içinde 1 x 10 6 hücre / ml hücre süspansiyonu seyreltin.
- 4 saat sonra anti-CD3 bağlı plaka ile 96 oyuklu plakalar çıkar.
- PBS içinde 200 ul anti-CD3 kaplı kuyu yıkayın. 2 kez tekrarlayın.
- Yıkamak için anti-CD3 kaplı oyuklara steril PBS içinde 200 ul ekleyin ve bir atık kabı içine PBS çıkarın.
- Üç kopya halinde oyuklara iTh17 karışımı ya da aktivasyon kontrol karışımı, 100 ul (noktası # 2 ye bakınız) eklenir.
- Her bir Th17 karışımı veya aktivasyon kontrol karışımı da altına yerleştirilebilir edildiği hücre 100 ul ekle.
- En az 72 saat boyunca ya da 5 güne kadar inkübe hücreleri (Th17 farklılaşma 72 saat sonra ya da 5 gün sonra elde edilebilir.)
- Th17 farklılaşma, hücre içi boyama ve akış sitometrik analizi, ELISA veya qPCR ile değerlendirilebilir
7. Hücre Aktivasyon (Sadece gerekli Intraselüler Boyama için)
- 72 saat ve 5 gün ya da sonunda, kuluçka 96 kuyucuğu çıkarmak
- Hatırlayın Th17 differentiation, 72 saat ya da 5 gün sonra ya da elde edilebilir.
- Her bir durum (ör. aktivasyon kontrol veya iTh17) için, 24 gözlü hücre kültür plakasının bir yuvası içine üç kopya halinde olan hücrelere transfer. 96 oyuklu U tabanlı bir kültür plakasında, üç kopya halinde olmanın aksine bir durum için hücreler artık, 24 delikli kültür plakasının bir yuvası içine toplanmış edilmiştir.
- 24 yuvalı hücre kültürü plakasının her bir in toplam hacmi hemen 600 ul. Iyi hücre kültür ortamı ile 1 ml her bir hacmini kaldırın.
- (1 uM) ve iyonomisin, PMA (phorbol myristate asetat) (50 ng / ml) ekleyin ve BFA (Brefeldin-A) (10 ug / ml) belirtilmiş olan konsantrasyonlarda 24 yuvalı hücre kültürü plakasının her bölmeye.
- 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
8. Hücre içi boyama
- Akış sitometrik analiz için arzu edilen hücre dışı ve hücre içi işaretleri ile Leke hücreleri. O varlığı tespit etmek içinf IL-17, hücre içi boyama anti-IL-17A antikorları ile yapılır. Tavsiye edilen hücre dışı bir yüzey belirteçleri, CD4, CD8, CD25 ve içerir.
- IL-17 Hücre içi boyama BD Bioscience'den içi sitokin boyama Starter Kit-Mouse kullanın.
- Her numune için, hücreler topak, süpernatant kaldırmak ve 200 ul FACS tampon maddesi (PBS içinde% 2 FBS) tekrar süspansiyon hücre topağı.
- Plaka 96, hücre akış sitometresi için hücreler yeniden süspansiyon haline aktarın.
- 1.200 rpm'de 5 dakika boyunca hücreleri aşağı Spin ve süpernatant atın.
- 1200 rpm'de 5 dakika boyunca 200 ul PBS FACS tampon, santrifüj ekleyin ve supernatant atın.
- FACS 100 ul tampon içinde süspanse hücreler ve hücre dışı bir antikor, 100 ul (Ab) karışımı (hücre dışı Ab kanşımı FACS tampon maddesi içinde yapılır) uygulanır. Folyo ile kaplanmış, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
- 8.1.4 adımı tekrarlayın.
- Adımı tekrarlayın 8.1.5 2x.
- BD Cytofix / Cytoperm Tampon 100 ul hücreleri tekrar. Inkubasyonfolyo ile kaplanmış, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca yedi.
