Summary
Denne artikkelen beskriver en in situ hybridisering protokoll optimalisert for rimetrisk deteksjon av mikroRNA uttrykk i formalin faste nyre seksjoner.
Abstract
I denne artikkelen beskriver vi en fremgangsmåte for kolorimetrisk påvisning av miRNA i nyrene ved in situ hybridisering med merket Digoxigenin mikroRNA prober. Denne protokollen, opprinnelig utviklet av Kloosterman og kolleger for bred bruk med Exiqon miRNA sonder 1, har blitt modifisert for å overvinne utfordringene som ligger i miRNA analyse i nyre vev. Disse omfatter forhold som struktur identifisering og vanskelig å fjerne rester av probe og antistoff. Bruk av forholdsvis tynne, 5 mm tykt, vevssnitt tillatt for klar visualisering av nyrene konstruksjoner, mens en sterk probe signal ble holdt tilbake i cellene. I tillegg ble probe konsentrasjon og inkuberingsbetingelser optimaliseres for å lette visualiseringen av mikroRNA uttrykk med lav bakgrunn og ikke-spesifikk signal. Her blir optimalisert protokoll beskrevet, dekker den initielle vev innsamling og forberedelse gjennom montering av lysbilder ved slutten av prosedyren. Den grunnleggende components av denne protokollen kan bli endret for søknad til andre vev og cellekultur modeller.
Introduction
MikroRNA er liten (omtrent 22 nukleotider lang) noncoding RNAer som er endogent produsert. De vanligvis fungere å undertrykke protein uttrykk gjennom translasjonsforskning undertrykkelse eller mRNA degradering. mirnas binder seg til mRNA mål med ufullstendig komplementaritet, noe som gjør det mulig for en enkelt miRNA å undertrykke flere mål.
Forstå hvilke celletyper og strukturer uttrykke mirnas er en viktig del av å forstå mekanismene gjennom hvilke endringer i miRNA uttrykk innflytelse celle og vev fenotyper. Mens metoder som miRNA sekvensering, qPCR og Northern blotting kan benyttes for deteksjon av miRNAs i hele vev, gjør denne metoden ikke tillater en å bestemme hvilke spesifikke celletype de kom fra innenfor et gitt vev. Disseksjon av cellulære og konstruksjonsdeler før analyse ved hjelp av disse metoder kan det være svært vanskelig, og betingelsene for å oppnå tilstrekkelig isoleringer kan føre til alterations i genuttrykk eller degradering av RNA. mikroRNA in situ hybridisering er en metode som brukes for å visualisere mikroRNA plassering og uttrykk nivåer i vev. Denne teknikken er spesielt verdifullt i vev sammensatt av heterogene strukturer, slik som nyre.
MicroRNAs har vist seg å spille en regulerende rolle i nyre utvikling 2,3 og fysiologi fire. mikroRNA expression forandringer har også blitt vist å være involvert med renal patologi som fibrose 5-10, diabetisk nefropati 7, nyrekarsinom 11,12 og akutt nyre-skade 13. I vår forskning har vi funnet ut at å optimalisere mikroRNA in situ hybridisering for nyre vev var verdifull for å bestemme nøyaktig strukturelle steder av miRNA uttrykk i både helse og sykdom 14. Bestemmelse av den rørformede og cellulær ekspresjon av forskjellige microRNAs er viktig fordi deres regulering av TArgets kan være avhengig av cellulære funksjoner. I syke tilstander er det også viktig å finne ut hvordan endringer i miRNA uttrykk kan påvirke funksjonen.
Målet med metoden beskrevet her var å bygge på eksisterende ISH metoder utviklet av Kloosterman et al. 15, andre etterforskere 16,17, og de som foreslått av Exiqon en og optimalisere metoden for formalin faste nyre vev. Vi har med hell brukt denne metoden for å identifisere tydelige regionale forskjeller i nyre mikroRNA Mir-382 uttrykk med unilateral ureterobstruksjon 18. Denne tilnærmingen kan brukes sammen med andre vev også, med ytterligere optimalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Nyre vevsdelene
- Formalinfiksert (10%) parafin-embedded nyreseksjoner er kuttet på objektglass på 5 mm tykkelse ved hjelp av en Microm HM 355 S. Lysbildene kan lagres i flere måneder før analyse.
