Summary
Dit artikel beschrijft een in situ hybridisatie protocol geoptimaliseerd voor colorimetrische detectie van microRNA expressie in formaline gefixeerde niersecties.
Abstract
In dit artikel wordt een methode voor de colorimetrische detectie van miRNA in de nier beschrijven we door in situ hybridisatie met digoxigenine gelabeld microRNA probes. Dit protocol, oorspronkelijk ontwikkeld door Kloosterman en collega's voor een breed gebruik met Exiqon miRNA sondes 1, is aangepast om de uitdagingen die inherent zijn miRNA analyse in nierweefsel overwinnen. Deze omvatten zaken als identificatie structuur en moeilijk om de resterende sonde en antilichaam te verwijderen. Het gebruik van relatief dunne, 5 mm, weefselcoupes toegestaan duidelijke visualisatie van structuren nieren, terwijl een sterke testsignaal werd behouden in cellen. Bovendien werden probeconcentratie en incubatie-omstandigheden geoptimaliseerd om visualisatie van microRNA expressie met lage achtergrond en niet-specifieke signaal te vergemakkelijken. Hier wordt de geoptimaliseerde protocol beschreven voor een eerste weefsel en bereidingsmethodes door de montage van dia aan het einde van de procedure. De basis componegen van dit protocol kan worden aangepast voor toepassing op andere weefsels en celcultuur modellen.
Introduction
MicroRNA zijn klein (ongeveer 22 nucleotiden lang) niet-coderende RNA's die endogeen wordt geproduceerd. Zij over het algemeen functioneren van eiwit expressie te onderdrukken door middel van translationeel repressie of mRNA degradatie. miRNAs binden aan mRNA doelen met onvolledige complementariteit, waardoor het mogelijk is voor een enkele miRNA aan verschillende doelen te onderdrukken.
Begrijpen welke celtypen en structuren te uiten miRNA's is een belangrijk onderdeel van het begrijpen van de mechanismen waardoor veranderingen in miRNA expressie invloed cellen en weefsels fenotypes. Hoewel methoden zoals miRNA sequencing, qPCR en Northern blotting kan worden gebruikt voor de detectie van miRNAs geheel weefsels staat deze benadering niet mogelijk maken om te bepalen welke specifieke celtype ze uit in een gegeven weefsel. Dissectie van cellulaire en structurele componenten voorafgaand aan de analyse met behulp van deze methoden kan heel moeilijk zijn en het nodig is om een adequate isolatie bereiken omstandigheden kunnen leiden tot alterations in genexpressie of afbraak van RNA's. microRNA in situ hybridisatie is een methode die wordt gebruikt om microRNA locatie en expressie niveaus visualiseren in weefsels. Deze techniek is bijzonder waardevol in weefsels bestaande uit heterogene structuren, zoals de nieren.
MicroRNAs is aangetoond dat een regulerende rol in de ontwikkeling nier 2,3 en fysiologie 4 spelen. microRNA expressie veranderingen hebben ook aangetoond te worden betrokken met nier pathologie zoals fibrose 5-10, diabetische nefropathie 7, niercarcinoom 11,12, en acute nierschade 13. In ons onderzoek hebben wij gevonden dat het optimaliseren van microRNA in situ hybridisatie voor nierweefsel was waardevol voor het bepalen van de exacte locaties van structurele miRNA expressie in zowel gezondheid en ziekte 14. Bepaling van de buisvormige en cellulaire expressie van verschillende microRNAs is belangrijk omdat de regulering van targets kan afhankelijk cellulaire functies zijn. In zieke toestanden is het ook belangrijk om te bepalen hoe veranderingen in miRNA expressie kan beïnvloeden functie.
Het doel van de hier beschreven methode was om voort te bouwen op bestaande ISH methodieken ontwikkeld door Kloosterman et al.. 15, andere onderzoekers 16,17, en die voorgesteld door Exiqon 1 en optimaliseren van de methode voor het formaline gefixeerde nierweefsel. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methode om duidelijke regionale verschillen in de renale microRNA miR-382 expressie met eenzijdige ureterobstructie 18 identificeren. Deze benadering kan worden gebruikt met andere weefsels ook, met extra optimalisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nierweefsel Secties
- Met formaline gefixeerde (10%) in paraffine ingebedde niersecties gesneden op microscoopglaasjes bij 5 mm dik met een Microm HM 355 S. De objectglaasjes kunnen worden opgeslagen voor meerdere maanden vóór de analyse.
