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Biology

MicroRNA Published: November 30, 2013 doi: 10.3791/50785
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

Summary

यह लेख formalin तय गुर्दे वर्गों में microRNA अभिव्यक्ति की colormetric का पता लगाने के लिए अनुकूलित एक में सीटू संकरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.

Abstract

इस लेख में हम microRNA जांच में चिह्नित digoxigenin साथ स्वस्थानी संकरण में के माध्यम से गुर्दे में miRNA के वर्णमिति का पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णन. मूल रूप से Kloosterman और Exiqon miRNA जांच 1 के साथ व्यापक इस्तेमाल के लिए उनके सहयोगियों द्वारा विकसित इस प्रोटोकॉल, गुर्दे के ऊतकों में miRNA विश्लेषण में निहित चुनौतियों पर काबू पाने के लिए संशोधित किया गया है. ये ऐसी संरचना की पहचान और अवशिष्ट जांच और एंटीबॉडी को दूर करने के लिए कड़ी के रूप में मुद्दों में शामिल हैं. अपेक्षाकृत पतली का प्रयोग, 5 मिमी मोटी, एक मजबूत जांच संकेत कोशिकाओं में बनाए रखा गया था, जबकि गुर्दे की संरचनाओं का स्पष्ट दृश्य के लिए अनुमति दी ऊतक वर्गों. इसके अतिरिक्त, जांच एकाग्रता और ऊष्मायन शर्तों कम पृष्ठभूमि और अविशिष्ट संकेत के साथ microRNA अभिव्यक्ति के दृश्य की सुविधा के लिए अनुकूलित थे. इधर, अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रक्रिया के अंत में स्लाइड्स के बढ़ते के माध्यम से प्रारंभिक ऊतक संग्रह और तैयारी को कवर, वर्णित है. बुनियादी घटकइस प्रोटोकॉल का एनटीएस अन्य ऊतकों और सेल संस्कृति मॉडल के लिए आवेदन के लिए बदला जा सकता है.

Introduction

MicroRNA endogenously उत्पादित कर रहे हैं कि RNAs noncoding (लगभग 22 nucleotides लंबे) छोटे हैं. वे आम तौर पर translational दमन या mRNA गिरावट के माध्यम से प्रोटीन अभिव्यक्ति को दबाने के लिए कार्य करते हैं. अधूरा पूरकता के साथ mRNA लक्ष्य को miRNAs बाँध, यह संभव है एक एकल miRNA कई लक्ष्यों को दबाने के लिए कर रही है.

सेल प्रकार और संरचनाओं miRNAs व्यक्त जो समझ तंत्र को समझने का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, जिसके माध्यम से miRNA अभिव्यक्ति प्रभाव सेल और ऊतक phenotypes में परिवर्तन. ऐसे miRNA अनुक्रमण, qPCR और उत्तरी सोख्ता जैसे तरीकों पूरे ऊतकों में miRNAs का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस दृष्टिकोण है कि वे एक दिया ऊतक के भीतर से आया है जो विशिष्ट सेल प्रकार निर्धारित करने की अनुमति नहीं है. इन तरीकों का उपयोग कर विश्लेषण करने से पहले सेलुलर और संरचनात्मक घटकों के विच्छेदन बहुत मुश्किल हो सकता है और पर्याप्त isolations प्राप्त करने के लिए आवश्यक शर्तों अल करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैंजीन अभिव्यक्ति या RNAs के गिरावट में terations. स्वस्थानी संकरण में microRNA ऊतकों में microRNA स्थान और अभिव्यक्ति के स्तर कल्पना करने की विधि है. इस तकनीक को गुर्दे के रूप में विषम संरचनाओं से बना ऊतकों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.

