Summary
Cet article décrit un protocole d'hybridation in situ optimisé pour la détection colorimétrique de l'expression de micro-ARN dans des sections de rein fixés au formol.
Abstract
Dans cet article, on décrit un procédé de détection colorimétrique de miARN dans le rein par hybridation in situ avec de la digoxigénine marqué dans les sondes de microARN. Ce protocole, développé à l'origine par Kloosterman et ses collègues pour une large utilisation de sondes Exiqon miRNA 1, a été modifié pour surmonter les difficultés inhérentes à l'analyse des miRNA dans les tissus rénaux. Il s'agit notamment des questions telles que l'identification de la structure et difficile à retirer la sonde résiduelle et anticorps. L'utilisation de relativement mince, 5 mm d'épaisseur, les coupes de tissus autorisés pour une visualisation claire des structures du rein, alors qu'un signal de la sonde solide a été maintenu dans les cellules. En outre, la concentration de la sonde et des conditions d'incubation ont été optimisés pour faciliter la visualisation de l'expression de microARN avec faible bruit de fond et le signal non spécifique. Ici, le protocole optimisé est décrit, couvrant la collecte de tissu initial et de la préparation à travers le montage de lames à la fin de la procédure. Le compone de basents de ce protocole peuvent être modifiés pour l'application à d'autres tissus et des modèles de culture cellulaire.
Introduction
MicroARN sont de petite taille (environ 22 nucléotides de long) non codantes des ARN qui sont produites de façon endogène. Ils fonctionnent généralement à supprimer l'expression de la protéine par la répression de translation ou la dégradation de l'ARNm. miARN se lient à des cibles ARNm avec complémentarité incomplète, ce qui permet à un seul miARN pour supprimer plusieurs cibles.
Comprendre les types et les structures cellulaires expriment miARN est une partie importante de la compréhension des mécanismes par lesquels des modifications dans miRNA influence d'expression cellulaire et des phénotypes de tissus. Bien que les méthodes telles que le séquençage miRNA, qPCR et Northern blot peuvent être utilisés pour la détection de miARN dans les tissus entiers, cette approche ne permet pas de déterminer quel type de cellule spécifique ils sont venus dans un tissu donné. Dissection de composants cellulaires et structurelles avant l'analyse à l'aide de ces méthodes peut être très difficile et les conditions nécessaires à la réalisation des isolations appropriées peut conduire à alterations dans l'expression génique ou de la dégradation d'ARN. microRNA hybridation in situ est une méthode utilisée pour visualiser l'emplacement de micro-ARN et des niveaux d'expression dans les tissus. Cette technique est particulièrement utile dans les tissus constitués de structures hétérogènes, tels que le rein.
Les microARN ont été montré à jouer un rôle de régulation dans 2,3 de développement du rein et de la physiologie 4. modifications d'expression de microARN ont également été montré pour être impliqué dans la pathologie rénale telles que la fibrose 5-10, la néphropathie diabétique 7, carcinome rénal 11,12, et l'insuffisance rénale aiguë 13. Dans notre recherche, nous avons constaté que l'optimisation de microARN hybridation in situ pour les tissus rénaux en était précieux pour déterminer les emplacements exacts structurelles d'expression des miARN dans la santé et la maladie 14. Détermination de l'expression tubulaire et cellulaire de différentes microARN est important parce que leur réglementation de targets peuvent dépendre de fonctions cellulaires. Dans les états pathologiques, il est également important de déterminer comment altérations de l'expression des miARN peuvent avoir des répercussions sur la fonction.
Le but de la méthode décrite ici était de construire des méthodologies ISH existants élaborés par Kloosterman et al. 15, d'autres enquêteurs 16,17, et ceux suggérés par Exiqon 1 et d'optimiser la méthode pour les tissus rénaux fixes au formol. Nous avons utilisé cette méthode avec succès pour identifier les différences régionales dans les microARN miR rénale expression-382 avec obstruction urétérale unilatérale 18. Cette approche peut être utilisée avec d'autres tissus, avec une optimisation supplémentaire.
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Protocol
Une. coupes de tissus rénaux
- Fixés au formol (10%) des sections de rein paraffine sont coupés sur des lames de microscope à 5 mm d'épaisseur en utilisant un Microm HM 355 S. Les lames peuvent être stockées pendant plusieurs mois avant l'analyse.
