Summary
Dieser Artikel beschreibt ein in situ-Hybridisierungsprotokoll für die kolorimetrische Detektion der microRNA Expression in Formalin fixiert Nierenschnitten optimiert.
Abstract
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur kolorimetrischen Nachweis von miRNA in der Niere durch in-situ-Hybridisierung mit Digoxigenin markierten Sonden microRNA. Dieses Protokoll, das ursprünglich von Kloosterman und Kollegen für eine breite Verwendung mit Exiqon miRNA Sonden 1 entwickelt, wurde modifiziert, um Herausforderungen in der miRNA-Analyse im Nierengewebe zu überwinden. Dazu gehören Themen wie Identifikation und Struktur schwer zu Rest Sonde und Antikörper zu entfernen. Die Verwendung von relativ dünnen, 5 mm dick, Gewebeschnitte erlaubt für klare Visualisierung von Nieren Strukturen, während eine starke Probe-Signal wurde in den Zellen zurückgehalten. Zusätzlich wurden Sondenkonzentration und Inkubationszeit Bedingungen optimiert, um die Visualisierung von microRNA Expression mit niedrigen Hintergrund und unspezifische Signal zu erleichtern. Hier wird die optimierte Protokoll beschrieben, im Anfangsgewebeentnahme und Vorbereitung durch die Montage der Schieber am Ende des Verfahrens. Die Grund components dieses Protokoll kann für die Anwendung auf anderen Geweben und Zellkulturmodelle verändert werden.
Introduction
MicroRNA sind kleine (ca. 22 Nukleotide lange) nicht-kodierenden RNAs, die endogen produziert werden. Sie funktionieren in der Regel um die Proteinexpression durch translationale Repression oder mRNA-Abbau zu unterdrücken. miRNAs binden an mRNA Ziele mit unvollständigen Komplementarität, die es ermöglicht, eine einzelne miRNA auf mehrere Ziele zu unterdrücken.
Zu verstehen, welche Zelltypen und Strukturen auszudrücken miRNAs ist ein wichtiger Teil der das Verständnis der Mechanismen, durch die Veränderungen in der miRNA-Expression Einfluss Zell-und Gewebe Phänotypen. Während Methoden wie miRNA-Sequenzierung, qPCR und Northern Blot zur Detektion von miRNAs in ganzen Gewebe verwendet werden, ist dieser Ansatz nicht erlauben es, festzustellen, welche spezifischen Zelltyp sie innerhalb eines bestimmten Gewebes kam. Dissection von zellulären und strukturellen Komponenten vor der Analyse mit Hilfe dieser Methoden kann sehr schwierig sein, und die benötigt wird, um angemessene Bedingungen Isolierungen erreichen können, um al führenterations in der Genexpression oder den Abbau von RNAs. microRNA in-situ-Hybridisierung ist eine Methode verwendet, um Standort-und microRNA-Expressionsniveaus im Gewebe sichtbar zu machen. Diese Technik ist besonders in Geweben von heterogenen Strukturen, wie z. B. der Niere zusammen wertvoll.
MicroRNAs sind gezeigt worden, um eine regulatorische Rolle bei der Nierenentwicklung 2,3 und Physiologie 4 zu spielen. microRNA Expression Änderungen haben auch gezeigt, dass mit Nierenpathologie wie Fibrose 5-10, diabetische Nephropathie 7, Nierenkarzinom 11,12 und akutem Nierenversagen 13 einbezogen werden. In unserer Forschung haben wir festgestellt, dass die Optimierung microRNA in-situ-Hybridisierung für Nierengewebe war wertvoll für die Ermittlung der genauen Struktur Standorte der miRNA-Expression sowohl in Gesundheit und Krankheit 14. Bestimmung der Rohr und zelluläre Expression verschiedener microRNAs ist wichtig, weil die Regulierung der targets kann von zellulären Funktionen sein. In Krankheitszuständen ist es auch wichtig, um zu bestimmen, wie Veränderungen in der miRNA-Expression beeinflussen werden Funktion.