MicroRNAs गुर्दा विकास 2,3 और फिजियोलॉजी 4 में एक नियामक भूमिका निभा दिखाया गया है. microRNA अभिव्यक्ति परिवर्तन भी ऐसे फाइब्रोसिस 5-10, मधुमेह अपवृक्कता 7, गुर्दे कार्सिनोमा 11,12, और तीव्र गुर्दे की चोट के रूप में 13 वृक्क विकृति के साथ शामिल होने के लिए दिखाया गया है. हमारे शोध में, हम गुर्दे के ऊतकों के लिए स्वस्थानी संकरण में microRNA के अनुकूलन स्वास्थ्य और रोग 14 दोनों में miRNA अभिव्यक्ति की सटीक संरचनात्मक स्थानों का निर्धारण करने के लिए मूल्यवान था कि मिल गया है. विभिन्न microRNAs के ट्यूबलर और सेलुलर अभिव्यक्ति का निर्धारण महत्वपूर्ण है क्योंकि प्रादेशिक सेना की उनके विनियमनrgets सेलुलर कार्यों पर निर्भर हो सकता है. रोगग्रस्त राज्यों में यह miRNA अभिव्यक्ति में परिवर्तन समारोह को प्रभावित किया जा सकता है कि कैसे निर्धारित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है.

यहाँ वर्णित विधि का लक्ष्य Kloosterman एट अल. 15, अन्य जांचकर्ताओं 16,17 द्वारा विकसित की मौजूदा ISH के तरीके पर निर्माण करने के लिए था, और उन Exiqon 1 ने सुझाव दिया है और formalin तय गुर्दे के ऊतकों के लिए विधि का अनुकूलन. हम सफलतापूर्वक एकतरफा ureteral बाधा 18 से गुर्दे microRNA मीर 382 अभिव्यक्ति में अलग क्षेत्रीय मतभेद की पहचान करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है. इस दृष्टिकोण के अतिरिक्त अनुकूलन के साथ, साथ ही अन्य ऊतकों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

1. गुर्दे ऊतक वर्गों

  1. Formalin-तय (10%) आयल एम्बेडेड गुर्दे वर्गों स्लाइड विश्लेषण से पहले कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है एक MICROM एचएम 355 एस का उपयोग कर 5 मिमी मोटाई में माइक्रोस्कोप स्लाइड्स पर काट रहे हैं.

2. समाधान तैयार

  1. एक autoclavable पेंच शीर्ष बोतल में DDH 2 हे में 1x पीबीएस के 1 एल तैयार करें. DDH 2 ओ के 1 एल के साथ एक और बोतल भरें प्रत्येक बोतल, कवर करने के लिए DEPC के 1 मिलीलीटर जोड़ें और सख्ती से हिला. समाधान RNases को नष्ट करने और फिर आटोक्लेव के लिए कमरे के तापमान पर रातोंरात बैठते हैं. पीबीएस टी बनाने के लिए 400 मिलीलीटर बीच 20 1x पीबीएस के एल 1 में जोड़ें.
  2. Proteinase कश्मीर बफर (50 mMTris-एचसीएल, 8.0 पीएच और DEPC में 1 मिमी 2 CaCl पानी का इलाज) तैयार करें.
  3. पीबीएस आयकर में 0.2% ग्लाइसिन का एक समाधान तैयार करें.

3. ऊतक तैयारी

  1. संकरण बफर की एक बड़ी मात्रा 50% Formamide की रचना (50-100 मिलीग्राम), 5x एसएससी, 0.1% बीच, 9.2 की तैयारीपीएच 6, 50 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन, और DEPC में 500 माइक्रोग्राम / एमएल खमीर शाही सेना को समायोजन के लिए मिमी साइट्रिक एसिड DDH 2 ओ इलाज सी. º -80 में 1 मिलीलीटर aliquots और दुकान में फूट डालो
  2. 5 मिनट प्रत्येक के लिए ताजा xylene में 3x धोने से ऊतक से आयल निकालें.
  3. DDH 2 ओ में इथेनॉल की सांद्रता (100%, 75%, 50%, और 25%) कम करने में 5 मिनट incubations से ऊतक वर्गों rehydrate
  4. पूरी तरह से 1 मिनट के लिए ऊतक वर्गों (लगभग 0.4-0.5 मिलीग्राम) को कवर करने के लिए पर्याप्त DEPC साथ स्लाइड समझो. सुनिश्चित करें कि ऊतकों बाहर सूखी नहीं है.
  5. DEPC में स्लाइड्स उचित निपटान के लिए DEPC युक्त कचरे का संग्रह, 5 मिनट के लिए दो बार पीबीएस आयकर इलाज कुल्ला. सभी अभिकर्मकों DEPC इस बात से RNases को खत्म करने के लिए इलाज किया जाना चाहिए.
  6. Prewarm proteinase कश्मीर बफर और 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता proteinase कश्मीर जोड़ें. Proteinase कश्मीर समाधान के साथ ऊतक वर्गों कवर और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  7. जल्दी proteinas हटानेई कश्मीर समाधान और 30 सेकंड के लिए पीबीएस आयकर में 0.2% ग्लाइसिन जोड़ें.
  8. DEPC में कुल्ला स्लाइड्स 30 सेकंड प्रत्येक के लिए दो बार पीबीएस आयकर का इलाज किया.
  9. 10 मिनट के लिए ताजा बना 4% paraformaldehyde में वर्गों को ठीक करें.