2. Préparation de la solution
- Préparer 1 L de PBS 1x dans le trou DDH 2 O dans une bouteille avec vis autoclavable. Remplir une autre bouteille de 1 L de ddH 2 O. Ajouter 1 ml de DEPC à chaque bouteille, couvercle et agiter vigoureusement. Que les solutions reposer toute la nuit à température ambiante pour détruire RNAses puis autoclave. Ajouter 400 ml de Tween-20 à 1 L de PBS 1x à faire du PBS-T.
- Préparer le tampon de la protéinase K (50 mMTris-HCl, pH 8,0 et 1 mM de CaCl2 dans de l'eau traitée au DEPC).
- Préparer une solution de 0,2% de glycine dans du PBS-T.
3. Préparation des tissus
- Préparer un grand volume de tampon d'hybridation (de 50 à 100 ml), composée de 50% de formamide, 5x SSC, 0,1% de Tween, 9,2mM d'acide citrique pour ajuster le pH à 6, 50 pg / ml d'héparine, et 500 pg / ml d'ARN de levure dans DEPC traitées ddH 2 O. Diviser en aliquotes de 1 ml et conserver à -80 ° C.
- Retirez la paraffine du tissu par lavage 3x dans le xylène frais pendant 5 minutes chacun.
- Réhydrater les coupes de tissu par incubation 5 min dans des concentrations décroissantes d'éthanol (100%, 75%, 50% et 25%) dans le trou DDH 2 O.
- Traiter les diapositives avec DEPC suffisamment pour couvrir complètement les coupes de tissu (environ 0,4 à 0,5 ml) pendant 1 min. Assurez-vous que les tissus ne se dessèchent pas.
- Rincer les lames dans DEPC traitées PBS-T deux fois pendant 5 min, recueillir le DEPC contenant des déchets pour une élimination appropriée. Tous les réactifs doivent être DEPC traitées pour éliminer RNAses partir de ce point.
- Préchauffer la protéinase K en mémoire tampon et ajouter la protéinase K à une concentration finale de 10 pg / ml. Couvrir les coupes de tissus avec une solution de protéinase K et incuber à 37 º C pendant 5 min.
- Supprimer rapidement les proteinassolution e K et ajouter 0,2% de glycine dans du PBS-T pendant 30 sec.
- Rincer les lames dans DEPC traitées PBS-T deux fois pendant 30 secondes chacun.
- Fixer sections fraîchement paraformaldéhyde 4% pendant 10 min.
4. Hybridation
- Ajouter 50 ul de tampon d'hybridation (formamide 50%, 5x SSC, 0,1% de Tween, 9,2 mM d'acide citrique pour ajuster le pH à 6, 50 pg / ml d'héparine, 500 ug / ml d'ARN de levure) par coupe de tissu et recouvrir avec de la RNase HybriSlips libres couper juste plus grande que les sections de tissu.
- Sections Prehybridize à humidité contrôlée four à hybridation pendant 2 heures à la température d'hybridation calculée pour le «sonde digoxigénine marqué 3 (habituellement l'ADN Tm de la sonde -21 ° C, (c'est à dire 54 ° C pour miR-382, la sonde ADN Tm = 75 ° C ), en utilisant des lingettes de laboratoire de tissus trempés dans 50% formamide/50% 5x SSC à garder la chambre humidifié.
- Diluer la sonde miARN, le contrôle positif (U6, petit ARN nucléaire) et de contrôle négatif (brouillésséquence) à 40 nM dans du tampon d'hybridation (75 pi de tampon est nécessaire pour la section).
- Chauffer la sonde dans le tampon d'hybridation à 65 ° C pendant 5 min.
- Retirer les lames de l'hybridation four et retirer les lamelles et le tampon d'hybridation excès de pré-hybridation.
- Ajouter 75 ul de sonde contenant un tampon par section de tissu, directement au tissu. Couvrir tissu avec HybriSlips juste assez larges pour couvrir les coupes de tissus.
- Garder le niveau de support de diapositives, de retour à l'hybridation four pour une nuit d'incubation à la température de l'étape 4.2 (environ 16 heures).
5. Rigueur de lavage
- Ajouter 200 ul de 2 x SSC, on chauffe à la température d'hybridation, un peu moins d'un bord de la lamelle pour aider à libérer la lamelle couvre-objet à partir du tissu. Retirer la lamelle en inclinant la lame.