- 1x BD Perm / Wash tampon 100 ul, 1200 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüj ve supernatant atın. Tekrarlayın.
- Hücre içi Ab karışımı 50 ul ekle. Folyo ile kaplanmış, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin (hücre içi Ab karışımı 1x BD Perm / Wash içinde yapılır).
- 8.1.10 adımı tekrarlayın.
- BD Boyama Tampon 200 ul hücreleri tekrar.
- 200 ul BD Boyama Buffer (son hacmi 400 ul) içeren tüplere sitometri akışına süspanse hücreleri yerleştirin.
- 4 ° C'de saklayın örnekleri okunacak hazır olana kadar.
9. Akış Sitometrik Analizi
- Gate canlı hücre popülasyonu.
- Canlı hücre popülasyonu, CD4 + CD8-nüfus kapısı.
- CD4 + CD8-nüfus, IL-17A + nüfus kapısı.
- Daha önceki deney sonuçlarına göre, IL-17A + nüfusunun% 100 CD25 + olacaktır.
* Toplam mutlak hücre sayımları örnek triplicates havuzu sonra elde edildi
** CD4 + CD25 + IL-17A + hücrelerinin mutlak sayısı, canlı kapı yüzdesi ve soy spesifik işaretleyicileri, CD4, CD25 ve IL-17A taşıyan toplam hücrelerin yüzdesi ile hücrelerin toplam sayısı çarpılarak, olarak belirlendi akış sitometresi ile tespit edilmiştir.
10. QPCR ve ELISA
- Yer hücreler 5-10 dakika süreyle 13,000 rpm'de bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne ve santrifüj akış sitometrik analiz için kullanılmaz. Santrifüj sonrasında hücre peleti bulunan hücreler QPCR analiz için kullanılacaktır. QPCR analiz PTC-200 Peltier termal döngü cihazı (Biorad) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
- ELISA için santrifüj tüplerinden süpernatan toplamak. IL-17A ELISA antikor çifti TC11-18H10 (yakalama, katalog numarası 555068) kullanılarak gerçekleştirildi ve TC11-8h4 biotin (tespiti, katalog no 555067) BD Biosciences 'den satın alınmıştır. IL-17A ELISA standards eBioscience (katalog no: 14-8171-80) 'dan elde edilmiştir.
- Yüzer maddelerin alınmasından sonra, (daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C'de RNA ekstre etme, cDNA sentezi ve QPCR veya deposu için hemen kullanılmalıdır) 175 ul lisis tamponu içinde RNA QPCR için kullanılmak üzere geri kalan hücreler tekrar süspansiyon haline getirin.
- IL-17A ve aktin (house-keeping gen) için primer dizileri için Tablo II bakın
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu Th17 farklılaşma protokol dalak kaldırılması ve aksiller, brakiyal, mezenterik, servikal ve kasık lenf düğümleri ile başlar. Her yerlerinin bir gösterimi, Şekil 2 ve 3 de bulunabilir. Şekiller 1 ve 5 de bu protokolde tarif edilen yöntemlere görsel bir gösterimini sağlar.