4. संकरण

  1. संकरण बफर के 50 μl (50% Formamide, 5x एसएससी, 0.1% बीच, पीएच 6, 50 माइक्रोग्राम / एमएल हेपरिन, 500 माइक्रोग्राम / एमएल खमीर शाही सेना को समायोजन के लिए 9.2 मिमी साइट्रिक एसिड) ऊतक अनुभाग प्रति जोड़ें और RNase मुक्त HybriSlips के साथ कवर ऊतक वर्गों की तुलना में सिर्फ बड़े काटा.
  2. 3 'digoxigenin लेबल जांच (जांच की आमतौर पर डीएनए TM के लिए निर्धारित संकरण के तापमान पर 2 घंटे के लिए नमी नियंत्रित संकरण ओवन में Prehybridize वर्गों -21 डिग्री सेल्सियस, मीर 382 के लिए (यानी 54 डिग्री सेल्सियस, डीएनए tm = 75 डिग्री सेल्सियस जांच ), चैम्बर रखने के लिए 50% formamide/50% 5x एसएससी में भिगो ऊतक प्रयोगशाला पोंछे का उपयोग humidified.
  3. MiRNA जांच, सकारात्मक नियंत्रण (U6, छोटे परमाणु आरएनए) और नकारात्मक नियंत्रण (तले पतलासंकरण बफर में 40 एनएम के लिए अनुक्रम) (बफर के 75 μl) अनुभाग प्रति की जरूरत है.
  4. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर संकरण बफर में जांच गरम करें.
  5. संकरण ओवन से स्लाइड्स निकालें और prehybridization से coverslips और अतिरिक्त संकरण बफर हटा दें.
  6. सीधे ऊतकों को, ऊतक अनुभाग प्रति जांच युक्त बफर के 75 μl जोड़ें. ऊतक वर्गों को कवर करने के लिए अभी काफी बड़े HybriSlips साथ ऊतक कवर.
  7. स्लाइड धारक स्तर रखते हुए, 4.2 कदम (लगभग 16 घंटा) से तापमान पर रातोंरात ऊष्मायन के लिए संकरण ओवन में लौटने.

5. तंगी धो

  1. ऊतक से coverslip रिहाई में मदद करने के लिए सिर्फ coverslips के एक किनारे के तहत, संकरण तापमान पर गरम 200 μl 2x एसएससी, जोड़ें. स्लाइड झुकने से coverslip निकालें.
  2. 30 मिनट प्रत्येक के लिए संकरण तापमान 3x में 50% formamide, 50% 2x एसएससी के 200 μl में स्लाइड्स धो लें.
  3. कुल्लास्लाइड कम गति पर कक्षीय हिलनेवाला पर 5 मिनट प्रत्येक के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस आयकर में 5x.

