Summary
我们提出了一种小分子的快速，可逆的固定化和功能化的纳米粒子组合件表面等离子体共振（SPR）的研究中，使用连续的片上生物正交环化学和抗体 - 抗原捕获。
Abstract
方法有超过取向和固定化密度控制生物活性小分子的快速表面固定有用于生物传感器和微阵列应用非常理想。在这项研究中，我们使用了高效共价生物正交反式 -环辛烯（TCO）的[4 +2]环加成反应和1,2,4,5 -四嗪（TZ），使TCO / TZ衍生分子的固定化微流控。我们监测使用表面等离子体共振（SPR）在连续流动条件下的过程中的实时性。以使可逆固定化，并延长了实验范围传感器表面的，我们结合一个非共价的抗原 - 抗体捕获组分与环加成反应。通过交替呈现的TCO或TZ部分到传感器表面，多个捕获环的过程，现在可能在一个传感器表面的各种多组分结构的芯片组装和相互作用的研究。我们我一种小分子，AP1497结合FK506结合蛋白12（FKBP12），与上一个生物传感器芯片2的不同的固定化实验llustrate这种方法和相同的小分子作为固定化和原位功能化的纳米颗粒的一部分。
Introduction
高效的偶联反应是用于将生物活性分子到表面上用于各种生物技术应用有价值的工具。最近，非常快的生物正交反式 -环辛烯（TCO）之间[4 +2]环加成反应和1,2,4,5 -四嗪（TZ）已被用于标记细胞的表面，亚细胞结构，抗体和纳米粒子1 - 7在这里，我们结合使用的[4 +2]环加成反应与抗原/抗体捕获（GST /抗-GST）为可逆的片上合成的表面等离子体共振（SPR）的相互作用分析多组分结构及监察过程中的实时（ 图1）。8,9值得注意的是，使用一个既定的协议捕获环加成策略使表面再生。8作为稳定的传感器表面有超过配体的方向和密度控制各种新的实验的结果，组装格式现在是可能的。运用这一战略，我们展示的TCO / TZ-衍生的小分子的固定化和在各种缓冲液条件表征环加成率。我们选择了FKBP12和分子AP1497之间的公知的相互作用是FKBP12 10-12结合，例如，以验证该捕集环加成策略保留了小分子与其靶相互作用的能力时，无论是直接连接到固定的GST抗原或与固定化的纳米颗粒（纳米）。
该方法提供了几个优点。首先，小分子上的传感器芯片中的可逆固定化成为可能。第二，小分子的TCO / TZ的固定化也使无标记相互作用的研究，反向规范化SPR研究的取向，并且可以提供一种结合相互作用的互补视图。第三，这种方法可以使微流体合成靶向纳米粒子，以及它们的结合蛋白的直接评定克属性。这有望改善的评价或筛选靶向纳米粒子的效率，也减少了所需的纳米颗粒的量。13-15第四，这种方法可以在连续流动测量实时的生物正交环加成反应的反应动力学。最后，在TCO / TZ固定化化学是健壮的血清中的存在。综上所述，我们预计，这种多功能的方法将广泛地施工方便稳定的传感器表面的各种与微流控相关研究，以在体外和体内细胞的应用。
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Protocol
1。 GST和纳米粒子（NP）结合物的制备
- GST-TCO准备：
- 添加8微升的TCO-NHS溶液（50毫米DMSO）100μL商品及服务税（1毫克/毫升的PBS）和摇动混合物在室温下1小时。
- 使用Zeba旋转脱盐柱除去过量的试剂。存储包含GST-TCO共轭回收的滤液在4℃后才能使用。
- GST-TZ准备：
- 加入6微升TZ-NHS溶液（25mM的在DMF中），以75微升的GST（1毫克/毫升在PBS中），并摇动混合物在室温下1小时。
- 用25微升PBS稀释反应混合物和纯化使用旋脱盐柱。存储包含GST-TZ共轭滤液在4℃后才能使用。
- NP-TCO准备：
- 加入100μl的TCO-NHS溶液（50毫米DMSO）为加入150μl胺化的纳米颗粒（NP-NH 2，8.7毫克铁/毫升的PBS中，3nm的铁心〜8000的Fe / NP），并摇动混合物在室温下1小时。
- 通过使用NAP-10柱纯化，用PBS缓冲液凝胶过滤除去过量的试剂。收集含NP-TCO产品的色带。
- 浓缩滤液，用离心过滤装置（100 K MWCO）〜150微升的最终体积。