Bu Th17 protokol CD4 + CD25-T lenfosit nüfus farklılaşma üzerinde duruluyor. Bu autoMACS Pro Hücre ayırma havuza alınan toplam lenf nodu ve dalak (Şekil 4) bizim istenen CD4 + CD25-nüfusa nasıl zenginleştirdiğini verimli dikkat etmek önemlidir. Bölünmemiş bir araya getirilmiş, lenf düğümü ve splenositler ve autoMACS ayrılmış parçacıklar akış sitometrik analizi (Şekil 4), ardından antiCD4 ve antiCD25 antikor ile boyandı. Şekil 4A, CD4 + CD25 + yüzdesi temsil eden bir profilini göstermektedirCD4 ve akış sitometrisi tarafından bölünmemiş bir araya getirilmiş, lenf düğümleri ve dalak içinde mevcut + CD25-lenfositler. Izolasyon prosedürü, aynı zamanda, ek deneyler için (Şekil 4B) kullanılabilir C57BL / 6 farelerinden alınan bir zenginleştirilmiş CD4 + CD25 + regülatör T popülasyonu sağlar. Şekil 4C% 84 CD4 + CD25-T hücreleri olduğu, bir nüfusu ile istenen hücre zenginleştirme gösterir, CD4 + CD25 + Tregs büyük çoğunluğu ile çıkarıldı. Sürekli olarak zenginleştirilmiş CD4 + içinde mevcut olan küçük olmayan bir lenfoid hücre nüfusu CD25-, ama bu farklılaşma (Şekil 4C) ile karışmaz. Bizim zenginleştirilmiş CD4 + CD25-T hücresi popülasyonu daha başarılı bir Th17 farklılaşmasını sağlamak için yardımcı olur.
Şekil 5, bizim Th17 farklılaşma prosedürünün bir şematik göstermektedir. Bizim zenginleştirilmiş CD4 + CD25-nüfus Th17 farklılaşan koşullar altında inkübe edilir ya da (anti-CD3, anti-CD28, IL-6 ve TGF-β) veya kontrol (anti-CD3, anti-CD28.) Bu ise CD25 + T lenfositleri elde 5 gün, Th17 indükleyici koşullar altında, inkübasyonu için anti-CD3, anti-CD28 ile CD4 + CD25-T lenfositlerinin inkübasyon IL17 CD4 + CD25 + lemfositlerinin üretilmesi için bir alt kümesini elde olduğu Şekil 6'da görülebilir. ITh17 koşullar altında 5 gün inkübe edildikten sonra hücre sayısı, mutlak verimleri + CD4 + CD25 + IL-17A örnekler için Tablo 1 'e bakınız.
Th17 farklılaşma durumu daha nicel PCR ve ELISA ile değerlendirilebilir. Kontrol veya Th17 indükleyici koşullar altında inkübe zenginleştirilmiş CD4 + CD25-T lenfositlerinden elde edilen veriyi göstermektedir Şekil 7. Th17 koşullar altında inkübe CD4 + CD25-T lenfositleri QPCR (Şekil 7A) ve ELISA (Şekil 7B) sayesinde tespit edilebilir IL17A, yukarı düzenler. Th17-özel transkripsiyon faktörü RORγT da Th17-inducing koşullar altında inkübe CD4 + CD25-T hücreleri tarafından yukarı regüle edilir ve thr tespit edilebilirough qPCR (Şekil 7A).
Şekil 1. Th17 Farklılaşma şematik. 37 ° C'de 4 saat boyunca kuluçka makinesi içinde, anti-CD3 PBS içerisinde seyreltilmiş (10 ug / ml) ile birlikte U-tabanlı 96 çukurlu bir levhanın 1. Coat kuyular. 2.. Yer plakası Plaka kuluçka iken, fare lenf düğümleri (LN) ve dalak teşrih. Organları eziyet ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için filtre. CD4 + CD25 + regülatör T hücre yalıtma kiti ve Miltenyi autoMACS Pro ayırıcı kullanılarak CD4 + CD25-T hücreleri izole edin. CD4 + CD25-hücreler, 1 x 10 6 hücre / ml olacak şekilde seyreltilir. 3.. Sonra 96 oyuklu plakanın 4 saatlik kuluçkalama tamamlandıktan sonra, PBS (200 ul / kuyucuk) 3x. 4 ile kuyu yıkayın. CD4 + 100 ul ekle CD25-T hücreleri, (PB), anti-CD3 kaplı oyuklara. plaka 5-bağlanmış. 100 ul anti-CD28 ya da 100 ul ekle iTh17 cocktail (antiCD28, TGF-β, ve IL-6). 6. 37 ° C de 3 ya da 5 gün boyunca inkübe Aşağıdaki kuluçka hücre içi boyama, qPCR ve / veya ELISA ile farklılaşmayı değerlendirmek.
