Summary
Denne artikel beskriver en in situ hybridisering protokol optimeret til kolometriske detektion af microRNA udtryk i formalin faste nyresnit.
Abstract
I denne artikel beskriver vi en metode til kolorimetrisk detektion af miRNA i nyrerne gennem in situ hybridisering med digoxigenin tagged microRNA sonder. Denne protokol, der oprindeligt blev udviklet af Kloosterman og kolleger for bred anvendelse med Exiqon miRNA sonder 1, er blevet ændret til at overvinde udfordringer forbundet med miRNA-analyse i nyrevæv. Disse omfatter spørgsmål såsom identifikation struktur og svært at fjerne resterende sonde og antistof. Anvendelse af relativt tyndt, 5 mm tyk, vævssnit tilladt for klar visualisering af nyre-strukturer, mens en stærk sondesignal blev tilbageholdt i celler. Derudover blev probe koncentrations-og inkubationsbetingelser optimeret for at lette visualiseringen af microRNA udtryk med lav baggrund og uspecifik signal. Her er optimeret beskrevne protokol, der dækker den indledende væv indsamling og forberedelse gennem montering af glider ved slutningen af proceduren. Den grundlæggende componeNTS i denne protokol kan ændres til anvendelse til andre væv og cellekultur modeller.
Introduction
MicroRNA er små (ca. 22 nukleotider lange) noncoding RNA, der er endogent produceret. De fungerer generelt at undertrykke protein udtryk gennem translationel undertrykkelse eller mRNA nedbrydning. miRNA binder til mRNA-mål med ufuldstændig komplementaritet, hvilket gør det muligt for en enkelt miRNA at undertrykke flere mål.
Forståelse som celletyper og strukturer udtrykker miRNA er en vigtig del af at forstå de mekanismer, hvorigennem ændringer i miRNA udtryk indflydelse celle og væv fænotyper. Mens metoder såsom miRNA sekventering, qPCR og Northern blotting kan anvendes til detektion af miRNA i hele væv, er denne fremgangsmåde ikke tillader en at bestemme, hvilken specifik celletype de kom fra inden for et givet væv. Dissektion af cellulære og strukturelle komponenter inden analyse ved hjælp af disse metoder kan være meget vanskeligt, og de betingelser, der er nødvendige for at opnå tilstrækkelige isolationer kan føre til alterations i genekspression eller forringelse af RNA. microRNA in situ hybridisering er en metode anvendt til at visualisere microRNA placering og ekspressionsniveauer i væv. Denne teknik er især værdifuldt i væv sammensat af heterogene strukturer, såsom nyrerne.
MicroRNAs har vist sig at spille en regulerende rolle i nyre-udvikling 2,3 og fysiologi 4. har også vist microRNA udtryk ændringer for at blive involveret med nedsat patologi såsom fibrose 5-10, diabetisk nefropati 7, nyrekarcinom 11,12 og akut nyreskade 13. I vores forskning har vi fundet, at en optimering microRNA in situ hybridisering for nyrevæv var værdifuldt for fastsættelse af det præcise strukturelle placeringer af miRNA-ekspression i både sundhed og sygdom 14. Bestemmelse af det rørformede og cellulære udtryk for forskellige microRNA er vigtigt, fordi deres regulering af targets kan være afhængig af cellulære funktioner. I sygdomstilstande er det også vigtigt at bestemme, hvordan ændringer i miRNA ekspression kan påvirke funktionen.
Målet med den her beskrevne fremgangsmåde var at bygge videre på eksisterende ISH metoder udviklet af Kloosterman et al. 15. andre efterforskere 16,17, og dem, der foreslås af Exiqon 1 og optimere metoden til formalin faste nyrevæv. Vi har med succes brugt denne metode til at identificere tydelige regionale forskelle i renal microRNA miR-382-ekspression med unilateral ureter obstruktion 18. Denne fremgangsmåde kan anvendes med andre væv samt, med yderligere optimering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Nyrevævssnittene
- Formalin-fikseret (10%) paraffinindstøbte nyresnit skæres over på objektglas ved 5 mm tykkelse ved hjælp af en microM HM 355 S. slides kan opbevares i adskillige måneder før analyse.