Das Ziel der hier beschriebenen Methode war, auf den bestehenden Methoden, die von ISH Kloosterman et al. 15. andere Forscher entwickelt 16,17 zu bauen, und die von Exiqon 1 vorgeschlagen und Optimierung der Methode zur Formalin fixiert Nierengewebe. Wir haben erfolgreich diese Methode verwendet, um regionale Unterschiede in der Nieren microRNA miR-382 Expression mit einseitiger Ureterobstruktion 18 zu identifizieren. Dieser Ansatz kann mit anderen Geweben als auch verwendet werden, mit zusätzlichen Optimierung.
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Protocol
1. Nierengewebeschnitten
- Formalin-fixierte (10%) und in Paraffin eingebetteten Nierenschnitte auf Objektträger mit 5 mm Dicke mit einem Microm HM 355 S. Die Folien können mehrere Monate vor der Analyse gelagert werden geschnitten.
2. Herstellung der Lösung
- Bereiten 1 l 1x PBS in ddH 2 O in einer autoklavierbar Schraubverschluss der Flasche. Füllen Sie eine Flasche mit 1 l ddH 2 O. 1 ml DEPC zu jeder Flasche, Deckel und kräftig schütteln. Lassen Sie die Lösungen sitzen über Nacht bei Raumtemperatur auf RNAsen zu zerstören und dann im Autoklaven. 400 ml Tween-20 zu 1 l 1x PBS auf PBS-T zu machen.
- Vorbereitung Proteinase K Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 1 mM CaCl 2 in DEPC-behandeltem Wasser).
- Eine Lösung aus 0,2% Glycin in PBS-T.
3. Gewebepräparation
- Vorbereitung einer großen Anzahl von Hybridisierungspuffer (50-100 ml), 50% Formamid, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2mM Zitronensäure zur Einstellung auf pH 6, 50 ug / ml Heparin und 500 ug / ml Hefe-RNA in DEPC-behandeltem ddH 2 O. Teilen Sie sich in 1 ml Aliquots und bei -80 º C.
- Entfernen Sie das Paraffin aus dem Gewebe durch Waschen 3x in frischem Xylol für jeweils 5 min.
- Rehydrierung der Gewebeschnitte von 5 min Inkubation in abnehmenden Konzentrationen von Ethanol (100%, 75%, 50% und 25%) in ddH 2 O.
- Behandeln Sie die Folien mit DEPC genug, um die Gewebeschnitte (etwa 0,4-0,5 ml) für 1 min vollständig zu bedecken. Stellen Sie sicher, Gewebe trocknen nicht aus.
- Spülen Sie die Folien in DEPC behandeltem PBS-T zweimal 5 min, das Sammeln der DEPC haltige Abfälle zur ordnungsgemäßen Entsorgung. Alle Reagenzien sollten DEPC behandelt werden, um RNAsen von diesem Zeitpunkt an zu beseitigen.
- Vorwärmen Proteinase K Puffer und fügen Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml. Bedeckung Gewebeschnitte mit Proteinase K-Lösung und Inkubation bei 37 º C für 5 min.
- Entfernen Sie schnell die proteinasE-K-Lösung und mit 0,2% Glycin in PBS-T für 30 sek.
- Rinse Folien in DEPC behandeltem PBS-T zweimal für jeweils 30 Sekunden.
- Fix Abschnitte in frisch zubereiteten 4% Paraformaldehyd für 10 min.
4. Kreuzung
- In 50 ul Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM Zitronensäure zur Einstellung auf pH 6, 50 ug / ml Heparin, 500 ug / ml Hefe-RNA) pro Gewebeschnitt und decken mit RNAse frei HybriSlips schneiden nur größer als die Gewebeschnitten.