Şekil 2. LN Diseksiyon Kılavuzu. A) 1 brakiyal lenf nodu 1 aksiller lenf nodu. C) Mezenterik lenf nodları bulunan göğüs kasları arkasında, her koltuk altında bulunabilir fare. B'nin her aksilladan (koltuk altı) yakınında bulunan bağ dokusu) bulunabilir bağırsakların bağ dokusu. Bu inci bir dizi benzer. D) 4 yüzeysel servikal lenf düğümleri fare boyun bulunurlar. E) 2 kasık lenf düğümleri (her iki tarafta 1) 3 kan damarlarının uygun konumda kalça bölgesinde bulunan olabilir .
. Içindeki sayfa = "Her zaman"> 
Şekil 3,. Diseksiyon kılavuzu dalak. Fare dalak, mide ve bağırsak arkasında vücudun sol tarafında yer almaktadır. Basitçe çekerek ve forseps ile ayırarak çıkarın.
Şekil 4. Toplanmış LN ikinci hücre fraksiyonları ve dalak hücreleri önce ve autoMACS Pro ayrılması. A) LN ve dalak hücreleri önce ve sonra ayırma için temel hücre popülasyonlarının kurmak için, ex vivo, boyandı. Sonra ayrılması, CD4 + CD25 + (B) ve CD4 + CD25-(C) fraksiyonları, sırasıyla, CD4 + CD25 + ve CD4 + CD25-T lemfosit popülasyonları saflığını değerlendirmek için boyandı. Tüm numuneler, CD4 + ve CD25 + antikorları ile boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir.
Şekil 5,. Th17 Farklılaşma. Kadar 5 gün boyunca inkübe hücreleri. Hücre içi boyama ve QPCR için hasat hücreleri ELISA için hasat yüzer.
Şekil 6,. Th17 farklılaşma akış sitometri ile değerlendirildi. CD4 + CD25-T lenfositleri plaka bağlı anti-CD3 varlığında inkübe edildi, anti-CD28, IL-6 ve TGF-β (iTh17) veya anti-CD3 ve plaka-bağlı anti-CD28 tek basma (kontrol) için 5 gün. Hücreler daha sonra 37 ° C'de 4 saat boyunca PMA ve İyonomisin ile aktive edilmiştir Aktivasyonunu takiben hücreler, Th17 farklılaşma değerlendirmek için, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25, ve akış sitometrik analiz için anti-IL-17A antikorları ile boyanmıştır. iTh17 = Th17 uyaran cşartlarından.
Şekil 7. C57BL / 6 farelerinden alınan QPCR ve ELISA. Lenfositler ile değerlendirildi Th17 farklılaşma kriteri ve CD4 + CD25-T hücreleri, plakaya bağlı anti-CD3 (10 ug / ml), anti-CD28 (1.5 ug / ml varlığında kuluçkalanmıştır ), IL-6 (20 ng / ml) ve TGF-β (5 ng / ml) ya da anti-CD3 plaka bağlı ve anti-CD28 tek basma (kontrol) 5 gün boyunca. A) Daha sonra hücreler RORγT değerlendirmek için toplandı ve qPCR. B ile IL-17A mesaj ifadesi) yüzer maddeleri ELİSA ile IL-17A protein ifadesini değerlendirmek için hasat edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada in vitro Th17 farklılaşma ulaşmak için protokol tanımlanmıştır. T farklılaşma insan patojenleri 13 etkin bir şekilde ortadan kaldırılması için kritik olan Th17 alt kümesi içine lenfositler gibi Th17 farklılaşma çalışma önemlidir. Tersine, IL17 üretim otoimmün hastalık ilerlemesi 13 ile ilişkilendirilmiştir. Bu, bağışıklık düzenleme ve otoimmünitenin çok sayıda farklı kemirgen modelleri için uygulanabilir olarak Th17 farklılaşma gibi bir yöntem birçok araştırma ayarları için geçerlidir. Bu yöntem, immün yanıtları modüle etmek için, IL-17A üretim ve transkripsiyon faktörünün RORγT sentezlenmesiyle, bu protokolde belirtilen bir Th17 hücreye ayırt etmek için T lenfositlerin yeteneği, ilişkin sorulara cevap için yardımcı olur. Ayrıca, Th17 hücreleri de IL17F, Il22, ve GM-CSF 8, 12 üretimi ile tespit edilebilir ki diğerleri tarafından gösterilmiştir. Bu protokol ile ilgili olarak, diğer önemliDaha iyi bir T lenfosit efektör fonksiyonları bağışıklık sisteminin çalışması için ilgili anlamak amacıyla bu protokolleri tamamlamak için kullanılabilir, çünkü bu, Th1 ya da Th2 farklılaşma olarak bilinen T lenfosit farklılaşması protokolleri,.
