Summary
この記事では、ホルマリン固定腎臓切片にマイクロRNA発現の比色検出のために最適化されたin situハイブリダイゼーションプロトコルについて説明します。
Abstract
この記事では、マイクロRNAプローブをタグ付けされたジゴキシゲニンを用いたin situハイブリダイゼーションによって、腎臓におけるmiRNAの比色検出のための方法を説明します。もともとExiqon社miRNAプローブ1との幅広い使用にKloostermanらによって開発されたこのプロトコルは、腎臓組織におけるmiRNA解析に固有の課題を克服するように変更されました。これらには、構造同定および残留プローブおよび抗体を除去するのは難しいなどの問題があります。比較的薄いを用い、厚さ5mm、強力なプローブ信号が細胞内に保持しながら、腎臓構造の明確な可視化のために許可された組織切片。加えて、プローブ濃度およびインキュベーション条件は、低いバックグラウンドおよび非特異的シグナルを有するマイクロRNA発現の可視化を容易にするように最適化した。ここで、最適化されたプロトコルは、手順の終わりにスライドを装着を通して初期の組織収集および準備を覆って、記載されている。基本componeこのプロトコルの国税庁は、他の組織および細胞培養モデルに適用するために変更することができる。
Introduction
マイクロRNAは、内因的に産生されている非コードRNA（約22ヌクレオチド長）小さい。これらは、一般に翻訳抑制又はmRNA分解を介してタンパク質発現を抑制するように機能する。 miRNAは、それが可能な1つのmiRNAが複数のターゲットを抑制できるようにすること、不完全な相補性を有するmRNA標的に結合する。
細胞型および構造はmiRNAを表現し理解することは、miRNAの発現の変化が、細胞や組織の表現型に影響を与えるそれを通してのメカニズムを理解することの重要な部分です。そのようなmiRNAの配列決定の方法、定量PCRおよびノーザンブロッティングは、全組織におけるmiRNAの検出のために使用することができるが、このアプローチは、一つは、それらが所定の組織内から来た特定の細胞型を決定することはできません。これらの方法を用いて、分析前に細胞性および構造部品の切開は非常に困難であることができ、十分なアイソレーションを達成するために必要な条件は、文献につながる可能性がRNAの遺伝子発現または劣化terations。 in situハイブリダイゼーションは、組織中のマイクロRNAマイクロRNA位置および発現レベルを可視化するために使用される方法である。この技術は、腎臓などの異質な構造で構成組織では特に貴重である。
マイクロRNAは、腎臓発生の2,3および生理学4において調節的役割を果たしていることが示されている。マイクロRNA発現の変化はまた、線維症5月10日 、糖尿病性腎症7、腎癌11,12、および急性腎障害13などの腎病理に関与することが示されている。我々の研究では、腎臓組織のためのin situハイブリダイゼーションのマイクロRNAの最適化は、健康と病気14の両方におけるmiRNA発現の正確な構造上の位置を決定するための貴重であったことを見出した。管状の異なるマイクロRNAの細胞発現の決定は、TAのためにそれらの調節に重要であるrgetsは細胞機能に依存することができる。疾患状態では、miRNAの発現の変化が機能に影響を与えることができる方法を決定することも重要です。
ここで説明する方法の目標は、 他 Kloostermanによって開発された既存のISHの方法論に基づいて構築することでした。15、他の研究16,17、およびExiqon社1によって提案されたものと、ホルマリン固定腎臓組織のための方法を最適化します。我々が正常に片側尿管閉塞18で腎マイクロRNAのmiR-382発現における明確な地域差を識別するために、このメソッドを使用している。このアプローチは、追加の最適化、ならびに他の組織とともに使用することができる。
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Protocol
1。腎臓組織切片
- ホルマリン固定した（10％）パラフィン包埋腎臓切片をスライドは、分析の前に数ヶ月間保存することができるMicrom社HM 355 S.を用いて厚さ5mmの顕微鏡スライド上に切断される。
2。溶液の調製