- 加50μl的琥珀酸酐，（在DMSO 0.1M）的NP-TCO溶液并摇动在RT 1小时（酐反应与任何剩余的胺，以形成终端的羧酸。这防止非特异性相互作用的葡聚糖表面）。
- 使用NAP-10柱，用PBS洗脱纯化的NP-TCO产品。存储NP-TCO在4℃至使用前的解决方案。
2。表面处理
所有的表面等离子共振测定法是在在Biacore T100仪器（GE Healthcare）上进行25℃下使用CM5传感器芯片和PBS-P作为运行缓冲液，除非另有说明。的Biacore控制和评价软件随仪器提供被用于建立实验和分析数据。两种操作模式，应用程序向导和手动运行将用于表面处理和监控芯片上捕获环。该方法构建器模式将被用于建立反向方向，结合实验和测量环加成反应速率。数据是双减去参考和动力学分析是使用1:1 Langmuir结合模式进行。
- 使用固定化胺模板向导，然后选择固定的流动细胞1（参考）和2（检测）。修改胺的方法通过注射的0.4M的EDC的1:1溶液，激活表面的羧基基团：0.1M NHS为480秒，以10微升/分钟的流速。将注射乙醇胺解渴剩余活性酯，以420秒的接触时间的10微升/分钟的流速。
- 输入名称配体，抗-GST（在醋酸盐缓冲液，pH 5.0 18微克/毫升），并设置为以10微升/分钟的流速注入为420秒的接触时间。
- 将所需的解决方案在小瓶试剂架2，确保以配合内容列表中的位置。保存并开始固定。
注：以这种方式导致的〜14,000至17,000 RU的范围内抗GST固定化水平运行的固定化向导。 - 编辑固定化向导420秒，5微升/分钟以上参考流通池1只注入GST配体（20微克/毫升）的解决方案。
3。监控片上捕获环官能分子
- 监控芯片上捕获环加成实时（ 图2）。
- 放置GST-TCO（20微克/毫升），TZ-BnNH 2（10μM）和再生（10 1mM甘氨酸，pH值= 2.0）在试剂架2溶液的小瓶中。选择男人UAL run方法，设置流量5微升/分钟和流动路径流动池2。
- 注入GST-TCO的解决方案，为420秒。
- 注入TZ-BnNH 2溶液600秒。
- 再生的表面有两个30秒的注射再生解决方案。
- 监测多组分结构的实时（ 图3）的片上组件：
- 放置GST-TZ（20微克/毫升），NP-TCO（100微克的Fe /毫升），TZ-BnNH 2（10μM）和再生（10 1mM甘氨酸，pH值= 2.0）在试剂架2溶液的小瓶中。选择仪器手动运行方法，设置流量5微升/分钟和流路径流动池2。
- 注入GST-TZ的60秒的解决方案。
- 注入的NP-TCO的60秒的解决方案。
- 注入TZ-BnNH 2溶液60秒。
- 再生的表面有两个30秒的注射再生解决方案。
4。 Monitoring环加成率的固定化密度和测定
- 小分子环加成反应速率（ 图4）表征。
- 选择新的方法和一般的输入参数。在试验的步骤面板创建一个新的台阶，并命名为样本。设置目的和连接基设置到样品。
- 在周期类型面板创建一个新的循环步骤，并插入下面的命令，采集，样品，再生1和再生2。
- 选择捕捉命令，输入名称的配体（GST-TCO，20微克/毫升），接触时间120秒，5微升/分钟，并设置流动路径为：二。选择采样命令;输入180秒的接触时间，60秒的解离时间，加入30μl/分钟的流速，并设置流路来：两个。选择再生1命令，输入再生解决方案的名称（10 mM的甘氨酸 - 盐酸pH值2.0），30秒，30微升/分钟，并设置流动路径，接触时间：二。对于再生2命令重复相同的。</ LI>
- 选择安装运行，并设置流动路径为：2-1。选择下一个，并填写抽样单与分析解决方案（TZ-BnNH 2）和浓度系列（0.3-10微米，1:2稀释）。选择下一个机架位置面板。在试剂架2和系列稀释液在96孔板处溶液的小瓶，确保以匹配的内容列表的位置。保存方法模板，并开始结合分析。结合数据和动力学分析示于图4。
- 的NP环加成反应速率（ 图4）表征。
- 从上面打开保存的方法模板并更改以下参数。选择捕捉面板，改变配体名称与GST-TZ，20微克/毫升。选择样本面板;改变接触的时间为120秒的接触时间和离解时间为120秒。