Bu deneyler yaparken dikkat edilmesi gereken birkaç önemli adım vardır. Th17 farklılaşma saf olmayan bir CD4 + CD25-nüfusu ile elde edilebilir, ancak en etkili ve güvenilir sonuçlar için, en az% 80 saflıkta bir CD4 + CD25-nüfus arzu edilir. Bizim yöntem kendi autoMACS Pro Hücre Ayırıcı için Miltenil Biotec'ten tarafından sağlanan protokol kullanır. AutoMACS CD4 + CD25 + regülatör T hücre Isolation Kit, fare CD4 + CD25-hücre nüfusunun negatif seçim için kullanılır. Negatif seçim potansiyel antikor etkileşimlerle değiştirilmediğini saf hücrelerin kullanımına izin verir.
Akım sitometri analizi belirli hücre yüzey belirteçleri kullanarak ap saflığını teyit edebiliropulation. Bu hali hazırda arzu edilen CD4 + CD25-popülasyonu tespit gibi önerilen yüzey belirteçleri CD4, CD8, CD25 ve vardır. B220 ve CD11, sırasıyla, B hücresi ve makrofaj kirlenme test etmek için de kullanılabilir. Biz, bu konsantrasyon verimleri optimum farklılaşmasını bulduk numuneler sürekli olarak 1 x 10 6 hücre / ml 'ye seyreltilmiş da tavsiye edilir. Geçmişte sık sık çok yüksek veya çok düşük olduğu hücre konsantrasyonları hücresel genişleme ve (örneğin çarpık IL-17A üretimi gibi) önyargılı sonuçlar tedirgin olduğunu bulduk.
Bu kullanımda değilken her zaman buz üzerinde örnekleri tutmak için hatırlamak da önemlidir. Hücre canlılığı olumlu Th17 farklılaşma ulaşmada önemli bir faktördür. Bu mavisi ile seyrettiklerini kullanarak hücre sayımı ile teyit edilebilir. Bu protokol buzlu mikroskop slaytlar ile lenf düğümleri ve dalak taşlama tarafından elle doku homojenizasyon istihdam çünkü, bu zaman alıcı bir yöntem olabilir. Bir tasarım moasidifikasyonunu alternatif bir seçenek olarak otomatik doku dissociators kullanmaktır.