2. Oplossing Voorbereiding
- Bereid 1 liter 1x PBS in DDH 2 O in een autoclaaf schroefdop fles. Vul een andere fles met 1 L van DDH 2 O. Voeg 1 ml DEPC om elke fles, deksel en schud krachtig. Laat de oplossingen zitten overnacht bij kamertemperatuur te RNAses vernietigen en vervolgens autoclaaf. Voeg 400 ml Tween-20 en 1 l 1X PBS PBS-T maken.
- Bereid proteïnase K-buffer (50 mMTris-HCl, pH 8,0 en 1 mM CaCl2 in DEPC behandeld water).
- Bereid een oplossing van 0,2% glycine in PBS-T.
3. Tissue Voorbereiding
- Bereid een groot volume hybridisatiebuffer (50-100 ml) bestaande uit 50% formamide, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2mM citroenzuur om een pH van 6, 50 ug / ml heparine en 500 ug / ml gist-RNA DEPC behandeld DDH 2 O. Verdeel het deeg in 1 ml porties en bewaar bij -80 º C.
- Verwijder de paraffine uit het weefsel door 3x wassen in vers xyleen gedurende 5 minuten elk.
- Hydrateren de weefselcoupes door 5 minuten incubaties afnemende concentraties ethanol (100%, 75%, 50% en 25%) in DDH 2 O.
- Behandel de dia's met voldoende DEPC volledig te bedekken de weefselcoupes (ongeveer 0,4-0,5 ml) gedurende 1 minuut. Zorg ervoor dat de weefsels niet uitdrogen.
- Spoel de glaasjes in DEPC behandeld PBS-T tweemaal gedurende 5 min, het verzamelen van de DEPC met afval voor de juiste afvoer. Alle reagentia moeten worden DEPC behandeld om RNAses elimineren vanaf dit punt.
- Voorverwarmen Proteinase K-buffer en voeg proteinase K om een eindconcentratie van 10 ug / ml. Bedek weefselsecties met proteinase K oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Snel te verwijderen van de proteinase K oplossing en voeg 0,2% glycine in PBS-T gedurende 30 sec.
- Spoel de objectglaasjes in DEPC behandeld PBS-T tweemaal gedurende 30 seconden elk.
- Fix secties in vers 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten.
4. Hybridisatie
- Voeg 50 ul hybridisatiebuffer (50% formamide, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM citroenzuur om een pH van 6, 50 ug / ml heparine, 500 ug / ml gist-RNA) per weefselsectie en bedek met RNAse vrij HybriSlips cut net groter dan het weefsel secties.
- Prehybridize secties vochtigheid hybridisatie oven gedurende 2 uur bij hybridisatietemperatuur bepaald voor de 3 'digoxigenine gemerkte probe (gewoonlijk DNA Tm van de probe -21 ° C, (bijvoorbeeld 54 ° C voor miR-382, DNA probe Tm = 75 ° C ), met behulp van weefsel lab doekjes gedrenkt in 50% formamide/50% 5x SSC om de kamer te houden bevochtigd.
- Verdun de miRNA sonde, positieve controle (U6, kleine nucleaire RNA) en negatieve controle (roereisequentie) tot 40 nM in hybridisatiebuffer (75 pl buffer is nodig per sectie).
- Verwarm de sonde in hybridisatiebuffer bij 65 ° C gedurende 5 minuten.
- Verwijder dia's van hybridisatie oven en verwijder de dekglaasjes en overtollige hybridisatie buffer van prehybridisatie.
- Voeg 75 ul van probe die buffer per weefsel sectie, rechtstreeks aan weefsel. Bedek weefsel met HybriSlips net groot genoeg om het weefsel secties omvatten.
- Keeping diahouder niveau, terug naar hybridisatie oven gedurende incubatie overnacht bij een temperatuur van stap 4.2 (ongeveer 16 uur).
5. Wassing
- Voeg 200 ul 2x SSC, verwarmd tot de hybridisatie-temperatuur net onder een rand van de dekglaasjes om vrij het dekglaasje van het weefsel. Verwijder het dekglaasje door het kantelen van de dia.
- Was de glaasjes in 200 pi 50% formamide, 50% 2x SSC bij hybridisatietemperatuur 3x 30 min. elk.
- Spoelende dia 5x in PBS-T bij kamertemperatuur gedurende 5 min. elk op rondschudapparaat op lage snelheid.
