Summary
Questo articolo viene descritto un protocollo in situ ottimizzato per il rilevamento colorimetrico di espressione microRNA nelle sezioni di rene fisse formalina.
Abstract
In questo articolo descriviamo un metodo di rilevazione colorimetrico del miRNA nel rene mediante ibridazione in situ con sonde digossigenina taggato microRNA. Questo protocollo, sviluppato originariamente da Kloosterman e colleghi per un uso ampio con sonde Exiqon miRNA 1, è stato modificato per superare le sfide insite nell'analisi miRNA nei tessuti renali. Si tratta di problemi quali l'identificazione struttura e difficile da rimuovere la sonda residuo e anticorpi. L'uso di relativamente sottile, spessore 5 mm, sezioni di tessuto consentiti per una chiara visualizzazione delle strutture renali, mentre un forte segnale della sonda è stato trattenuto nelle cellule. Inoltre, le condizioni di concentrazione sonda e di incubazione sono stati ottimizzati per facilitare la visualizzazione di espressione microRNA con basso background e segnale aspecifico. Qui, il protocollo ottimizzato è descritto, di captazione tessuto iniziale e preparazione attraverso il montaggio di diapositive alla fine della procedura. La compone di basenti di questo protocollo possono essere modificati per applicazione ad altri tessuti e modelli di coltura cellulare.
Introduction
MicroRNA sono piccoli (lunghi circa 22 nucleotidi) RNA non codificanti che vengono prodotti in modo endogeno. In genere funzionano per sopprimere l'espressione della proteina attraverso la repressione traslazionale o degradazione mRNA. miRNA si legano agli obiettivi mRNA con la complementarità incompleta, rendendo possibile per un singolo miRNA per sopprimere bersagli multipli.
Capire quali tipi e strutture cellulari esprimono miRNA è una parte importante di comprendere i meccanismi attraverso i quali alterazioni di espressione miRNA influenza delle cellule e dei tessuti fenotipi. Mentre i metodi quali miRNA sequenziamento, qPCR e Northern blotting possono essere usate per il rilevamento dei miRNA nei tessuti interi, questo approccio non permette di determinare il tipo specifico di cellule venivano dall'interno di un dato tessuto. Dissezione di componenti cellulari e strutturali prima dell'analisi con questi metodi può essere molto difficile e le condizioni necessarie per raggiungere isolamenti adeguati può portare ad alterations nell'espressione genica o la degradazione di RNA. microRNA ibridazione in situ è un metodo utilizzato per visualizzare la posizione microRNA e livelli di espressione nei tessuti. Questa tecnica è particolarmente utile in tessuti composti di strutture eterogenee, come il rene.
I microRNA hanno dimostrato di svolgere un ruolo di regolamentazione in 2,3 sviluppo del rene e la fisiologia 4. alterazioni di espressione microRNA hanno anche dimostrato di essere coinvolti con patologie renali come la fibrosi 5-10, nefropatia diabetica 7, carcinoma renale 11,12, e danno renale acuto 13. Nella nostra ricerca, abbiamo scoperto che l'ottimizzazione microRNA ibridazione in situ per i tessuti renali è stata preziosa per determinare le esatte posizioni strutturali di espressione miRNA sia in salute e malattia 14. Determinazione dell'espressione tubolare e cellulare di diversi microRNA è importante perché la loro regolazione di targets possono dipendere funzioni cellulari. Negli stati malati è importante anche per determinare in che modo le alterazioni dell'espressione dei miRNA possono essere funzione incidono.
L'obiettivo del metodo qui descritto è stato quello di sviluppare metodologie ISH esistenti predisposti da Kloosterman et al. 15, altri ricercatori 16,17, e quelle suggerite dalla Exiqon 1 e ottimizzare il metodo di formalina tessuti renali fissi. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per identificare le diverse differenze regionali nella renale espressione di microRNA miR-382 con unilaterale ostruzione ureterale 18. Questo approccio può essere utilizzato con altri tessuti e, con ulteriore ottimizzazione.
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Protocol
1. Renali tessuto Sezioni
- Fissato in formalina (10%) sezioni di rene in paraffina sono tagliati su vetrini da microscopio a 5 mm di spessore con un Microm HM 355 S. Le slide possono essere conservati per diversi mesi prima analisi.