6. खोज

  1. कम स्पीड पर कक्षीय हिलनेवाला पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए बफर (2% बकरी या घोड़े सीरम, 2 मिलीग्राम / एमएल पीबीएस आयकर में बीएसए) को रोकने में स्लाइड सेते हैं.
  2. 1:100 पर अवरुद्ध बफर में विरोधी डीआईजी एपी फैब टुकड़े पतला. ऊतक अनुभाग प्रति 100 μl जोड़ें और HybriSlips साथ कवर अनुभाग को कवर करने के लिए अभी काफी बड़ी कटौती.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात (लगभग 16 घंटे) में एक humidified कक्ष में एंटीबॉडी सेते हैं.
  4. कम गति पर कक्षीय हिलनेवाला पर 5 मिनट प्रत्येक के लिए, पीबीएस आयकर 7x में स्लाइड्स धो लें.
  5. 5 मिनट प्रत्येक के लिए, 3x (100 मिमी TrisHCl पीएच 9.5, 50 मिमी 2 MgCl, 100mm NaCl, 0.1% के बीच 20) एपी बफर में स्लाइड्स धो लें.
  6. एपी बफर करने के लिए एनबीटी / BCIP समाधान जोड़ें (200 μl/10 मिलीलीटर बफर)
  7. पूरी तरह से सभी ऊतक वर्गों को कवर करने के लिए प्रत्येक स्लाइड के लिए पतला एनबीटी / BCIP समाधान की 400-500 मिलीलीटर जोड़ें. एक काले, स्तर, humidif में विकसित4-5 घंटे के लिए आईईडी चैंबर.

7. बढ़ते स्लाइड्स

  1. 5 मिनट प्रत्येक के लिए इथेनॉल की सांद्रता (25%, 50%, 75%, 100%) बढ़ाने में वर्गों निर्जलीकरण.
  2. वर्गों को खाली करने के क्रम में xylene 5x में सेते हैं.
  3. माउंट Permount बढ़ते मध्यम और सूखी रातोंरात में स्लाइड.

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Representative Results

hybridizations, incubations दौरान बाहर सूखे या एनबीटी / BCIP विकास के दौरान और अधिक अंधेरे में धुंधला अंत तक आम तौर पर कदम धो हो जाते हैं कि एक ऊतक अनुभाग के क्षेत्रों. 1 HybriSlip के किनारे से दूर फिसल गया जिसमें एक गुर्दा खंड के एक हिस्से का पता चलता है यह आंशिक रूप से निर्जलित बनने के लिए अनुमति ऊतक,. बचे हुए चरणों में पुनर्जलीकरण और कवरेज के बावजूद, निर्जलित हिस्से में संकेत कृत्रिम रूप से उच्च है.

एनबीटी-BCIP विकास के समय को नियंत्रित करने के महत्व आंकड़े 2A और 2 बी में प्रदर्शन किया है. गुर्दा (2A चित्रा) के दौरान तले मीर नियंत्रण जांच ऊतकों में सुनाया अविशिष्ट रंग विकास में 4-5 घंटा परिणाम से अधिक समय के विकास की अवधि. ऐसे U6 छोटे परमाणु शाही सेना नियंत्रण के रूप में उच्च बहुतायत लक्ष्य, जांच के लिए गुर्दे, (4-5 घंटे से अधिक समय तक incubations के साथ बेहतर संकेतों का प्रदर्शन नहीं करते अंजीर ure 2 बी).

गुर्दे ऊतक में miRNA का पता लगाने के लिए यहां वर्णित ISH पद्धति के प्रयोग चित्रा 3 में प्रदर्शन किया है, एक आंकड़ा एट अल Kriegel से reproduced. कि अध्ययन में 18 हम एकतरफा ureteral बाधा (UUO) qPCR में एक लगभग 3 गुना वृद्धि प्रेरित पाया कि नकली संचालित पशुओं की तुलना में जब homogenized गुर्दे ऊतक में मीर 382 अभिव्यक्ति का पता चला. यह वृद्धि विरोधी मीर 382 (नहीं दिखाया डेटा) के उद्धार नसों द्वारा अवरुद्ध किया गया था. इन गुर्दा ऊतकों पर ISH का उपयोग इस जांच द्वारा प्रदान मीर 382 का पता लगाने qPCR आधारित अभिव्यक्ति विश्लेषण नजर आता है कि quantifiable परिणाम प्रदान करने के लिए काफी संवेदनशील था कि संकेत दिया. इसके अतिरिक्त, ISH हमें गुर्दे के भीतर miRNA अभिव्यक्ति में अलग क्षेत्रीय अंतर को मापने के लिए अनुमति दी.

