Summary
本文介绍了比色法检测福尔马林固定的肾部分microRNA表达谱进行优化的原位杂交协议。
Abstract
在本文中，我们通过与地高辛原位杂交描述了在肾脏比色法检测miRNA的方法标记的小分子RNA探针。这个协议中，最初是由Kloosterman和同事们用Exiqon miRNA探针1广泛使用而开发的，已被修改以克服固有的miRNA分析在肾组织中的挑战。这些包括诸如结构识别和难以除去残留的探针和抗体。使用比较薄的，厚5毫米，可清晰肾脏结构的可视化，同时强大的探测信号被保留在细胞组织切片。此外，探针浓度和培养条件进行了优化，以方便与低背景和非特异信号的microRNA表达谱的可视化。此处，优化的协议进行了说明，通过幻灯片在该过程结束时，安装覆盖所述初始组织收集和制备。其基本组件管理此协议的NTS可以改变应用到其它组织和细胞培养模型。
Introduction
微RNA是小（约22个核苷酸长），非编码所产生的内源性的RNA。他们一般通过功能翻译抑制或mRNA降解，抑制蛋白的表达。的miRNA结合到靶mRNA不完全互补，从而有可能为一个单一的miRNA抑制多个目标。
了解哪些类型的细胞和结构表达的miRNA是理解机制的重要组成部分，通过它在miRNA的表达影响细胞和组织表型的改变。而方法如miRNA的测序，定量PCR和Northern杂交可用于检测在整个组织中的miRNA，这种方法不允许之一，以确定哪个特定的细胞类型，他们从一个给定组织中来了。使用这些方法和蜂窝结构成分分析之前夹层可以是非常困难的，以获得足够的隔离度所需的条件能导致人terations在基因表达或RNA的降解。微小RNA 原位杂交是用于可视化组织中微小RNA的位置和表达水平的方法。这种技术是在组织异质结构，如肾组成的特别有价值。
小分子RNA已被证明发挥肾脏发育2,3和生理学4的调节作用。微小RNA表达的改变也被证明参与与肾脏病理如纤维化5-10，糖尿病肾病7，肾癌11,12，和急性肾损伤13。在我们的研究中，我们已经发现， 在对肾组织原位杂交优化微小RNA是用于确定miRNA的表达在健康和疾病14的确切结构的位置有价值。不同的microRNA的管状和细胞表达的测定是很重要的，因为TA自己调节rgets可能依赖于细胞功能。在疾病状态也很重要，以确定如何在miRNA表达的改变可能影响功能。
这里描述的方法的目标是建立在由Kloosterman 等 15，其他研究者16,17开发现有ISH方法，以及那些建议的Exiqon 1和优化方法对福尔马林固定的肾组织。我们已经成功地使用这种方法来确定单侧输尿管梗阻18在肾小分子RNA的miR-382的表达明显的地区差异。这种方法可以与其他组织可以用作良好，额外的优化。
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Protocol
1。肾组织切片
- 福尔马林固定的（10％）的石蜡包埋的肾脏切片使用的是MICROM HM 355 S的幻灯片可以被存储以供分析前几个月切到显微镜载玻片上以5mm的厚度。
2。溶液的制备
- 准备1升的1×PBS的在DDH 2 O在高压灭菌螺旋盖瓶。填写另一瓶1升双蒸2 O的加入1 ml的DEPC到每一瓶，盖和剧烈震荡。让该溶液静置过夜，在室温下，以破坏RNA酶，然后高压灭菌。添加400毫升吐温20，以1升1×PBS中，使PBS-T。
- 制备的蛋白酶K缓冲液（50 mMTris-盐酸，pH值8.0和1mM的CaCl 2在DEPC处理的水）。
- 制备在PBS-T中的0.2％的甘氨酸溶液。
3。组织准备
- 准备大量的杂交缓冲液（50-100毫升）50％甲酰胺组成的，5×SSC，0.1％吐温，9.2mM柠檬酸调整pH至6，50微克/毫升肝素和500μg/ ml的酵母于DEPC处理过的RNA双蒸2 O。划分为1毫升分装并储存于-80℃。
- 在新鲜的二甲苯清洗3次，每次5分钟从组织中取出石蜡。
- 通过5分钟的孵育在减少浓度的乙醇（100％，75％，50％和25％）在DDH 2 O再水合的组织切片
- 治疗载玻片用DEPC足够完全覆盖组织切片（约0.4-0.5毫升），持续1分钟。确保组织不干燥。
- 漂洗DEPC幻灯片处理PBS-T两次5分钟，收集废物妥善处置含DEPC。所有试剂应DEPC处理，以消除RNA酶从这点上。