- 选择示例清单;改变分析物的NP-TCO和浓度系列（7〜224纳米，1:2稀释）。在试剂架到位的解决方案小瓶2和稀释系列在96孔板中，确保以匹配的内容列表的位置。保存方法模板，并开始结合分析。结合数据和动力学分析示于图4。
5。测量FKBP12的结合固定AP1497
逆方向的结合研究使用FKBP12作为分析物和化合物AP1497作为固定的配体（ 图5）。这个实验的一般方法是设置使用的方法构建工具如下：
- 选择新的方法和一般的输入参数。在试验的步骤面板创建和命名捕获，采样和再生步骤。选择相应的目的和连接的基础设置。
- 选择周期类型面板并创建3个循环步骤：采集，采样和再生。
- 将捕捉命令两次下捕捉循环步骤。选择捕捉1面板并选择采集解决方案为variablE，设置接触时间为300秒，5微升/分钟，并设置流路的流量：二。选择捕捉2面板并选择捕获溶液作为变量，设置接触时间，以250秒为5微升/分钟，并设置流路的流速：第二。
- 将样品指挥下采样周期的一步。选择的样品板;组接触时间为60秒，解离时间为200秒以30微升/分钟的流速，并设置流路：两者。
- 将再生命令两次下的再生循环步骤。选择再生1面板;输入再生解决方案的名称（10 mM的甘氨酸 - 盐酸pH值2.0），30秒，30微升/分钟，并设置流动路径，接触时间：二。对于再生2面板重复相同的。
- 选择安装运行，并设置流动路径为：2-1。选择一个和输入捕捉解决方案的名称（GST-TCO和AP1497-TZ），样品名称（FKBP12），浓度系列（0.020〜5微克/毫升，1:2稀释）和MW（13,000）。在r发布的解决方案小瓶在96孔板eagent机架2和稀释系列并确保匹配的内容列表的位置。保存方法模板，并开始结合分析。动力学分析数据示于图5。
6。测量FKBP12的结合，以AP1497附在纳米粒子固定化
对于纳米粒子固定化，小分子衍生化FKBP12结合分析的一般方法是设置使用该方法构建工具如下：
- 从上面打开保存的方法模板和修改。插入一个额外的捕获指挥下捕获周期的一步。选择捕捉1面板;取消选择捕获解决方案，因为变数和姓名采集解决方案1（GST-TZ）。一套接触时间为60秒，5微升/分钟的流速，并设置流路到二。选择捕捉2面板;取消选择捕获解决方案，因为变数和姓名采集解决方案2（NP-TCO）。一套接触时间90秒，5微升/分钟的流速和设置流路第二。选择捕捉3面板;取消选择捕获解决方案，因为变数和姓名采集解决方案3（AP1497-TZ）。一套接触时间180秒以5微升/分钟的流速，并设置流路到二。
- 选择安装运行，并设置流动路径为：2-1。选择下一个两次。在试剂架2和系列稀释液在96孔板处溶液的小瓶，确保以匹配的内容列表的位置。保存方法模板，并开始结合分析。动力学分析数据示于图5。
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Representative Results
数据和数字已经改编自参考8。
生物活性小分子与在方向和密度控制高效的可逆固定在新的生物传感器应用的发展起着关键的作用。使用TCO与Tz之间的快速生物正交反应中，我们描述了一种用于逐步组装和配位体的表面与保持生物活性的再生。 图2显示的TZ-BnNH 2固定化的实时监测。 GST-TCO的溶液注射到产生〜400 RU上升响应预先固定化的抗-GST表面。第二次注射TZ-BnNH 2显示了一个快〜15 RU上升的响应。衍生的抗原无解离切换到运行缓冲液提供的证据，结构稳定后观察。表面被再生循环中的最后一个步骤，以使多个捕集环周期。我们ing这个程序，并与AP1497-TZ分子取代TZ-BnNH 2部分生成用于与它的靶FKBP12（ 图5）相互作用的研究生物活性表面。抗体/抗原相互作用的破坏（如在图2中所示）重新产生抗-GST表面，从而允许建立一个新的分子集合体。在这种情况下，GST-TZ注射（捕获的〜800 RU）的后面是用注射NP-TCO（环〜600 RU），有效固定化的纳米颗粒在传感器表面（ 图3）。可用于环加成反应与注射TZ-BnNH 2（〜22 RU）未反应的TCO组的NP。或者，AP1497-TZ是用来监视官能化纳米粒子的FKBP12相互作用（ 图5）。多组分结构的无解离（GST-Tz/NP-TCO/Tz-BnNH 2）观察提供的证据，结构稳定性和生物活性（AP1497-Tz/FKBP12 binding）。