- Laver les lames dans 200 ul de formamide à 50%, 50% SSC 2x à 3x hybridation de température pendant 30 minutes chacun.
- Rincerles lames 5x dans du PBS-T à la température ambiante pendant 5 min chacun sur agitateur orbital à vitesse réduite.
6. Détection
- Incuber lame dans du tampon de blocage (2% de sérum de chèvre ou de cheval, 2 mg / ml de BSA dans du PBS-T) pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur orbital à vitesse réduite.
- Diluer fragments anti-DIG-AP Fab dans un tampon de blocage à 1:100. Ajouter 100 ul par section de tissu et couvrir avec HybriSlips coupé juste assez grand pour couvrir la section.
- Incuber l'anticorps dans une chambre humidifiée à 4 ° C pendant une nuit (environ 16 heures).
- Laver les lames dans du PBS-T 7x, pendant 5 min chacun sur agitateur orbital à vitesse réduite.
- Laver les lames dans du tampon AP (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% Tween 20) 3x, pendant 5 minutes chacune.
- Ajouter la solution de NBT / BCIP de tampon AP (200 μl/10 tampon ml)
- Ajouter 400-500 ml de solution diluée NBT / BCIP à chaque diapositive pour couvrir complètement toutes les sections de tissus. Développer dans un endroit sombre, niveau, Humidified chambre pour 4-5 heures.
7. Diapositives de montage
- Déshydrater sections dans des concentrations croissantes d'éthanol (25%, 50%, 75%, 100%) pendant 5 min chacun.
- Incuber dans 5x xylène afin de dégager sections.
- Mont glisse dans Permount milieu de montage et sécher pendant la nuit.
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Representative Results
Les zones d'une section de tissu qui se dessécher pendant les hybridations, des incubations ou étapes de lavage généralement finissent par coloration plus sombre lors de l'élaboration du NBT / BCIP. Figure 1 montre une partie d'une section de rein, dans lequel le HybriSlip glissé hors du bord d' le tissu, lui permettant de devenir partiellement déshydraté. Malgré la réhydratation et la couverture dans les étapes restantes, le signal dans la partie déshydraté est artificiellement élevé.
L'importance du contrôle de la durée de développement NBT-BCIP est mise en évidence sur les figures 2A et 2B. périodes de développement de plus de 4-5 heures de suite dans le développement de la couleur non spécifique prononcée en brouillés-miR contrôle tissus sondés à travers le rein (figure 2A). Reins sondés pour cibles de grande abondance, comme le U6 petit contrôle de l'ARN nucléaire, ne présentent pas de signaux améliorés avec des incubations de plus de 4-5 heures (figure ure 2B).
L'applicabilité de la méthode de ISH décrit ici pour la détection de miARN dans le tissu rénal est démontré dans la figure 3, une figure reproduite de Kriegel et al. 18 Dans cette étude nous avons constaté que unilatérale obstruction urétérale (UUO) a induit une augmentation de près de 3 fois dans qPCR détecté l'expression de miR-382 dans le tissu rénal homogénéisé par rapport à subi une opération fictive animaux. Cette augmentation est bloquée par intraveineuse délivrer des anti-miR-382 (données non présentées). L'utilisation de l'ISH sur ces tissus rénaux a indiqué que la détection miR-382 fourni par cette sonde était suffisamment sensible pour fournir des résultats quantifiables qui reflétaient l'analyse d'expression basé sur qPCR. En outre, ISH a permis de mesurer les différences régionales distinctes dans l'expression des miARN dans le rein.
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Figure 1. L'effet de la déshydratation partielle d'une section de rein de rat lors de l'étape d'hybridation étalonnage bar = 100 mm.. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Optimisation de la durée de développement NBT / BCIP. Permettre le développement NBT / BCIP de continuer pendant plus de 4-5 des résultats hr dans significative coloration de fond dans brouillés-miR sondé tissus (figure 2A), tout en offrant plus d'amélioration le signal dans le contrôle positif, U6 petits échantillons d'ARN nucléaire sondés (figure 2B). Cliquez ici pour voiragrandir l'image.