- Prewarm蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K加至10微克/毫升的最终浓度。涵盖组织切片用蛋白酶K溶液和孵化在37℃下5分钟。
- 快速去除proteinasËK溶液，并加入PBS-T 0.2％的甘氨酸，持续30秒。
- 于DEPC冲洗玻片处理PBS-T两次，每次30秒。
- 固定在新鲜配制的4％多聚甲醛固定切片10分钟。
4。杂交
- 加50微升杂交缓冲液（50％甲酰胺，5×SSC，0.1％吐温，9.2 mM柠檬酸调整pH至6，50微克/毫升肝素，500微克/毫升酵母RNA）每组织切片，并盖上无RNA酶的HybriSlips切只是比组织切片大。
- Prehybridize部分在湿度受控杂交烘箱中2小时，在杂交温度下测定的3'地高辛标记的探针（探针通常是DNA的Tm -21℃（ 即 54℃下的miR-382，探针DNA的Tm = 75℃ ），采用浸泡在50％formamide/50％5×SSC组织实验室擦拭，以保持腔室加湿。
- 淡化miRNA的探针，阳性对照组（U6，小核RNA）和阴性对照（炒序列），以40nm的在杂交缓冲液（75微升缓冲液中的每部分需要的话）。
- 热探针在杂交缓冲液中于65℃维持5分钟。
- 从杂交烤箱中取出的幻灯片，并从预杂交取出盖玻片和多余的杂交缓冲液。
- 加75微升每组织切片探针含有缓冲液，直接给组织。涵盖组织与HybriSlips只是大到足以覆盖的组织切片。
- 保持滑架的水平，回归杂交炉过夜孵育温度从步骤4.2（约16小时）。
5。严格洗涤
- 加入200μl2×SSC，加热到杂交温度，刚下盖玻片的一边，以帮助从组织中释放盖玻片。通过倾斜滑动取下盖玻片。
- 在杂交温度3倍于200微升50％甲酰胺，50％的2倍SSC洗玻片各30分钟。
- 冲洗载玻片5倍的PBS-T在室温下每5分钟对低速轨道摇床。
6。发现
- 在封闭缓冲液（2％山羊或马血清，2毫克/毫升BSA的PBS-T）1小时，在室温下对低速轨道摇床孵育滑动。
- 稀释的抗DIG-AP Fab片段在封闭缓冲液以1:100。添加每组织切片100微升，盖上HybriSlips切只是大到足以遮盖上述部位。
- 孵育抗体在湿盒中4℃过夜（约16小时）。
- 在PBS-T洗7倍的幻灯片，对于每5分钟在轨道摇床中于低速。
- 在AP缓冲液冲洗载玻片（100mM的TrisHCl pH为9.5，50毫摩尔MgCl 2，100mM的氯化钠，0.1％吐温20）3倍，每次5分钟。
- 加入NBT / BCIP解决AP缓冲液（200毫升μl/10缓冲区）
- 加入400-500毫升稀释后NBT / BCIP解决方案，以每张幻灯片完全覆盖所有的组织切片。建立在一个黑暗的，水平，humidif灭蝇灯腔4-5小时。
7。安装滑轨
- 在每个5分钟递增浓度的乙醇（25％，50％，75％，100％）脱水部分。
- 在孵育二甲苯5倍，以清除部分。
- 山滑入Permount安装介质和干燥过夜。
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Representative Results
在杂交中，孵育该变得干涸或一般洗涤步骤结束的NBT / BCIP发育过程中染色更暗的组织切片的区域， 图1示出了肾部分，其中HybriSlip滑落的边缘的一部分的组织，使之成为部分脱水。尽管补液和覆盖范围中的其余步骤，在脱水部分的信号是虚高。
控制NBT-BCIP发展的时间的重要性是体现在图2A和2B。比4-5小时，结果明显的非特异性显色的炒-MIR控制探讨组织整个肾（ 图2A）较长的开发周期。肾脏探查高丰度的目标，如U6小核RNA控制，没有表现出改善的信号，比孵育4-5小时延长（ 图 URE 2B）。
这里描述的miRNA检测肾组织中的原位杂交方法的适用性是表现在图3中 ，一个身影从KRIEGEL转载等 18在这项研究中，我们发现，单侧输尿管梗阻（UUO）诱导的qPCR近3倍时相比，假手术动物检测匀浆肾组织的miR-382的表达。这一增长阻断静脉提供防的miR-382（数据未显示）。 ISH对这些肾脏组织使用表明，该探测器提供的的miR-382的检测是能够非常敏感地反映了基于定量PCR表达分析量化的结果。此外，ISH使我们能够衡量肾脏内miRNA的表达明显的地区差异。