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चित्रा 1. संकरण कदम के दौरान एक चूहे गुर्दे खंड के आंशिक निर्जलीकरण का प्रभाव. = 100 मिमी कैलिब्रेशन बार. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
में आगे कोई सुधार प्रदान करते हुए एनबीटी / BCIP विकास की अवधि के चित्रा 2. अनुकूलन. एनबीटी / BCIP विकास तले मीर में महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि धुंधला में अधिक से अधिक 4-5 घंटा परिणामों के लिए जारी रख सकें, ऊतकों (2A चित्रा) की जांच सकारात्मक नियंत्रण में संकेत, U6 छोटे परमाणु शाही सेना जांच के नमूने (चित्रा 2 बी). देखने के लिए यहां क्लिक करेंबड़ी छवि.

चित्रा 3
चित्रा 3. स्वस्थानी संकरण में से प्राप्त माउस गुर्दे वर्गों में मीर 382 अभिव्यक्ति की छवियों प्रतिनिधि. कैलिब्रेशन बार = 50 माइक्रोन. (बी) के नकली + विरोधी तले इलाज चूहों का प्रतिशत औसत IOD रूप मीर 382 अभिव्यक्ति. यह आंकड़ा Kriegel एट अल से संशोधित किया गया है., उपचार समूहों, विधियों का विवरण का वर्णन करता है, और 18 जो परिणाम (चित्रा 5),. इलाज एंटी तले एन = 10/group; विरोधी मीर 382 एन = 8/group, एक ही सर्जरी (पी <0.05) के साथ विरोधी तले इलाज चूहों से * काफी अलग, दिखावा संचालित जानवरों से # काफी अलग ही विरोधी प्राप्त मीर उपचार. यहां क्लिक करेंबड़ी छवि को देखने के लिए.

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Discussion

इस अनुच्छेद के लक्ष्य formalin तय गुर्दे के ऊतकों में अच्छी तरह से काम करता है कि सीटू संकरण में miRNA के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए किया गया था. इस प्रोटोकॉल बाहर काम करते हुए धुंधला विरूपण साक्ष्य के कई महत्वपूर्ण स्रोतों की पहचान की गई है. इन बातों के लिए सावधान ध्यान धुंधला विरूपण साक्ष्य से बचने में मदद मिलेगी और एक सफल ISH रन की संभावना को बढ़ा सकते हैं.

बन ऊतक वर्गों लंबे incubations दौरान बाहर सूख जब धुंधला विरूपण साक्ष्य के सबसे परिहार्य कारणों में से एक हो सकता है. यह तब होता है जब सूखे हो जाता है कि ऊतक के भाग एनबीटी / BCIP विकास (चित्रा 1) के दौरान बहुत अंधेरे में दाग होगा. इस प्रोटोकॉल के दौरान यह ऊतक वर्गों पूरी तरह से सभी incubations भर में और स्लाइड पूरी तरह से स्तर रखा जाता है कि तरल द्वारा कवर रहना महत्वपूर्ण है. इसके अतिरिक्त, ऊतक वर्गों पूरी तरह से इस तरह के संकरण कदम के रूप में लंबे समय तक incubations दौरान HybriSlips द्वारा कवर और रहना चाहिए तरल नुकसान को रोकने में मदद करने के लिए एंटीबॉडी ऊष्मायन,. एक ऊतक अनुभाग के आंशिक या पूर्ण सुखाने मनाया जाता है तो यह नमूने miRNA अभिव्यक्ति उन नमूनों में व्याख्या की जा करने की अनुमति नहीं देंगे जो इष्टतम धुंधला हो जाना, निकलेगा कि संभावना नहीं है.

तरल कवरेज आवश्यक है जहां प्रोटोकॉल में अन्य चरणों proteinase कश्मीर पाचन और paraformaldehyde उपचार के दौरान कर रहे हैं. यह पाचन कोशिकाओं में miRNA जांच के उपयोग की अनुमति की जरूरत है. ऊतक का कवरेज इस छोटे ऊष्मायन के दौरान अधूरा है, तो एंजाइम पाचन को उजागर नहीं कर रहे हैं क्षेत्रों में प्रवेश और बाध्य करने के लिए के रूप में ज्यादा जांच की अनुमति नहीं होगी, और अंततः के रूप में अंधेरे के रूप में अन्य ऊतकों के अन्य क्षेत्रों के रूप में दाग नहीं होगा. अन्य प्रकार के ऊतकों को इस प्रोटोकॉल लागू करने, proteinase कश्मीर पाचन की अवधि अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है. बाद में paraformaldehyde निर्धारण permeabilization निम्नलिखित miRNAs की हानि को रोकने के लिए भी आवश्यक है.