随着对实时固定（环）反应监测和表面的再生能力，结合速率的直观表征K A（环加成率）来完成， 如图4。知识反应动力学提供了用于控制固定密度（接触时间和浓度），用于生物传感器检测的一个重要参数指引。注射过的GST-TCO或GST-TZ表面增加一式两份TZ-BnNH 2或NP-TCO的浓度，分别生成数据绑定（红色线）。为达到同样的浓度在同一表面的两个连续的分析物样品的结合数据几乎重叠的反射抗体的损失最小结合能力由于捕集环加成和再生的多个周期。评价软件提供的最佳拟合动力学分析（黑线）为cycloaddition反应报价K 如图4所示的一个 。
图1。生物正交结合的策略衍生的分子。A. 反式 -环辛烯（TCO）之间[4 +2]环加成反应和1,2,4,5 -四嗪（TZ）基团，得到1,4 -二氢哒嗪加成物的可逆固定对于TZ / TCO的可逆固定4.2实验方案标记的分子。为可逆纳米颗粒固定化和功能化C.实验方案。 点击这里查看大图 。
图2。 。小分子固定化实时监控1）基线：注射GST-TCO预固定的抗-GST 2）捕捉被抗GST抗体（T = 0-420秒），其次是注射缓冲液（吨〜15 RU上升的响应;; T = 540-1,140秒）。捕获GST-TCO和四嗪（TZ-BnNH 2间= 420-540秒），显示互动的持续性3）环加成。没有信号衰减时，尽管开关流动相缓冲液（吨= 1,140-1,820秒）4）的抗-GST表面与10mM的甘氨酸，pH值2.1（T = 1,820-2,000秒）2 短注射再生。
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图3。纳米粒子固定化和功能化的实时监控。1）基线。2）捕捉注入GST-TZ（T = 0-60秒）。3）捕获的GST-TZ和注射NP-TCO（T = 135-195之间的环加成秒），接着注入运行缓冲液没有衰减的信号（T = 195-300秒）。4）环加成之间固定化的NP-TCO和注射TZ-BnNH 2（〜22 RU上升响应，T = 300-360秒）。没有信号的衰减，尽管切换流动相缓冲液性（t = 360-480秒）提供证据对于多组分的稳定性。
图4。播放有关b代表传感inding数据（红色线）和动力学分析（黑线），用于TZ和TCO之间的环加成反应在100％FBS的存在或不存在标记的分子。表总结了关联（环）的速率常数，K A。
图5。 。AP1497和AP1497-TZ： 小分子/蛋白相互作用在不同的配置 （顶）FK506的合成衍生物SPR研究 。下表显示了动能和从绑定数据得出的平衡速率常数。从结合实验，其中蛋白质被固定化（ 即传统的SPR实验）的数据作为对比。
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Discussion
这里所描述的捕获环加成方法使改性纳米粒子和小分子无标记芯片为基础的互动和动力学研究的快速，可逆固定。固定化的协议可在要求<10μM浓度的小分子配体分钟来进行。通过调节配体浓度和接触时间的固定化密度可以严格控制。我们的数据显示，芯片上的生物正交反应保持原位功能化的纳米颗粒或固定化小分子与他们的目标交互的能力。我们还常表现为两种小分子，（总拥有成本和TZ）与低分子量之间的双分子环加成率。我们设想，类似的分析可以进行测量和比较的其他快速生物正交反应速率。
可逆，连续流片纳米粒子固定化和原位功能化公关ovides快速访问多种用于筛选和相互作用分析都在相同的实验。13-15相比传统的纳米粒子的合成，这需要进行纯化，固定化和筛选的不同步骤改性的纳米粒子的，我们的方法极大地降低了生物材料的输入量，溶剂和试剂，同时减少处理的纳米颗粒使用和处置的环境问题。16重要的是，纳米粒子的官能化反应是健壮到通常用于细胞培养试验的血清浓度的存在下，甚至在极高的血清浓度。这个功能可以方便对纳米颗粒的设计在血清的存在下（其可影响所述纳米颗粒的蛋白质电晕和表面特性）的结构-活性关系。17,18