İstenilen Th17 farklılaşma elde olmadığı durumunda, düşünülmelidir çeşitli sorun çekim ipuçları vardır. Th17 farklılaşma gerçek boyutu uygun bir şekilde ölçülebilir, böylece İlk olarak, kontrol da dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Bu tipik olarak sadece anti-CD3 ve anti-CD28 uyarımı alan CD4 + T lenfositleri için şu sonuçları karşılaştırarak Th17 farklılaşma ölçüde belirler. Ayrıca CD4 + T lenfositleri sipariş farkı ayırt aktive olması gerektiğini unutmayın. Bir de görsel püskürdü / aktive T hücrelerinin varlığını doğrulamak için mikroskop altında kültür hücreleri incelemek gerekir. Aktif T hücrelerinin, görsel uyarılmış edilmemiş hücrelere göre önemli ölçüde daha büyük bir görünür. Klonal genişleme aynı zamanda, tek bir T hücresi klonundan elde edilmiş hücrelerin patlatma görünebilen kümeleri kullanılarak gözlemlenebilir. Hücre aktivasyonu verifi olabilir,CD4 + CD25 + hücreleri aktive 4 belirlemek için, anti-CD4 ve anti-CD25 antikorları kullanılarak akış sitometrik analizi kullanımı ile ed
Ancak Th17 farklılaşma NOD ve BALB / c fareleri 5, 11, 20 dahil olmak üzere diğer fare suşlarının elde edilebilir olduğunu göstermektedir yayınlanan veriler, bu protokol, C57BL / 6 fareler ile kullanım için optimize edilmiş olduğunu belirtmek önemlidir. Bu genel sıklığı ve farklılaşma geçirmekte CD4 + T lenfositlerinin mutlak sayısı dahil olmak üzere Th17 farklılaşma, 20 (örneğin, fare suşu gibi) genetik faktörler ve (örneğin, koloni konumu gibi) çevresel faktörlerin 5 bağlıdır ve optimizasyon gerektirebilir unutulmamalıdır.
Bu Th17 farklılaşma protokolü daha Th17 altkümedeki hücrelerinin işlevi ile ilgili soruları cevaplamak için paha biçilmez bir araç olarak hizmet edebilir. Th17 farklılaşma Bizim yöntem birkaç önemli avantajlara sahiptir. Daha önce sözü edilen kullanımıen az% 80 saf CD4 + CD25-hücre popülasyonu daha tutarlı ve etkili bir farklılaşma sonuç sağlar. AutoMACS Pro hücre ayırıcının kullanımı yoluyla izolasyonu kolaylığı ek bir avantajdır. Ayrıca en iyi sitokin ve aktivasyon sinyallerinin kullanımı ayırt etmek için uygun ortam ile T hücrelerini içerir. Bu protokol için gelecekteki etkileri Th17 hücreleri ve IL-17'nın üretim otoimmünite başlangıcı ve ilerlemesinde katılan hangi mekanik belirleme aracı bulunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ilan etmek hiçbir açıklama.
Acknowledgments
Bu çalışma Florida TL1 TR000066 ve UL1 TR000064, Ulusal Sağlık Enstitüsü, BD Biosciences reaktif hibe Veli Grant R01AI056152 bir çeşitlilik takviyesi Üniversitesi NIH / NCATS Klinik ve Translasyonel Bilim Ödülleri ve Üniversite tarafından kısmen desteklenen Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" x 1"1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-Mercapt–thanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad | ||
References
- Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
- Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421, 742-748 (2003).
- El-Behi, M., Rostami, A., et al. Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
- Inaba, K., Kroide, S., et al. Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction. Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).
- L, I. vanovF. rutosR., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).
- Jager, L. D., Dabelic, R., et al. The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).
- Kimura, A., Kishimoto, T.
- Korn, T., Bettelli, E., et al.
- Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice. PNAS. 108, 11548-11553 (2011).
- Langrish, C. L., Chen, Y., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).
- Lau, K., Benitez, P., et al. Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias. J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).
- Lee, Y., Awasthi, A., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).
- Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell. 140, 845-858 (2010).
- O'Connor, W. Jr, Kamanaka, M., et al. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).
- Picca, C. C., Larkin, J., et al. Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection. Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).
- Shah, K., Lee, W. W., et al. Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research & Therapy. 12, R53 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R.
- Stockringer, B., Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).
- Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, 179-189 (2006).
- Zou, Y., Zhang, H., et al. Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis. Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).