2. Løsning Forberedelse
- Forbered en L av 1x PBS i DDH 2 O i en autoklaver flaske med skrukork. Fyll en annen flaske med en L av DDH 2 O. Legg en ml DEPC til hver flaske, cover og rist kraftig. La oppløsningene sitte over natten ved romtemperatur for å ødelegge RNases og deretter autoklav. Tilsett 400 ml Tween-20 til 1 l 1 x PBS for å gjøre PBS-T.
- Forbered proteinase K-buffer (50 mMTris-HCl, pH 8,0 og 1 mM CaCl 2 i DEPC behandlet vann).
- Forbered en løsning av 0,2% glysin i PBS-T.
Tre. Vevpreparerina
- Forbered et stort volum av hybridiseringsbuffer (50-100 ml) bestående av 50% formamid, 5x SSC, 0,1% Tween, 9.2mM sitronsyre for justering av pH til 6, 50 ug / ml heparin, og 500 pg / ml gjær-RNA i DEPC behandlet DDH 2 O. Dele inn i en ml deler og oppbevar ved -80 º C.
- Fjern parafinen fra vevet ved vasking 3x i frisk xylen i 5 min hver.
- Rehydrere vevsdelene etter 5 min inkubasjoner i avtagende konsentrasjoner av etanol (100%, 75%, 50%, og 25%) i DDH 2 O.
- Unn lysbildene med nok DEPC å fullstendig dekke vevsdelene (ca. 0,4-0,5 ml) i 1 min. Pass på at vev ikke tørke ut.
- Skyll lysbilder i DEPC behandlet PBS-T to ganger for 5 min, samle DEPC holdig avfall for riktig avhending. Alle reagenser skal DEPC behandlet for å eliminere RNases fra dette punktet.
- Prewarm Proteinase K-buffer og legge proteinase K til en endelig konsentrasjon på 10 pg / ml. Dekker vevssnitt med proteinase K-løsning og inkuberes ved 37 ° C i 5 min.
- Raskt fjerne proteinase K-løsning og tilsett 0,2% glycin i PBS-T for 30 sek.
- Skyll lysbilder i DEPC behandlet PBS-T to ganger i 30 sek hver.
- Fix seksjoner i rykende fersk 4% paraformaldehyde for 10 min.
4. Hybridisering
- Tilsett 50 pl av hybridiseringsbuffer (50% formamid, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM sitronsyre for justering av pH til 6, 50 ug / ml heparin, 500 ug / ml gjær RNA) per vev-delen og dekk med RNase-frie HybriSlips kuttet bare større enn vevsdelene.
- Prehybridize seksjoner i kontrollert fuktighet hybridisering ovn i 2 timer ved hybridisering temperatur bestemt for 3 'Digoxigenin merket probe (som regel DNA Tm for probe -21 ° C, (dvs. 54 ° C i Mir-382, probe DNA Tm = 75 ° C ), ved hjelp av vev lab kluter dynket i 50% formamide/50% 5x SSC å holde kammeret fuktet.
- Fortynne miRNA sonde, positiv kontroll (U6, liten kjernefysiske RNA) og negativ kontroll (eggesekvens) til 40 nM i hybridiserings-buffer (75 pl av buffer er nødvendig per seksjon).
- Varm opp probe i hybridiserings-buffer ved 65 ° C i 5 min.
- Fjern lysbilder fra hybridisering ovnen og fjerne dekkglass og overflødig hybridiseringsbuffer fra prehybridization.
- Tilsett 75 ul av probe inneholdende buffer per vev-delen direkte til vevet. Dekk vev med HybriSlips akkurat store nok til å dekke vevsdelene.
- Holde glassholder nivå, tilbake til hybridisering ovnen for overnatting inkubasjon ved temperatur fra trinn 4.2 (ca. 16 timer).