- オートクレーブのスクリュートップボトルに蒸留H 2 Oに1X PBSを1 Lを用意します。のddH 2 Oを1Lで別のボトルを埋める各ボトル、カバーにDEPCの1ミリリットルを追加し、激しく振る。ソリューションは、RNA分解酵素を破壊した後、オートクレーブを室温で一晩放置します。 PBS-Tを作るために1X PBS 1Lに400ミリリットルのTween-20を追加します。
- プロテイナーゼKバッファー（50のトリス-塩酸、pHが8.0と、DEPCでの1のCaCl 2処理水）を準備します。
- PBS-Tで0.2％グリシン溶液を調製する。
3。組織標本
- 50％ホルムアミド、5×SSC、0.1％のTween、9.2からなるハイブリダイゼーション緩衝液（50 ml）を大量調製pHが6、50μg/ mlのヘパリン、およびDEPC 500μg/ mlの酵母RNAへの調整のためのクエン酸は、蒸留H 2 Oを扱うC.度-80で1ミリリットルずつ、ストアに分ける
- 5分ごとに新鮮なキシレンに3回洗浄することによって、組織からパラフィンを除去。
- のddH 2 Oに（100％、75％、50％、および25％）エタノールの濃度を減少させることで、5分間のインキュベーションによって、組織切片を再水和
- 完全に1分間、組織切片（約0.4〜0.5ミリリットル）をカバーするのに十分なDEPCでスライドを扱う。組織が乾燥しないようにしてください。
- DEPCのスライドが適切な処分のための廃棄物を含むDEPCを集め、5分間二回、PBS-Tをあしらったすすぎます。すべての試薬は、DEPCこの時点からRNA分解酵素を除去するために扱われるべきである。
- 予熱し、プロテイナーゼK緩衝液および10μg/ mlの最終濃度にプロテイナーゼKを加える。プロテイナーゼK溶液で組織切片をカバーし、5分間37℃でインキュベートする。
- 迅速proteinasを削除電子K溶液で30秒間PBS-T中の0.2％のグリシンを加える。
- DEPCでのすすぎのスライドを30秒ごとに二回、PBS-Tを治療した。
- 10分間焼きたての4％パラホルムアルデヒド中でのセクションを修正します。
4。混成
- 組織切片あたりの50のハイブリダイゼーション緩衝液（50％ホルムアミド、5×SSC、0.1％のTween、9.2 mMのpHを6に調整するためのクエン酸、50μg/ mlのヘパリン、500μg/ mlの酵母RNA）を追加し、RNA分解酵素フリーのHybriSlipsでカバー組織切片よりちょうど大きくカット。
- 3 'ジゴキシゲニン標識プローブ（プローブの通常のDNAのTmのために決定ハイブリダイゼーション温度で2時間、湿度制御、ハイブリダイゼーションオーブンでプレハイブリダイゼーション切片-21°C〜、のmiR-382のために（ すなわち 54℃で、DNAのTm = 75℃を探る）、チャンバーを維持するために50％formamide/50％5×SSCに浸したティッシュラボワイプを使用して加湿。
- miRNAプローブ、ポジティブコントロール（U6、核内低分子RNA）とネガティブコントロール（スクランブルを希釈ハイブリダイゼーション緩衝液中の40 nmの配列）（バッファの75μl）をセクションごとに必要とされる。
- 5分間65度Cで、ハイブリダイゼーション緩衝液中のプローブを加熱する。
- ハイブリダイゼーションオーブンからスライドを削除し、プレハイブリダイゼーションからカバースリップと過剰ハイブリダイゼーション緩衝液を除去します。
- 直接組織に、組織切片あたりのプローブを含有する緩衝液の75μlを加える。組織切片をカバーするのに十分な大きHybriSlipsで組織を覆う。
- スライドホルダーレベルを維持し、ステップ4.2（約16時間）の温度で一晩のインキュベーションのためのハイブリダイゼーションオーブンに戻ります。
5。ジェンシーウォッシュ
- 組織からカバースリップを解放するに役立つだけでカバースリップの1辺の下で、ハイブリダイゼーション温度に加熱し、200μlの2×SSCを追加します。スライドを傾けてカバースリップを取り除きます。
- 30分ごとにハイブリダイゼーション温度の3倍で、50％ホルムアミド、50％、2×SSC200μlのスライドを洗浄します。
- すすぎスライドは低速でオービタルシェーカー上で5分間ずつ室温でPBS-Tで5倍。
6。検出
- 低速でオービタルシェーカー上で室温で1時間、緩衝液（2％ヤギまたはウマ血清、2 mg / mlのPBS-TでBSA）でブロッキングスライドをインキュベートする。