NT "> एनबीटी / BCIP विकास की अवधि को भी नियंत्रित करने के लिए एक महत्वपूर्ण चर रहा है. हम 4 या 5 घंटे से अधिक समय की एनबीटी / BCIP incubations महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि विरूपण साक्ष्य तले मीर नियंत्रण जांच (साथ जांच के ऊतकों में विकसित करने के लिए शुरू होता है कि पाया एनबीटी / BCIP विकास की 2A चित्रा). चार घंटे ऐसे U6 छोटे आरएनए सकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 2 बी) के रूप में अपेक्षाकृत उच्च बहुतायत में व्यक्त की जांच के लक्ष्य का पता लगाने के लिए पर्याप्त है. अब incubations अतिरिक्त निम्न स्तर अभिव्यक्ति करने के लिए अनुमति देने के लिए प्रकट नहीं होते इस बस वृद्धि की पृष्ठभूमि विरूपण साक्ष्य में परिणाम हो सकता है बल्कि, पता लगाया जा.

यह कम व्यक्त miRNAs की detectability की महत्वपूर्ण मुद्दे की ओर जाता है. हम गुर्दे में हमारे अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता का पता लगाने के साथ हमें प्रदान करने के लिए 5 'digoxigenin संयुग्मित जांच में पाया गया है, हालांकि. alkaline फॉस्फेट आधारित रंग विकास ईएसी के लिए मापा जा करने के लिए कई संकेत कणों के लिए अनुमति देता हैजांच के घंटे अणु, हालांकि कुछ कम स्तर miRNA अभी भी पता लगाने योग्य नहीं हो सकता है. Exiqon microRNA अणु प्रति दो बार वर्णमिति विकास के लिए क्षमता के लिए अनुमति समाप्त होता है 5 'और 3' दोनों पर चिह्नित कर रहे हैं कि miRNA जांच विकसित की थी. हमारी प्रयोगशाला इन जांच परीक्षण नहीं किया गया है, एक ऐसी ही प्रोटोकॉल के साथ गुर्दे के ऊतकों में उनके उपयोग 8 सूचित किया गया है.

यह बुनियादी प्रोटोकॉल proteinase कश्मीर पाचन समय अनुकूलन द्वारा अन्य प्रकार के ऊतक और miRNA जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, miRNA जांच सांद्रता, संकरण तापमान, और एनबीटी / BCIP विकास टाइम्स. यह autofluorescence उचित कम है जहां ऊतकों में फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ संयोजन में प्रोटोकॉल के पहले भाग का उपयोग करने के लिए भी संभव है.

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Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया HL082798 और HL111580 अनुदान.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde Sigma P6148
PBS Gibco 70011044
Diethyl Pyrocarbonate Sigma D5758
Tween-20 Sigma P1379
Xylenes Sigma 534056
Ethanol Ultra Pure 200CSPTP
Tris-HCl Life Technologies 15506-017
CaCl2 Sigma C2536
Glycine J.T. Baker 4059-00
Citric Acid Sigma C2404
Formamide Sigma F9037
20x SSC Buffer Life Technologies 15557-044
Heparin SAGENT 25021-400-30
Yeast RNA Life Technologies AM7118
MgCl2 Sigma M8266-1004
NaCl J.T. Baker 4058-01
Proteinase K Fermentas EO0491
3’ DIG- miRNA probe Exiqon miR dependent-05
3’ DIG- Scrambled miR probe Exiqon 99004-05
3’ DIG- U6 miR probe Exiqon 99002-05
Anti-Digoxigenin-Ab Fab Roche 11093274910
NBT/BCIP Roche 11681451001
Permount Fisher SP15-500
Coverslips Fisher Fit to tissue size
Microtom HM 355 S Thermo Scientific 23-900-672
In-slide Out Hybridization Oven Boekel 241000
Aluminum Tray Assembly Boekel C2403973
Stainless Steel Rack Insert Boekel C2403754

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References

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