2. Solution Preparation
- Forbered 1 liter 1x PBS i ddH2O i en autoklaverbar skruelåg flaske. Fyld en anden flaske med 1 L af Hedeselskabet 2 O. Der tilsættes 1 ml DEPC til hver flaske, låg og ryst kraftigt. Lad løsninger sidde natten over ved stuetemperatur for at ødelægge RNAser og derefter autoklaveres. Tilsæt 400 ml Tween-20 til 1 L 1x PBS til at PBS-T.
- Forbered proteinase K-buffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,0 og 1 mM CaCl2 i DEPC behandlet vand).
- Forbered en opløsning af 0,2% glycin i PBS-T.
3. Vævspræparat
- Forbered et stort volumen af hybridiseringspuffer (50-100 ml) bestående af 50% formamid, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2mM citronsyre til justering til pH 6, 50 ug / ml heparin og 500 pg / ml gær-RNA i DEPC behandlet Hedeselskabet 2 O. Opdel i 1 ml portioner og opbevares ved -80 º C.
- Fjern paraffinen fra vævet ved at vaske 3 x med fersk xylen i 5 minutter hver.
- Rehydrere vævssnit ved 5 min inkubationer i faldende koncentrationer af ethanol (100%, 75%, 50% og 25%) i Hedeselskabet 2 O.
- Behandl dias med nok DEPC til helt at dække de vævssnit (ca. 0,4-0,5 ml) i 1 min. Sørg væv ikke tørrer ud.
- Skyl dias i DEPC behandlet PBS-T to gange i 5 min, indsamle DEPC holdigt affald til korrekt bortskaffelse. Alle reagenser skal være DEPC behandlet for at fjerne RNAser fra dette punkt.
- Forvarm Proteinase K-buffer og tilsættes proteinase K til en slutkoncentration på 10 ug / ml. Dæk vævssnit med proteinase K-opløsning og inkuberes ved 37 º C i 5 min.
- Fjern hurtigt de proteinase K, og der tilsættes 0,2% glycin i PBS-T til 30 sek.
- Skyl objektglassene i DEPC behandlet PBS-T to gange i 30 sek hver.
- Lave sektioner i frisk 4% paraformaldehyd i 10 min.
4.. Hybridisering
- Der tilsættes 50 pi hybridiseringsbuffer (50% formamid, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM citronsyre justering til pH 6, 50 ug / ml heparin, 500 pg / ml gær-RNA) pr vævssnit og dække med RNAse gratis HybriSlips skåret lige større end vævssnit.
- Prehybridize sektioner i fugtighed kontrolleret hybridisering ovn i 2 timer ved hybridisering temperatur, der bestemmes for 3'-digoxigenin-mærket probe (sædvanligvis DNA probens Tm -21 ° C, (dvs. 54 ° C for miR-382, probe DNA Tm = 75 ° C ) under anvendelse af væv lab servietter dyppet i 50% formamide/50% 5x SSC at holde kammeret befugtet.
- Fortynd miRNA sonde, positiv kontrol (U6, lille nukleare RNA) og en negativ kontrol (krypteretsekvens) til 40 nM i hybridiseringsbuffer (der er behov for 75 pi buffer pr afsnit).
- Varm sonde i hybridiseringspuffer ved 65 ° C i 5 min.
- Fjern slides fra hybridisering ovn og fjerne dækglas og overskydende hybridisering buffer fra præhybridiserings.
- Tilføj 75 pi probe, der indeholder puffer pr vævssnittet direkte til væv. Dæk væv med HybriSlips lige store nok til at dække vævssnit.
- Holde diasholder niveau, tilbage til hybridisering ovn til inkubering natten over ved temperatur fra trin 4.2 (ca. 16 timer).
5.. Stringensskylning
- Tilsæt 200 pi 2 x SSC, opvarmes til hybridisering temperatur lige under den ene kant af dækglassene at hjælpe med at frigive dækglasset fra vævet. Fjern dækglasset ved at vippe diaset.
- Vaskes objektglassene i 200 pi 50% formamid, 50% 2x SSC ved hybridiseringstemperatur 3x hver 30 min.
- SkylObjektglassene 5x i PBS-T ved stuetemperatur i 5 minutter hver på orbitalryster ved lav hastighed.