2. Soluzione Preparazione
- Preparare 1 L di 1x PBS in DDH 2 O in una bottiglia con tappo a vite autoclavabile. Riempire un'altra bottiglia con 1 L di DDH 2 O. Aggiungere 1 ml di DEPC per ogni bottiglia, coperchio e agitare vigorosamente. Lasciate le soluzioni siedono notte a temperatura ambiente per distruggere RNasi e poi in autoclave. Aggiungere 400 ml di Tween-20-1 L di 1x PBS per rendere PBS-T.
- Preparare proteinasi K tampone (50 mMTris-HCl, pH 8,0 e 1 mM CaCl 2 in DEPC acqua trattata).
- Preparare una soluzione di 0,2% glicina in PBS-T.
3. Tissue Preparazione
- Preparare un grande volume di tampone di ibridazione (50-100 ml) composta dal 50% formammide, 5x SSC, 0,1% Tween, 9.2acido citrico mM per aggiustamento del pH a 6, 50 ug / ml di eparina, e 500 mg / ml di RNA di lievito in DEPC trattati DDH 2 O. Dividere in 1 ml aliquote e conservare a -80 ° C.
- Rimuovere la paraffina dal tessuto mediante lavaggio 3x in xilene fresco per 5 minuti ciascuna.
- Reidratare le sezioni di tessuto per 5 min incubazioni in concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 75%, 50% e 25%) in DDH 2 O.
- Trattare i vetrini con DEPC sufficiente a coprire completamente le sezioni di tessuto (circa 0,4-0,5 ml) per 1 min. Rendere sicuri i tessuti non si asciugano.
- Sciacquare i vetrini in DEPC trattati PBS-T due volte per 5 min, la raccolta dei rifiuti DEPC contenente per il corretto smaltimento. Tutti i reagenti devono essere DEPC trattati per eliminare RNasi da questo punto in poi.
- Preriscaldare proteinasi K tampone e inserirlo proteinasi K a una concentrazione finale di 10 pg / ml. Coprire sezioni di tessuto con una soluzione di proteinasi K e incubare a 37 ° C per 5 min.
- Rimuovere rapidamente i proteinassoluzione e K e aggiungere 0,2% glicina in PBS-T per 30 sec.
- Sciacquare i vetrini in DEPC trattati PBS-T due volte per 30 secondi ciascuna.
- Fissare sezioni appena fatto paraformaldeide 4% per 10 min.
4. Ibridazione
- Aggiungere 50 ml di tampone di ibridazione (formammide 50%, 5x SSC, 0,1% Tween, acido citrico 9,2 mm per l'aggiustamento a pH 6, 50 mg / ml di eparina, 500 mg / ml di RNA di lievito) per sezione di tessuto e coprire con RNAsi HybriSlips gratis tagliare appena più grandi delle sezioni di tessuto.
- Sezioni Prehybridize a umidità controllata ibridazione forno per 2 ore a temperatura di ibridazione determinato per la 3 'della sonda marcata con digossigenina (solitamente Tm DNA della sonda -21 ° C (cioè 54 ° C per miR-382, sonda di DNA Tm = 75 ° C ), utilizzando salviette di laboratorio tessuti imbevuti nel 50% formamide/50% 5x SSC per mantenere la camera umidificata.
- Diluire la sonda di miRNA, controllo positivo (U6, piccolo RNA nucleare) e il controllo negativo (strapazzatesequenza) a 40 nM in tampone di ibridazione (75 microlitri di tampone è necessaria per sezione).
- Riscaldare la sonda nel tampone di ibridazione a 65 ° C per 5 min.
- Togliere i vetrini dalla ibridazione forno e rimuovere coprioggetto e tampone di ibridazione in eccesso da prehybridization.
- Aggiungere 75 ml di sonda contenente tampone per sezione di tessuto, direttamente al tessuto. Coprire con tessuto HybriSlips appena sufficiente a coprire le sezioni di tessuto.
- Mantenere il livello di supporto di diapositive, tornare a ibridazione forno per notte di incubazione a temperatura dal punto 4.2 (circa 16 ore).
5. Stringenza Wash
- Aggiungere 200 microlitri 2x SSC, riscaldato alla temperatura di ibridazione, poco meno di un bordo del coprioggetto per favorire il rilascio coprioggetto dal tessuto. Rimuovere il vetrino inclinando il vetrino.
- Lavare i vetrini in 200 ml di 50% formammide, 50% 2x SSC a ibridazione 3x temperatura per 30 minuti ciascuno.