- Prehybridize Abschnitte der Luftfeuchtigkeit gesteuert Hybridisierungsofen für 2 Stunden bei Hybridisierungstemperatur für die 3 'mit Digoxigenin markierten Sonde (in der Regel DNA Tm der Sonde bestimmt -21 ° C (dh, 54 ° C für miR-382, DNA-Sonde Tm = 75 ° C ), unter Verwendung von Gewebelabor Tücher in 50% formamide/50% 5x SSC eingeweicht, um die Kammer zu halten befeuchtet.
- Verdünnen Sie die miRNA-Sonde, positive Kontrolle (U6, small nuclear RNA) und Negativkontrolle (RühreiSequenz) bis 40 nm in Hybridisierungspuffer (75 ul Puffer pro Sektion erforderlich).
- Erwärmen die Sonde in Hybridisierungspuffer bei 65 º C für 5 min.
- Objektträger aus der Hybridisierungsofen und Deckgläser und überschüssige Hybridisierungspuffer entfernen Prähybridisierung.
- In 75 ul der Sonde, die Puffer pro Gewebeschnitt, direkt auf Gewebe. Decken Gewebe mit HybriSlips gerade groß genug, um die Gewebeschnitte zu decken.
- Keeping Diahalter Ebene zurück zu Hybridisierungsofen für Inkubation über Nacht bei einer Temperatur von Schritt 4.2 (ca. 16 h).
5. Die Stringenz Wash
- In 200 ul 2x SSC, erhitzt, um die Hybridisierungstemperatur, knapp eine Kante der Deckgläser zu helfen, das Deckglas aus dem Gewebe. Entfernen Sie das Deckglas durch Kippen der Folie.
- Waschen der Objektträger in 200 ul 50% Formamid, 50% 2 × SSC bei Hybridisierungstemperatur 3x je 30 min.
- Spülendie Schieber 5x in PBS-T bei Raumtemperatur für jeweils 5 min auf Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit.
6. Entdeckung
- Inkubieren Folie in Blockierungspuffer (2% Ziegen-oder Pferdeserum, 2 mg / ml BSA in PBS-T) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit.
- Verdünnter Anti-DIG-AP Fab-Fragmenten in Blockierungspuffer bei 1:100. 100 l pro Gewebeschnitt und decken mit HybriSlips schneiden gerade groß genug, um den Abschnitt zu decken.
- Inkubieren-Antikörper in einer befeuchteten Kammer bei 4 ° C über Nacht (ca. 16 h).
- In PBS-T 7x Waschen der Objektträger für 5 Minuten auf jeder Orbitalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit.
- Waschen der Objektträger in AP-Puffer (100 mM TrisHCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 3x für jeweils 5 min.
- In NBT / BCIP Lösung AP-Puffer (200 ml μl/10 Puffer)
- In 400 bis 500 ml verdünnt NBT / BCIP-Lösung zu jeder Folie, um alle Gewebeschnitte vollständig zu bedecken. Entwickeln Sie in einem dunklen, Niveau, humidified Kammer für 4-5 Std.
7. Montageschienen
- Dehydratisieren Abschnitte in steigenden Konzentrationen von Ethanol (25%, 50%, 75%, 100%) für jeweils 5 min.
- Inkubation in Xylol 5x, um Abschnitte zu löschen.
- Berg rutscht in Permount Montagemedium und über Nacht trocknen.
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Representative Results
Die Bereiche von einem Gewebeschnitt, die während der Hybridisierungen, Inkubationen getrocknet werden oder Waschschritte der Regel am Ende dunkler Färbung während der NBT / BCIP Entwicklung. Abbildung 1 zeigt einen Teil einer Niere Abschnitt, in dem die HybriSlip rutschte der Kante das Gewebe, so dass sie teilweise dehydriert. Trotz Rehydrierung und Abdeckung in den verbleibenden Schritten wird das Signal in dem entwässerten Teil künstlich hoch.