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图1大鼠肾脏部分的部分脱水的过程中杂交步骤的影响。校准条= 100毫米。 点击这里查看大图 。
图2。优化NBT / BCIP发展的持续时间。允许NBT / BCIP发展到持续超过4-5小时的结果显著背景染色在加扰-MIR探测组织中（ 图2A），同时提供了在没有进一步改善在积极控制信号，U6小核RNA探测样品（ 图2B）。 点击这里查看更大的图像。
图3中通过原位杂交获得的小鼠的肾脏的miR-382表达的代表性的图像。校准棒= 50微米。 （B）的miR-382表达为假手术+抗扰码处理的小鼠％的平均IOD。这个数字已经被修改KRIEGEL 等人 ，（ 图5），它描述了治疗组，方法的细节和结果18。反扰频后的n = 10/group;抗的miR-382 N = 8/group; *显著不同的抗扰频处理的小鼠与相同手术（P <0.05），＃显著不同假手术动物接受相同的抗-MIR治疗。 点击这里查看大图。
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Discussion
本文的目的是描述了miRNA的原位杂交协议，在福尔马林固定的肾组织效果很好。虽然制定这个协议染色神器的几个重要来源已经确定。仔细注意这几点可以帮助避免染色神器，增加成功的ISH执行的可能性。
可以发生一个染色神器的最可避免的原因时，组织切片成为在漫长的孵化干涸。当此发生时变成干燥的组织部分将NBT / BCIP发育（ 图1）中染色很暗。在本协议是很关键的组织切片保持在所有的孵育和该载片保持完全水平完全覆盖液体。此外，该组织切片应该保持完全在长时间的孵化如杂交步骤涵盖HybriSlips和该抗体孵育，以帮助防止液体流失。如果组织切片部分或完全干燥，观察它是不可能的样品将产生最佳的染色，这将不允许miRNA表达的那些样品中被解释。
在协议中，其中液体的覆盖是必需的其他步骤是蛋白酶K消化和多聚甲醛在治疗过程中。此消化需要，以允许所述miRNA探针的访问进入细胞。如果组织的覆盖面这短暂的孵育过程中是不完整的，未暴露在酶消化方面不会允许尽可能多的探针进入和绑定，并最终不会弄脏的黑暗其他的组织的其他区域。当应用该协议向其他组织类型，蛋白酶K消化的持续时间可能需要进行优化。随后的多聚甲醛固定也是必不可少的，以防止miRNA的损失以下通透性。
NT“> NBT / BCIP发展的持续时间也控制的一个重要变量。我们发现，超过4或5个小时更长NBT / BCIP孵育显著背景工件开始在探测与加扰-MIR对照探针（组织发展图2A）。四小时NBT / BCIP发展的足够用于检测诸如U6小RNA阳性对照组（ 图2B）表示的相对高丰度探测目标。停止孵化不出来，以允许额外的低水平表达，以被检测到，而这可能只是导致增加的背景神器。这导致了较低的表达的miRNA的可探测性的重要课题。虽然我们已经找到了5'地高辛标记的探针来为我们提供我们的肾脏中的应用足够的检测灵敏度。碱性磷酸酶为主色调的发展使得被测量的EAC多个信号颗粒探头h的分子，但一些低级别的miRNA仍可能无法检测到。 Exiqon开发了miRNA的探针被标记的5既'和3'末端上，允许为每个微小RNA分子的色度发展两次的可能性。虽然我们的实验室还没有测试过这些探针，其在肾组织有类似协议的使用已报道8。
这个基本的协议，可以通过优化蛋白酶K消化时间可以适用于其他类型的组织和miRNA探针，miRNA的探针浓度，杂交温度和NBT / BCIP开发时间。另外，也可以在与在其中的组织的自发荧光是适当的低荧光抗体组合使用的协议的第一部分。
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Disclosures
没有什么可以透露。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院赞助授予HL082798和HL111580。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
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