- Sciacquarei vetrini 5x in PBS-T a temperatura ambiente per 5 min ciascuno su agitatore orbitale a bassa velocità.
6. Rivelazione
- Incubare il vetrino in tampone di bloccaggio (2% capra o siero di cavallo, 2 mg / ml di BSA in PBS-T) per 1 ora a temperatura ambiente su agitatore orbitale a bassa velocità camera.
- Diluire frammenti anti-DIG-AP Fab in tampone di bloccaggio a 1:100. Aggiungere 100 microlitri per ogni sezione di tessuto e coprire con HybriSlips tagliato appena sufficiente a coprire la sezione.
- Incubare anticorpo in una camera umidificata a 4 ° C per una notte (circa 16 ore).
- Lavare i vetrini in PBS-T 7x, per 5 min ciascuno su agitatore orbitale a bassa velocità.
- Lavare i vetrini in tampone AP (100 mM TrisHCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 3x, per 5 minuti ciascuno.
- Aggiungere la soluzione NBT / BCIP al buffer di AP (200 μl/10 tampone ml)
- Aggiungere 400-500 ml di soluzione diluita di NBT / BCIP per ogni diapositiva a coprire completamente tutte le sezioni di tessuto. Sviluppare in un buio, livello, HumidifCamera IED per 4-5 ore.
7. Slides di montaggio
- Disidratare sezioni in concentrazioni crescenti di etanolo (25%, 50%, 75%, 100%) per 5 min ciascuno.
- Incubare a 5x xilene per chiarire sezioni.
- Monte scorre in mezzo di montaggio Permount e pernottamento a secco.
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Representative Results
Le aree di una sezione di tessuto che diventano asciugato durante le ibridazioni, incubazioni o lavare gradini generalmente finiscono colorazione più scura durante lo sviluppo NBT / BCIP. Figura 1 mostra una porzione di una sezione in cui il rene HybriSlip scivolato del bordo il tessuto, consentendole di diventare parzialmente disidratato. Nonostante reidratazione e la copertura nei passaggi rimanenti, il segnale nella porzione disidratata è artificialmente elevato.
L'importanza di controllare il tempo di sviluppo NBT-BCIP è dimostrato nelle figure 2A e 2B. Periodi di sviluppo di più di 4-5 ore in seguito lo sviluppo del colore aspecifica pronunciata nel controllo strapazzate-miR tessuti sondati in tutto il (Figura 2A) renale. Reni sondato per obiettivi di alto abbondanza, come il controllo di piccoli RNA nucleari U6, non mostrano segnali di miglioramento con incubazione più lunghi di 4-5 ore (Fig ure 2B).
L'applicabilità del metodo ISH descritto qui per miRNA rilevamento nel tessuto renale è mostrato nella figura 3, una figura riprodotta da Kriegel et al. 18 In questo studio abbiamo riscontrato che unilaterale ostruzione ureterale (UUO) ha indotto una quasi 3 volte della qPCR rilevato espressione di miR-382 in tessuto renale omogeneizzato rispetto a sham operati animali. Tale incremento è stato bloccato da consegnare per via endovenosa di anti-miR-382 (dati non riportati). L'uso di ISH su questi tessuti renali indicato che il rilevamento miR-382 fornito da questa sonda era abbastanza sensibile per fornire risultati quantificabili che riflettevano analisi di espressione basato qPCR. Inoltre, ISH ci ha permesso di misurare distinte differenze regionali nella miRNA all'interno del rene.
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Figura 1. L'effetto della disidratazione parziale di una sezione di rene di ratto durante l'ibridazione. Bar Calibration = 100 mm. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Ottimizzazione della durata dello sviluppo NBT / BCIP. Consentire lo sviluppo NBT / BCIP di continuare per più di 4-5 risultati hr in background significativo colorazione in scrambled-miR sondato tessuti (Figura 2a), mentre fornisce alcuna ulteriore miglioramento il segnale nel controllo positivo, U6 piccolo RNA nucleare campioni sondati (Figura 2b). Clicca qui per vedereingrandisci.