Die Bedeutung der Steuerung der Zeit des NBT-BCIP-Entwicklung ist in den 2A und 2B gezeigt. Entwicklungszeiten von mehr als 4-5 Stunden ergeben ausgesprochen unspezifischen Farbentwicklung in verschlüsselten miR-Steuer sondiert Gewebe im gesamten Niere (2A). Nieren für Hochfluss-Ziele, wie zB die U6 small nuclear RNA-Kontrolle untersucht, nicht verbesserten Signale nicht aufweisen Inkubationen mit mehr als 4-5 Stunden (Abb. Abbildung 2B).
Die Anwendbarkeit des hier um miRNA-Nachweis in Nierengewebe beschrieben ISH-Verfahren wird in Abbildung 3 gezeigt, von Kriegel reproduziert eine Figur et al. 18. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass einseitige Ureterobstruktion (UUO) induziert eine fast 3-fachen Anstieg der qPCR erkannt miR-382 Expression in homogenisierten Nierengewebe im Vergleich zu scheinoperierten Tieren. Dieser Anstieg wurde durch intravenöse blockiert liefern von Anti-miR-382 (Daten nicht gezeigt). Die Verwendung von ISH auf diesen Nierengewebe zeigten, dass die miR-382 Erkennung durch diese Sonde vorgesehen war empfindlich genug, um quantifizierbare Ergebnisse, die qPCR-basierte Expressionsanalyse gespiegelt werden. Darüber hinaus erlaubt es uns, ISH deutliche regionale Unterschiede in der miRNA-Expression in der Niere messen.
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Abbildung 1. Die Wirkung des teilweisen Wasserentzug aus einer Rattenniere Abschnitt während Hybridisierungsschritt. Kalibrierung bar = 100 mm. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
2. Optimierung der Dauer der NBT / BCIP-Entwicklung. Zulassen der NBT / BCIP-Entwicklung für mehr als 4-5 h zu signifikanten Hintergrundfärbung in verwürfelten-miR weiterhin sondiert Gewebe (2A) bedeutet, ohne weitere Verbesserung das Signal in der Positivkontrolle, U6 small nuclear RNA-Proben untersucht (Abbildung 2B). Klicken Sie hier zur Ansichtgrößeres Bild.
3. Repräsentative Bilder von miR-382-Expression in Mausnierenschnitten durch in-situ-Hybridisierung erhalten. Kalibrierungsbalken = 50 um. (B) miR-382 Expression als Prozent durchschnittliche IOD Schein + Anti-Rührei behandelten Mäusen. Diese Zahl hat sich von Kriegel et al geändert. (Abbildung 5), die die Details des Behandlungsgruppen, Methoden beschreibt, und führt 18. Anti-verschlüsselten behandelt n = 10/Gruppe, Anti-miR-382 n = 8/Gruppe; * signifikant verschieden von anti-verschlüsselten behandelten Mäusen mit gleichen Operation (P <0,05) # signifikant verschieden von scheinoperierten Tieren, die die gleichen Anti miR-Behandlung. Klicken Sie hierfür eine größere Ansicht.
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Discussion
Das Ziel dieses Artikels war es, ein Protokoll für die miRNA-in-situ-Hybridisierung, die gut funktioniert in Formalin fixiert Nierengewebe zu beschreiben. Während der Erarbeitung dieses Protokoll mehrere wichtige Quellen der Färbung Artefakt identifiziert worden. Besondere Aufmerksamkeit auf diese Punkte können zur Vermeidung Färbung Artefakt und erhöhen die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen ISH Sicht.