- 1:100でブロッキング緩衝液中で、抗DIG-AP Fab断片を希釈する。組織切片当たり100μlを追加し、セクションをカバーするのに十分な大きカットHybriSlipsでカバーしています。
- 4℃で一晩（約16時間）の加湿チャンバー内で抗体をインキュベートする。
- 低速でオービタルシェーカー上で5分間ずつ、PBS-T 7Xでスライドを洗浄します。
- 5分間ずつ、AP緩衝液（100mMトリスHCl pHは9.5、50のMgCl 2、100mMのNaClを、0.1％Tween 20）で3回スライドを洗浄します。
- APバッファにNBT / BCIP溶液を追加し（200 mlの緩衝液μl/10）
- 完全にすべての組織切片をカバーするために、各スライドに希釈し、NBT / BCIP溶液を400〜500ミリリットルを追加します。暗い、レベル、humidifで発展4-5時間のためにIED室。
7。マウントスライド
- 各5分間のエタノール濃度（25％、50％、75％、100％）を増加させるのセクションを脱水する。
- のセクションをクリアするためにキシレン5Xでインキュベートする。
- マウントはパーマウント封入剤と乾燥一夜にスライドする。
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Representative Results
ハイブリダイゼーション、インキュベーション中に乾燥させたり、NBT / BCIPの開発中に、より濃く染色結局、一般の手順を洗うようになる組織切片の面積は。1 HybriSlipはのエッジの脱落した腎臓切片の一部を示していますそれは部分的に脱水になることを可能にする組織。残りの手順での再水和とカバレッジにもかかわらず、脱水部分の信号が人為的に高いです。
NBT-BCIP開発の時間を制御することの重要性は、 図2Aおよび図2Bに示されている。スクランブル-MIR制御における顕著非特異的な発色でのより長い4〜5時間の結果の開発期間は、腎臓（ 図2A）を通じて組織をプローブした。このようなU6核内低分子RNAの制御のような高存在度の目標のためにプロービング腎臓は、（4-5時間以上インキュベーションして改善されたシグナルを示さない図 URE 2B）。
腎組織におけるmiRNA検出するには、ここで説明ISH法の適用は、図はクリーゲルらから再生された、 図3に示されている。18我々は片側尿管閉塞（UUO）は定量PCRのほぼ3倍の増加を誘導することを発見した研究で偽手術動物と比較した場合、均質化された腎組織におけるmiR-382の発現を検出した。この増加は、抗のmiR-382（データは示していない）の静脈内送達によって遮断された。これらの腎臓組織に対するISHの使用は、このプローブによって提供されたmiR-382の検出は定量PCRベースの発現解析ミラー定量可能な結果を提供するのに十分な感度であることを示した。さらに、ISHは、私たちが腎臓内でのmiRNA発現における明確な地域差を測定することができました。
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図1。ハイブリダイゼーション工程中のラットの腎臓部分の部分的な脱水の効果。キャリブレーションバー= 100ミリメートル。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
にはさらなる改善を提供しない間、NBT / BCIP開発の期間を図2。最適化。NBT / BCIPの開発は、スクランブル-MIRの重要なバックグラウンド染色以上の4-5時間の結果のために継続できるようにするには、組織（ 図2A）プロービングポジティブコントロールの信号が、U6核内低分子RNAをプローブの試料（ 図2B）。 見るにはここをクリックしてください拡大表示。
図3。in situハイブリダイゼーションにより得られたマウスの腎臓切片におけるmiR-382式の代表的な画像。キャリブレーションバー=50μmである。 （B）偽手術+抗スクランブル処理されたマウスの割合の平均IODとしてのmiR-382の発現が。この図はクリーゲルらから変更されて、治療群、方法の詳細について説明し、18をもたらす（ 図5）。群10匹扱わN =抗スクランブル、抗のmiR-382、N = 8/group、同じ手術（P <0.05）との抗スクランブル処理されたマウスから*有意差は、同じ抗を受けた偽手術動物とは大きく異なる＃ -MIR治療。 こちらをクリック拡大画像を表示します。