5. Stringens Wash
- Tilsett 200 pl 2x SSC, oppvarmet til hybridiseringstemperaturen, i underkant av den ene kanten av dekkglass for å bidra til å løsne dekkglass fra vevet. Fjern dekkglass ved å vippe lysbildet.
- Vask objektglassene i 200 ul av 50% formamid, 50% 2x SSC ved hybridiseringstemperaturen 3 x i 30 min hver.
- Skyllskinnene 5 ganger i PBS-T ved romtemperatur i 5 min hver på orbital shaker på lav hastighet.
6. Detection
- Inkuber lysbilde i blokkerende buffer (2% geit eller hesteserum, 2 mg / ml BSA i PBS-T) i 1 time ved romtemperatur på orbital shaker på lav hastighet.
- Fortynne anti-DIG-AP Fab fragmenter i blokkering buffer på 1:100. Tilsett 100 pl pr vev-delen og dekk med HybriSlips snitt akkurat stor nok til å dekke den delen.
- Inkuber antistoff i et fuktet kammer ved 4 ° C over natten (ca. 16 timer).
- Vask lysbildene i PBS-T 7x, for fem minutter hver på orbital shaker ved lav hastighet.
- Vask objektglassene i AP-buffer (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100mM NaCl, 0,1% Tween 20) 3x, i 5 min hver.
- Legg NBT / BCIP løsning til AP buffer (200 μl/10 ml buffer)
- Legg 400-500 ml av fortynnet NBT / BCIP løsning til hvert lysbilde å fullstendig dekke alle vev seksjoner. Utvikle seg i en mørk, nivå, humidifIED kammer i 4-5 timer.
7. Monterings Slides
- Dehydrate seksjoner i økende konsentrasjoner av etanol (25%, 50%, 75%, 100%) i 5 minutter hver.
- Inkuber i xylen 5x for å fjerne deler.
- Mount glir i Permount montering medium og tørke over natten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Områdene av en vev-delen som blir tørket i løpet av hybridiseringer, inkubasjoner eller vask trinnene generelt ender opp farging mer mørkt i løpet av NBT / BCIP utvikling. Figur 1 viser et parti av en nyre-delen hvor HybriSlip gled av fra kanten vevet, slik at det blir delvis dehydratisert. Til tross for rehydrering og dekningen i de resterende trinnene, er signalet på det dehydrerte parti kunstig høy.
Betydningen av å kontrollere tidspunktet for NBT-BCIP utviklingen er vist i figurene 2A og 2B. Utviklings perioder lenger enn 4-5 timers resultat i uttalt uspesifikk fargeutvikling i egge-MIR kontroll autosøk vev gjennom nyrene (Figur 2A). Nyrene analysert for høy overflod mål, slik som U6 små nukleær RNA-kontroll, ikke oppviser forbedrede signaler til inkubasjoner som er lengre enn 4 til 5 timer (fig. ure 2B).
Anvendelsen av ISH metoden beskrevet her til miRNA deteksjon i nyrevevet er vist i figur 3, et tall gjengitt fra Kriegel et al. 18 I den studien fant vi at ensidig ureterobstruksjon (UUO) induserte en nesten tre ganger økning i qPCR oppdaget Mir-382 uttrykk i homogenisert nyrevevet sammenlignet med humbug opererte dyr. Denne økningen ble blokkert av intravenøs levere av anti-Mir-382 (data ikke vist). Bruken av ISH på følgende nyre vev indikerte at påvisning Mir-382 gitt av dette sonden var følsomme nok til å gi målbare resultater som speilet qPCR basert uttrykk analyse. I tillegg ISH tillatt oss å måle tydelige regionale forskjeller i miRNA uttrykk innenfor nyrene.
600px "/>
Figur 1. Effekten av den delvise dehydratisering av en rottenyre-delen under hybridiser trinn. Kalibrerings bar = 100 mm. for å vise større bilde .