Figure 3. Des images représentatifs d'expression de miR-382 dans des sections de rein de souris obtenus par hybridation in situ de la barre de calibrage. = 50 um. (B) l'expression de miR-382 pour cent comme moyenne IOD du trompe-l'œil + souris traitées anti-brouillés. Ce chiffre a été modifié depuis Kriegel et al., (Figure 5), qui décrit les détails de groupes de traitement, les méthodes, et les résultats 18. Anti-brouillés traité n = 10 par groupe; anti-miR-382 n = 8/groupe; * significativement différent de souris traitées anti-brouillés avec la même chirurgie (P <0,05), # significativement différent de faux exploité les animaux recevant la même lutte miR-traitement. Cliquez icipour agrandir l'image.
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Discussion
Le but de cet article est de décrire un protocole de miARN hybridation in situ qui fonctionne bien dans les tissus rénaux fixés au formol. Tout en travaillant sur ce protocole plusieurs sources importantes d'artefact coloration ont été identifiés. Une attention particulière à ces points peut aider à éviter la coloration artefact et augmenter la probabilité d'une course de ISH succès.
Une des causes les plus évitables de artefact coloration peut se produire lorsque des coupes de tissus se dessécher pendant de longues incubations. Lorsque cela se produit, la partie du tissu qui devient sèche va tache très foncée lors de la mise au point de NBT / BCIP (figure 1). Tout au long de ce protocole, il est essentiel que les coupes de tissu restent entièrement recouvertes par le liquide dans toutes les incubations et que les lames sont maintenues parfaitement de niveau. En outre, les sections de tissu doivent rester complètement couverte par HybriSlips pendant de longues incubations telles que des étapes d'hybridation et l'incubation d'anticorps, pour aider à prévenir la perte de liquide. Si un séchage partiel ou complet d'une section de tissu est observé, il est peu probable que les échantillons donneront une coloration optimale, ce qui ne permettra pas à l'expression de miARN à être interprétée dans ces échantillons.
Les autres étapes du protocole où la couverture de liquide est essentielle sont au cours de la protéinase K digestion et le traitement de paraformaldéhyde. Cette digestion est nécessaire pour permettre l'accès de la sonde miRNA dans les cellules. Si la couverture du tissu est incomplète au cours de cette courte incubation, les zones qui ne sont pas exposés à la digestion enzymatique permettra pas autant sonde d'entrer et de se lier, et en fin de compte ne tache pas que sombre que les autres comme d'autres régions du tissu. Lors de l'application de ce protocole à d'autres types de tissus, la durée de la protéinase K digestion peut-être besoin d'être optimisé. La fixation de paraformaldéhyde ultérieur est également essentielle pour prévenir la perte des miARN suivante perméabilisation.
nt "> La durée du développement NBT / BCIP est aussi une variable importante à contrôler. Nous avons constaté que les incubations NBT / de BCIP de plus de 4 ou 5 hr fond important artefact commence à se développer dans les tissus sondées avec les sondes de contrôle brouillé-miR ( Figure 2A). Quatre heures de développement NBT / BCIP est suffisante pour la détection de cibles de test exprimés en abondance relativement élevée, comme le U6 petit ARN contrôle positif (figure 2B). incubations plus longues ne semblent pas permettre l'expression plus faible niveau de être détecté, ce lieu peut simplement se traduit par une augmentation fond artefact.Cela conduit à la question importante de la détectabilité des miARN exprimés inférieurs. Bien que nous ayons trouvé la 5 'des sondes conjuguées digoxigénine pour nous fournir la sensibilité de détection suffisante pour nos applications dans les reins. Le développement de la couleur en fonction de la phosphatase alcaline permet de multiples particules de signaux qui doivent être mesurés pour each molécule de sonde, mais certains miARN faible niveau peut encore ne pas être détectables. Exiqon avait mis au point des sondes de miARN qui sont marqués sur les deux extrémités 5 'et 3' qui permet à deux fois le potentiel pour le développement colorimétrique par molécule de micro-ARN. Bien que notre laboratoire n'a pas testé ces sondes, leur utilisation dans les tissus rénaux avec un protocole similaire a été rapporté 8.
Ce protocole de base peut être adaptée à d'autres types de tissus et de sondes miRNA en optimisant la protéinase K temps de digestion, les concentrations de sonde miARN, les températures d'hybridation, et les temps de développement NBT / BCIP. Il est également possible d'utiliser la première partie du protocole en combinaison avec des anticorps fluorescents dans les tissus où autofluorescence est suffisamment bas.
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Disclosures
Il n'y a rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les US National Institutes of Health accorde HL082798 et HL111580.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
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