6. Opsporing
- Incubeer dia in blokkerende buffer (2% geit of paardenserum, 2 mg / ml BSA in PBS-T) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op rondschudapparaat op lage snelheid.
- Verdun anti-DIG-AP Fab-fragmenten in het blokkeren van buffer bij 1:100. Voeg 100 ul per sectie weefsel en bedek met HybriSlips gesneden net groot genoeg om de sectie te dekken.
- Incubeer antilichaam in een vochtige kamer bij 4 ° C gedurende de nacht (ongeveer 16 uur).
- Was de dia's in PBS-T 7x, gedurende 5 minuten elk op orbitale schudder bij lage snelheid.
- Was de dia's in AP-buffer (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 3x, gedurende 5 minuten elk.
- Voeg NBT / BCIP oplossing voor AP-buffer (200 μl/10 ml buffer)
- Voeg 400-500 ml verdund NBT / BCIP oplossing voor elke dia volledig te bedekken alle coupes. Ontwikkelen in een donkere, niveau, Humidified kamer voor 4-5 uur.
7. Montage Slides
- Dehydrateer secties in toenemende concentraties ethanol (25%, 50%, 75%, 100%) gedurende 5 minuten elk.
- Incubeer in xyleen 5x om secties wissen.
- Mount schuift Permount montage medium en 's nachts droog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gebieden van een weefselsectie die uitdrogen tijdens de hybridisaties, incubaties en wasstappen algemeen uiteindelijk donkerder kleuring tijdens de NBT / BCIP ontwikkeling. Figuur 1 toont een gedeelte van een nier doorsnede, waarbij de HybriSlip afgegleden van de rand van het weefsel, waardoor het gedeeltelijk uitgedroogd. Ondanks rehydratie en dekking in de resterende stappen, het signaal in de gedehydrateerde deel is kunstmatig hoog.
Het belang van het controleren van het tijdstip van NBT-BCIP ontwikkeling aangetoond in figuren 2A en 2B. Perioden ontwikkeling van langer dan 4-5 uur resultaat in uitgesproken niet-specifieke kleur ontwikkeling in scrambled-miR controle gesondeerd weefsels in de nier (Figuur 2A). Nieren gesondeerd voor hoge overvloed doelen, zoals het U6 kleine nucleaire RNA controle, geen betere signalen vertonen met incubaties langer dan 4-5 uur (Fig Ure 2B).
De toepasbaarheid van de ISH methode hier beschreven miRNA detectie in nierweefsel wordt aangetoond in figuur 3, een cijfer gereproduceerd van Kriegel et al.. 18 In deze studie vonden we dat unilaterale ureterobstructie (UUO) induceerde een bijna 3-voudige toename van qPCR gedetecteerd miR-382 expressie in gehomogeniseerd nierweefsel in vergelijking met sham geopereerde dieren. Deze toename werd geblokkeerd door intraveneuze leveren anti-miR-382 (gegevens niet getoond). Het gebruik van ISH op deze nierweefsels aangegeven dat de miR-382-detectie die door deze sonde was gevoelig genoeg om meetbare resultaten die qPCR gebaseerde expressie analyse gespiegeld bieden. Daarnaast ISH konden we duidelijke regionale verschillen in miRNA expressie in de nier te meten.
600px "/>
Figuur 1. Het effect van de gedeeltelijke dehydratatie van een rat nier sectie tijdens hybridisatie stap. Calibration bar = 100 mm. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Optimalisatie van de duur van NBT / BCIP ontwikkeling. Waardoor de NBT / BCIP ontwikkeling duurt dan 4-5 uur resulteert in significante achtergrondkleuring in gecodeerde-miR gesondeerd weefsels (Figuur 2A), terwijl geen verdere verbetering het signaal in de positieve controle, U6 kleine nucleaire RNA gesondeerd monsters (Figuur 2B). Klik hier om te bekijkenAfbeelding vergroten.
Figuur 3. Vertegenwoordiger beelden van miR-382 expressie in muis niersecties verkregen door in situ hybridisatie. Calibration bar = 50 micrometer. (B) miR-382 expressie als percentage gemiddelde IOD van sham + anti-scrambled behandelde muizen. Dit cijfer is aangepast Kriegel et al.., (Figuur 5), waarin de details van de behandelingsgroepen, beschreven methoden en resultaten 18. Anti-gecodeerde behandelde n = 10/groep, anti-miR-382 n = 8/groep; * significant verschillend van anti-gecodeerde behandelde muizen met zelfde operatie (p <0,05), # significant verschillend van schijngeopereerde dieren die hetzelfde anti -miR behandeling. Klik hiervoor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van dit artikel was om een protocol voor miRNA in situ hybridisatie die goed werkt in formaline gefixeerde nierweefsel beschrijven. Tijdens het werken uit dit protocol een aantal belangrijke bronnen van kleuring artefact zijn geïdentificeerd. Zorgvuldige aandacht voor deze punten kan helpen voorkomen vlekken artefact en de kans op een succesvolle ISH run.