在大多数的SPR测定，其中蛋白质 - 小分子相互作用的研究中，蛋白质（配体）是通过亲和标签（GST，生物素等 ），或者通过共价酰胺键固定。分析物，然后越过配体，其中在表面质量变化，这被检测为折射率变化的结合的结果。倒车规范SPR取向和固定化的小分子在一个方便的和可逆的方式提供了便捷的访问研究直接结合的水溶性大分子目标，并阐明特定阶段（固定与可溶）的文物。这种类型的19,20含量格式特别用于抑制和竞争研究有价值21逆转方向也可以在几种情况下是有利的， 即 a）与低分子量的分析物，考虑到结合信号正比于表面质量变动b）聚合和非特异性疏水性分析物22的被淘汰使得高亲和力结合数据分析直截了当三）能表征是由于较长的停留时间（慢解离速率，尤其是当共价抑制剂买卖）23和需要表面再生条件，准备下一个分析周期四）再生剂可能对的结构或功能的降解效果具有挑战性固定化蛋白质。
通过将生物正交捕获环加成法作为我们固定化战略的一部分，我们规避了一些与传统的小分子固定技术相关的困难。这些都需要更高的配体浓度，因为静电引力导致表面预先浓度典型的蛋白质固定的协议是无效的小分子。因此，越来越多的配位体的浓度导致增加的有机共溶剂的比率为配位体溶解。这两个条件是不与微流体流动系统兼容，并且作为结果，常规的我mmobilizations必须的仪器，其中的实时监控是不可能的。24最后，在一个成功的常规固定化的情况下，共价键的表面改性可以防止表面再生，并限制了实验范围内导致在时间，人力投资增加的生物传感器表面的外部执行和成本。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们承认从美国国立卫生研究院（NHLBI合约编号HHSN268201000044C到RW，上海和SYS）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Sensor Chip CM5 | GE Healthcare | BR-1005-30 | |
| Amine coupling kit | GE Healthcare | BR-1000-50 | |
| GST capture kit | GE Healthcare | BR-1002-23 | |
| NAP-10 Columns | GE Healthcare | 17-0854-01 | |
| GST, lyophilized in 1X PBS | Genscript | Z02039 | 1 mg/ml |
| rhFKBP12 | R&D Systems | 3777-FK | |
| Surfactant P-20 | GE Healthcare | BR-1000-54 | |
| Glycine 2.0 | GE Healthcare | BR-1003-55 | |
| Zeba spin desalting column | Thermo | 89882 | 7 K MWCO |
| Amicon Ultra 4 | Fisher | UFC810096 | 100 K centrifugal filter |
| TCO-OH | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| TCO-NHS | Ref. 8 | Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25 | |
| Tz-BnNH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Tz-NHS | Ref. 8 | 764701 | Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701 |
| NP-NH2 = CLIO-NH2 | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| AP1497, AP1497-Tz | Ref. 8 | Synthesized in-house | |
| Equipment | |||
| SPR Biosensor | GE Healthcare | Biacore T100 | |
References
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