6.. Detection
- Inkuber dias i blokerende buffer (2% gede-eller hesteserum, 2 mg / ml BSA i PBS-T) i 1 time ved stuetemperatur på orbitalryster ved lav hastighed.
- Fortyndet anti-DIG-AP Fab-fragmenter i blokeringsbuffer til 1:100. Tilsæt 100 pi pr vævssnit og dække med HybriSlips skåret lige stor nok til at dække sektionen.
- Inkuber antistof i et fugtigt kammer ved 4 ° C natten over (ca. 16 timer).
- Vask dias i PBS-T 7x, i 5 minutter hver på orbitalryster ved lav hastighed.
- Vaskes objektglassene i AP-buffer (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 3x, i 5 minutter hver.
- Tilføj NBT / BCIP opløsning til AP-buffer (200 μl/10 ml puffer)
- Tilføj 400-500 ml fortyndet NBT / BCIP løsning på de enkelte dias til helt at dække alle vævssnit. Udvikle sig i en mørk, niveau, humidifIED kammer til 4-5 timer.
7.. Montage Slides
- Dehydrer sektioner i stigende koncentrationer af ethanol (25%, 50%, 75%, 100%) i 5 minutter hver.
- Inkuber i xylen 5x for at klare sektioner.
- Mount glider i Permount montage medium og tørre natten over.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De områder af et vævssnit, der bliver tørret i løbet af de hybridiseringer inkubationerne eller vaske trin generelt ender farvning mere mørkt i NBT / BCIP udvikling. Figur 1 viser en del af en nyre sektion, hvor HybriSlip gled ud af kanten af vævet, gør det muligt at blive delvist dehydreret. Trods rehydrering og dækning i de resterende trin, signalet i dehydreret delen er kunstigt høj.
Betydningen af at styre tidspunktet for NBT-BCIP udvikling er demonstreret i figur 2A og 2B. Udvikling perioder længere end 4-5 hr medføre udtalt uspecifik farve udvikling i scrambled-miR kontrol tastede væv i hele nyren (figur 2A). Nyrer tastede for stor rigdom mål, såsom U6 lille kerne-RNA kontrol, ikke udviser forbedrede signaler med inkubationer længere end 4-5 timer (Fig URE 2B).
Anvendeligheden af den her beskrevne til miRNA detektion i nyrevævet ISH metode er demonstreret i figur 3, en figur gengivet fra Kriegel et al. 18. I denne undersøgelse fandt vi, at ensidig ureter obstruktion (UUO) inducerede en næsten 3-dobling i qPCR detekteres miR-382-ekspression i homogeniseret nyrevævet i forhold til sham-opererede dyr. Denne stigning blev blokeret af intravenøs levere anti-miR-382 (data ikke vist). Anvendelsen af ISH disse nyrevæv indikerede, at miR-382 detektering fra denne probe var følsomt nok til at give kvantificerbare resultater, spejlede qPCR baseret ekspressionsanalyse. Derudover ISH tilladt os at måle tydelige regionale forskelle i miRNA-ekspression i nyrerne.
600px "/>
Figur 1.. Virkningen af den delvis dehydrering af en rotte nyre sektion under hybridisering trin. Calibration bar = 100 mm. Klik her for at se større billede .
Figur 2.. Optimering af varigheden af NBT / BCIP udvikling. Tillade NBT / BCIP udvikling at fortsætte i mere end 4-5 hr resulterer i signifikant baggrundsfarvning i røræg-miR aftestede væv (figur 2a), men samtidig give nogen yderligere forbedring i signalet i den positive kontrol, U6 små nukleare RNA tastede prøver (figur 2b). Klik her for at visestørre billede.