Een van de meest vermijdbare oorzaken van vlekken artefact kan optreden wanneer weefselsecties worden gedroogd tijdens lange incubaties. Wanneer dit gebeurt het gedeelte van het weefsel dat wordt gedroogd zal zeer donker vlekken tijdens het NBT / BCIP ontwikkeling (figuur 1). Gedurende dit protocol is het belangrijk dat het weefsel secties volledig gedekt blijven door een vloeistof in alle incubatie en dat de dia's worden volledig niveau gehouden. Bovendien moet het weefsel secties volledig gedekt blijven door HybriSlips tijdens lange incubatie zoals hybridisatie stappen en het antilichaam incubatie, om te voorkomen dat vloeistof verlies. Bij gedeeltelijke of volledige droging van een weefselsectie is waargenomen is het onwaarschijnlijk dat de monsters optimale kleuring, die niet zal toestaan miRNA expressie worden uitgelegd in die monsters verkregen.
Andere stappen in het protocol waar vloeistof dekking is van essentieel belang zijn tijdens de proteinase K spijsvertering en paraformaldehyde behandeling. Deze vertering is nodig om toegang van het miRNA sonde toe in de cellen. Indien de dekking van het weefsel onvolledig tijdens deze korte incubatie wordt de gebieden die niet zijn blootgesteld aan de enzymdigestie niet toe zoveel probe te voeren en te binden, en zal uiteindelijk niet zo donker als andere andere gebieden van het weefsel vlekken. Bij de toepassing van dit protocol om andere weefseltypes, moet de duur van proteinase K digestie worden geoptimaliseerd. De daaropvolgende paraformaldehyde fixatie is ook essentieel om het verlies van miRNAs volgende permeabilisatie voorkomen.
nt '> De duur van NBT / BCIP ontwikkeling is een belangrijke variabele te controleren. We vonden dat NBT / BCIP incubaties langer dan 4 of 5 uur significante achtergrond artefact begint te ontwikkelen in de weefsels gesondeerd met de gecodeerde-miR controleprobes ( Figuur 2A). Vier uur NBT / BCIP ontwikkeling voldoende voor de detectie probe doelen in relatief grote overvloed, zoals U6 kleine RNA positieve controle (Figuur 2B). Langere incubaties lijken niet te zorgen voor extra lage expressie worden opgespoord, in plaats van deze kan simpelweg resulteert in een verhoogde achtergrond artefact.Dit leidt tot de belangrijke kwestie van de aantoonbaarheid van lagere uitgedrukt miRNAs. Hoewel we de 5 'digoxigenine geconjugeerd sondes om ons te voorzien van voldoende gevoeligheid voor onze toepassingen in de nieren hebben gevonden. De alkalische fosfatase gebaseerd kleur ontwikkeling zorgt voor meerdere signaal deeltjes te meten voor each molecuul sonde, maar sommige lage niveau miRNA wellicht nog steeds niet detecteerbaar. Exiqon had miRNA probes die gelabeld zijn op zowel de 5 'en 3' uiteinden waardoor de mogelijkheden voor dubbel colorimetrische ontwikkeling per microRNA molecuul ontwikkeld. Hoewel ons laboratorium niet deze probes getest, heeft het gebruik ervan in nierweefsel met een vergelijkbaar protocol gerapporteerd 8.
Deze fundamentele protocol kan voor andere soorten weefsel en miRNA sondes worden aangepast door het optimaliseren van proteinase K spijsvertering tijd, miRNA probeconcentraties, hybridisatie temperaturen, en NBT / BCIP ontwikkeling tijden. Het is ook mogelijk om het eerste deel van het protocol in combinatie met fluorescerende antilichamen in weefsels waar autofluorescentie is passend laag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er is niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de US National Institutes of Health verleent HL082798 en HL111580.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
- Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
- Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
- Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
- Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
- Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
- Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
- Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
- Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
- Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
- Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
- Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
- Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
- Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).