Eines der am meisten vermeidbaren Ursachen der Färbung Artefakt kann auftreten, wenn Gewebeschnitte werden während der langen Inkubationen getrocknet. Wenn dies der Fall der Teil des Gewebes, das getrocknet wird sehr dunkel in der NBT / BCIP-Entwicklung (Fig. 1) zu färben. In diesem Protokoll ist es wichtig, dass die Gewebeschnitte bleiben vollständig von Flüssigkeit in allen Inkubationen und die Folien sind vollständig bedeckt gehalten. Zusätzlich werden die Gewebeschnitte sollte vollständig von HybriSlips bei langen Inkubationszeiten wie Hybridisierungsschritte bedeckt bleiben und die Antikörper-Inkubation, um zu verhindern, Flüssigkeitsverlust. Wenn eine teilweise oder vollständige Trocknung eines Gewebeschnitts wird beobachtet, ist es unwahrscheinlich, daß die Proben eine optimale Färbung, die nicht zulassen, miRNA-Expression in diesen Proben interpretiert werden erhalten.
Andere Schritte in dem Protokoll in dem Flüssigkeitsabdeckung ist wichtig während der Abbau durch Proteinase K-Behandlung und Paraformaldehyd. Dies ist notwendig, um die Verdauung Zugriff der miRNA-Sonde in die Zellen zu ermöglichen. Wenn die Bedeckung der Gewebe unvollständig während dieser kurzen Inkubation werden die Bereiche, die nicht an das Enzym Verdauung ausgesetzt sind nicht erlaubt, so viel Sonde zu betreten und zu binden, und wird letztlich nicht so dunkel wie die anderen in anderen Bereichen der Gewebe zu färben. Bei der Anwendung dieses Protokoll auf andere Gewebetypen kann die Dauer der Proteinase K-Verdau optimiert werden müssen. Die anschließende Fixierung Para ist auch wichtig, um den Verlust von miRNAs verhindern folgenden Permeabilisierung.
nt "> ist auch die Dauer der NBT / BCIP Entwicklung eine wichtige Variable zu kontrollieren. Wir fanden, dass NBT / BCIP Inkubationen von mehr als 4 oder 5 Stunden signifikante Hintergrund Artefakt beginnt, in den mit den verschlüsselten miR-Kontrollsonden (sondiert Gewebe zu entwickeln 2A). Vier Stunden NBT / BCIP Entwicklung ist ausreichend für den Nachweis von Sonde Ziele in relativ hoher Häufigkeit, ausgedrückt, wie der U6 kleinen RNA-positive Kontrolle (Abbildung 2B). Längere Inkubationen scheinen nicht für zusätzliche geringe Expression zu ermöglichen festgestellt werden, sondern kann dies einfach zu erhöhten Hintergrund Artefakt.Dies führt zu der wichtigen Frage der Nachweisbarkeit der unteren ausgedrückt miRNAs. Obwohl wir das 5'-Digoxigenin konjugierten Sonden, um uns mit genügend Nachweisempfindlichkeit für unsere Anwendungen in der Niere stellen gefunden. Die alkalische Phosphatase-basierte Farbentwicklung ermöglicht mehrere Signal-Partikel für eac gemessen werdenh Molekül-Sonde, aber einige geringe miRNA immer noch nicht nachweisbar sein. Exiqons hatte miRNA Sonden, die sowohl am 5'-und 3'-Enden markiert sind, unter Berücksichtigung der möglichen zweimal für die kolorimetrische Entwicklung MikroRNA pro Molekül entwickelt. Während unserem Labor wurde nicht geprüft, diese Sonden, hat ihren Einsatz in Nierengewebe mit einem ähnlichen Protokoll berichtet worden 8.
Das Basisprotokoll kann auf andere Gewebetypen und miRNA Sonden durch Optimierung Proteinase K Verdauungszeit angepasst werden, miRNA-Sonde Konzentrationen Hybridisierungstemperaturen und NBT / BCIP Entwicklungszeiten. Es ist auch möglich, den ersten Teil des Protokolls in Kombination mit fluoreszierenden Antikörpern in Gewebe, wo Autofluoreszenz ist entsprechend niedriger zu verwenden.
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Disclosures
Es gibt nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom US-amerikanischen National Institutes of Health und gewährt HL082798 HL111580.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
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