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Discussion
この記事の目的は、ホルマリン固定腎臓の組織でうまく機能situハイブリダイゼーションにおける miRNAのためのプロトコルを記述することでした。このプロトコルを作業中に染色アーティファクトのいくつかの重要な源が特定されている。これらの点に十分注意し、染色アーティファクトを回避し、成功したISHの実行の可能性を高めることができます。
組織切片は、長いインキュベーション中に乾燥さになったときに、染色のアーティファクトの中で最も回避可能な原因の一つは、発生する可能性があります。これが発生するようになる乾燥した組織の一部は、NBT / BCIP現像（ 図1）の間に非常に濃く染色する。このプロトコルを通じて、それは、組織切片が完全にすべてのインキュベーションを通じて、スライドが完全にレベルに保たれていることを液体で覆われたままことが重要です。さらに、組織切片は完全にそのようなハイブリダイゼーション工程限り、インキュベーション中にHybriSlipsで覆われたままであるべきである液体の損失を防ぐために抗体インキュベーション、。組織切片の部分的または完全な乾燥が観察された場合には、サンプルは、miRNAの発現は、これらのサンプル中で解釈されるべきでは許可しない、最適な染色をもたらすとは考えにくい。
液体カバレッジが不可欠である、プロトコルの他のステップは、プロテイナーゼK消化とホルムアルデヒドの治療中である。この消化は、細胞にmiRNAプローブのアクセスを許可するために必要とされる。組織のカバレッジはこの短いインキュベーション中に不完全な場合、酵素消化にさらされていない領域が入り、バインドするためにできるだけ多くのプローブを許容せず、最終的になど暗くなどの他の組織の他の領域のように染色されません。他の組織タイプにこのプロトコルを適用する際に、プロテイナーゼK消化の持続時間を最適化する必要があるかもしれない。後続のパラホルムアルデヒド固定は以下の透過性miRNAの損失を防止するためにも不可欠である。
NTは "> NBT / BCIP開発の期間も制御する重要な変数である。私たちは、4または5時間より長いのNBT / BCIPのインキュベーションが重要な背景のアーチファクトがスクランブル-MIR対照プローブ（でプローブの組織で開発し始めていることがわかっ図2A）。NBT / BCIP開発の4時間は、U6、小さなRNAの陽性対照（ 図2B）のような比較的高い豊富に発現したプローブ標的の検出のために十分である。長いインキュベーションは、追加の低レベルの発現を可能にするためには表示されません検出され、むしろこれは単に増加した背景アーティファクトになることがあります。これは下に発現miRNAの検出能の重要な問題につながる。我々は、腎臓での私たちのアプリケーションのための十分な検出感度を私たちに提供するために、5 'ジゴキシゲニン結合プローブを発見したけど。アルカリフォスファターゼベースの発色がEACを測定するために、複数の信号粒子を可能にするプローブのH分子は、しかし、いくつかの低レベルのmiRNAは依然として検出できない場合があります。 Exiqon社は、マイクロRNA分子当たり二回比色発展の可能性を考慮し5 '末端および3'の両方で標識されているmiRNAプローブを開発していました。私たちの研究室は、これらのプローブをテストしていませんが、同様のプロトコルと腎組織におけるそれらの使用は8報告されています。
この基本的なプロトコルは、プロテイナーゼK消化時間、miRNAプローブ濃度、ハイブリダイゼーション温度、及びNBT / BCIP開発時間を最適化することにより、他の組織タイプおよびmiRNAプローブに適合させることができる。なお、自家蛍光が適切に低い組織における蛍光抗体と組み合わせて、プロトコルの第1の部分を使用することも可能である。
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Disclosures
開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、米国国立衛生研究所HL082798とHL111580を補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
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