Figur 3.. Repræsentative billeder af miR-382-ekspression i muse nyresnit opnået ved in situ hybridisering. Calibration bar = 50 um. (B) miR-382 udtryk som procent i gennemsnit IOD af sham + anti-kodede behandlede mus. Dette tal er blevet ændret fra Kriegel et al., (Figur 5), der beskriver detaljerne i behandlingsgrupper, metoder og resultater 18. Anti-krypteret behandlet n = 10/gruppe anti-Mir-382 n = 8/group * signifikant forskellig fra anti-kodede behandlede mus med samme kirurgi (P <0,05), # signifikant forskellig fra skinopererede dyr, der modtog den samme anti -Mir behandling. Klik herfor at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne artikel var at beskrive en protokol for miRNA in situ hybridisering, der fungerer godt i formalin faste nyrevæv. Mens de arbejder ud denne protokol flere vigtige kilder til farvning artefakt er blevet identificeret. Omhyggelig opmærksomhed på disse punkter kan bidrage til at undgå pletter artefakt og øge sandsynligheden for en vellykket ISH løb.
En af de mest undgåelige årsager til farvning artefakt kan opstå, når vævssnit blevet tørret ud i lange inkubationer. Når dette sker, den del af det væv, der bliver tørret vil pletten meget mørkt under udviklingen NBT / BCIP (figur 1). Gennem denne protokol er det afgørende, at de vævssnit forbliver helt dækket af væske i alle inkubationer og at dias er helt holdt niveau. Derudover bør vævssnit forblive fuldstændig dækket af HybriSlips under lange inkubationer såsom hybridiseringstrin og antistoffet inkubation, at hjælpe med at forhindre væsketab. Hvis der observeres delvis eller fuldstændig tørring af et væv sektion er det usandsynligt, at prøverne vil give optimal farvning, som ikke vil tillade miRNA udtryk skal fortolkes i disse prøver.
Andre trin i protokollen, hvor flydende dækning er afgørende er under proteinase K fordøjelse og paraformaldehydbehandling. Denne nedbrydning er nødvendig for at muliggøre adgang miRNA probe i cellerne. Hvis dækningen af vævet er ufuldstændig i løbet af denne korte inkubation de områder, der ikke er udsat for enzymet fordøjelsen ikke tillade så meget sonde til ind og binde, og vil i sidste ende ikke pletter så mørkt som andre andre områder af vævet. Ved anvendelse af denne protokol til andre vævstyper, kan være nødvendigt at optimere varigheden af proteinase K fordøjelse. Den efterfølgende paraformaldehydfiksering er også vigtigt at forhindre tab af miRNA efter permeabilisering.
nt "> Varigheden af NBT / BCIP udvikling er også en vigtig variabel at kontrollere. Vi fandt, at NBT / BCIP inkuberinger af mere end 4 eller 5 timer væsentlig baggrund artefakt begynder at udvikle sig i vævene sonderet med scrambled-miR kontrol prober ( Figur 2A). Fire timer NBT / BCIP udvikling er tilstrækkelig til detektion af sonde mål, der udtrykkes i relativt høj tæthed, såsom U6 lille RNA positiv kontrol (figur 2B). ikke længere inkubationer ikke at give mulighed for yderligere lavt niveau udtryk for påvises, snarere dette blot kan resulterer i øget baggrund artefakt.Dette fører til det vigtige spørgsmål om sporbarhed af lavere udtrykt miRNA. Selvom vi har fundet 5 'digoxigenin konjugerede prober til at give os tilstrækkelig følsomhed til vores applikationer i nyre. Alkalisk fosfatase baseret farve udvikling giver mulighed for flere signal partikler, der skal måles på ØKh molekyle af sonde, men nogle lavt niveau miRNA stadig må ikke kunne påvises. Exiqon havde udviklet miRNA prober, der er mærket på både 5'-og 3'-ender tillader potentialet for det dobbelte af den kolorimetriske udvikling pr microRNA molekyle. Mens vores laboratorium ikke har testet disse prober, har deres anvendelse i nyrevæv med en tilsvarende protokol blevet rapporteret 8.
Denne grundlæggende protokol kan tilpasses til andre vævstyper samt miRNA prober ved at optimere proteinase K fordøjelse tid miRNA probe koncentrationer hybridiseringsbetingelser temperaturer og NBT / BCIP udviklingstid. Det er også muligt at bruge den første del af protokol i kombination med fluorescerende antistoffer i væv, hvor autofluorescens er passende lav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af US National Institutes of Health tilskud HL082798 og HL111580.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
- Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
- Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
- Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
- Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
- Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
- Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
- Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
- Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
- Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
- Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
- Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
- Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
- Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).