Figura 3. Immagini rappresentative della espressione di miR-382 nelle sezioni di rene di topo ottenuti per ibridazione in situ. Bar Calibration = 50 micron. (B) espressione di miR-382 come percentuale IOD media di sham + topi trattati anti-strapazzate. Questa cifra è stata modificata da Kriegel et al., (Figura 5), che descrive i dettagli di gruppi di trattamento, metodi e risultati 18. Anti-strapazzate trattati con n = 10/group; anti-miR-382 n = 8/gruppo; * significativamente diverso da topi trattati anti-strapazzate con lo stesso intervento chirurgico (p <0.05), # significativamente diverso da fittizi operati animali ricezione della stessa lotta trattamento-miR. Clicca quiper vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un protocollo per miRNA ibridazione in situ che funziona bene nei tessuti renali fissati in formalina. Mentre si lavora su questo protocollo sono stati identificati alcuni importanti fonti di artefatti di colorazione. Una grande attenzione a questi punti può aiutare a evitare di macchiare artefatto e aumentare la probabilità di una corsa ISH successo.
Una delle cause più evitabili di artefatti di colorazione può verificarsi quando le sezioni di tessuto diventano asciugato durante le lunghe fasi di incubazione. Quando si verifica la porzione di tessuto che è asciugato si macchia molto scuro durante lo sviluppo NBT / BCIP (Figura 1). In tutto questo protocollo è fondamentale che le sezioni di tessuto rimangono completamente coperti dal liquido durante tutte le incubazioni e che i vetrini sono mantenuti perfettamente piano. Inoltre, le sezioni di tessuto devono rimanere completamente coperto da HybriSlips durante lunghi di incubazione, quali passaggi di ibridazione e l'incubazione anticorpo, per aiutare a prevenire la perdita di liquidi. Se si osserva asciugatura parziale o totale di una sezione di tessuto è improbabile che i campioni produrrà colorazione ottimale, che non consentirà miRNA debba essere interpretato in quei campioni.
Altri passi nel protocollo in cui la copertura del liquido è essenziale sono durante la proteinasi K digestione e il trattamento paraformaldeide. Questo digestione è necessaria per consentire l'accesso della sonda miRNA nelle cellule. Se la copertura del tessuto è incompleta durante questo breve periodo di incubazione, le aree che non sono esposti alla digestione enzimatica non permettono più la sonda per entrare e legare, e finiranno per non macchiare quanto oscuro come altri di altre aree del tessuto. Quando si applica questo protocollo per altri tipi di tessuto, la durata di proteinasi K digestione può avere bisogno di essere ottimizzato. La fissazione paraformaldeide successiva è anche essenziale per prevenire la perdita dei miRNA seguenti permeabilizzazione.
nt "> La durata dello sviluppo NBT / BCIP è anche una variabile importante da controllare. Abbiamo scoperto che l'incubazione NBT / BCIP di più di 4 o 5 ore di sfondo significativo artefatto comincia a svilupparsi nei tessuti sondato con le sonde di controllo strapazzate-Mir ( Figura 2A). Quattro ore di sviluppo NBT / BCIP è sufficiente per la rivelazione di bersagli sonda espressi in proporzione più abbondanti, come la U6 piccolo RNA controllo positivo (Figura 2B). incubazione più lunghi non sembrano consentire espressione ulteriore basso livello di essere rilevato, piuttosto puo 'semplicemente si traduce in background aumento artefatto.Questo porta alla importante questione della rilevabilità inferiori miRNA espressi. Anche se abbiamo trovato il 5 'sonde coniugati digoxigenin a fornire noi con sensibilità di rilevamento sufficiente per le nostre applicazioni nel rene. Lo sviluppo del colore in base fosfatasi alcalina consente a più particelle segnale da misurare per each molecola di sonda, tuttavia alcuni miRNA basso livello ancora può non essere rilevabile. Exiqon aveva sviluppato sonde miRNA che sono etichettati sia sul 5 'e 3' estremità consentendo il potenziale per due volte lo sviluppo colorimetrico per microRNA molecola. Mentre il nostro laboratorio non ha verificato queste sonde, il loro uso in tessuti renali con un protocollo simile è stato segnalato 8.
Questo protocollo di base può essere adattato ad altri tipi di tessuto e sonde miRNA ottimizzando proteinasi K tempo di digestione, concentrazioni sonda miRNA, le temperature di ibridazione, e tempi di sviluppo NBT / BCIP. È anche possibile utilizzare la prima porzione del protocollo in combinazione con anticorpi fluorescenti in tessuti dove autofluorescenza è sufficientemente basso.
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Disclosures
Non c'è nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da US National Institutes of Health concede HL082798 e HL111580.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
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