Figur 2. Optimalisering av varigheten av NBT / BCIP utvikling. Tillater NBT / BCIP utviklingen fortsetter i mer enn 4-5 timers resulterer i betydelig bakgrunnsfarging i egge-Mir analysert vev (Figur 2A), samtidig som det gir ingen ytterligere forbedring i signalet i positiv kontroll, U6 små kjernefysiske RNA autosøk prøver (Figur 2b). Klikk her for å visestørre bilde.
Figur 3. Representative bilder av Mir-382 uttrykk i musenyreseksjoner oppnådd ved in situ hybridisering. Kalibrering bar = 50 mikrometer. (B) Mir-382 uttrykk som prosent gjennomsnittlig IOD av humbug + anti-egge behandlede mus. Dette tallet er modifisert fra Kriegel et al., (Fig. 5), som beskriver detaljene i behandlingsgrupper, fremgangsmåter, og fører til 18. Anti-egge behandlet n = 10/group, anti-Mir-382 n = 8/group, * signifikant forskjellig fra anti-egge behandlede mus med samme operasjon (P <0,05), # signifikant forskjellig fra sham opererte dyr som mottar den samme anti -Mir behandling. Klikk herå se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne artikkelen var å beskrive en protokoll for miRNA in situ hybridisering som fungerer godt i formalinfiksert nyre vev. Mens han jobbet ut denne protokollen flere viktige kilder til farging gjenstand har blitt identifisert. Nøye oppmerksomhet til disse punktene kan bidra til å unngå flekker artefakt og øke sannsynligheten for en vellykket ISH løp.
En av de mest unødvendige årsaker til farging artefakt kan oppstå når vevssnitt blir tørket ut under lange inkubasjoner. Når dette skjer den del av vevet som blir tørket vil farge meget mørkt i løpet av NBT / BCIP utvikling (figur 1). Gjennom denne protokollen er det avgjørende at vevsdelene forblir fullstendig dekket av væske gjennom alle inkubasjoner og at lysbildene er holdt helt i vater. I tillegg bør de vevssnitt forbli helt dekket av HybriSlips under lange inkubasjoner som hybridiserings-fremgangsmåten, og antistoff inkubering, for å bidra til å forhindre væsketap. Hvis delvis eller fullstendig tørking av en vev delen er observert er det lite sannsynlig at prøvene vil gi optimal flekker, som ikke vil tillate miRNA uttrykk som skal tolkes i disse prøvene.
Andre trinn i protokollen der flytende dekning er avgjørende er i løpet av proteinase K fordøyelsen og paraformaldehyde behandling. Denne fordøyelse er nødvendig for å tillate tilgang av miRNA sonden inn i cellene. Hvis dekningen av vevet er ufullstendig i løpet av denne korte inkubasjon, vil de områdene som ikke er utsatt for enzymet fordøyelsen ikke tillate så mye probe for å gå inn og binde, og til slutt vil ikke flekker så mørkt som andre som andre områder av vev. Ved bruk av denne protokollen til andre vevstyper, kan varigheten av proteinase K fordøyelse må optimaliseres. Den påfølgende paraformaldehyde fiksering er også viktig for å hindre tap av miRNAs følgende permeabilization.
nt "> Varigheten av NBT / BCIP utvikling er også en viktig variabel for å kontrollere. Vi fant at NBT / BCIP inkubasjoner lengre enn fire eller fem timers betydelig bakgrunn gjenstand begynner å utvikle seg i vev analysert med egge-MIR kontroll prober ( Figur 2A). Fire timer med NBT / BCIP utvikling er tilstrekkelig for påvisning av probe-mål uttrykkes i relativt høy mengde, slik som U6 liten positiv kontroll RNA (figur 2B). trenger lengre inkubasjoner ikke ut til å gi rom for ytterligere lav ekspresjon i bli detektert, i stedet for dette kan ganske enkelt resulterer i øket bakgrunnsfremmedelement.Dette fører til det viktige spørsmålet om registreringsmulighetene for lavere uttrykt miRNAs. Selv om vi har funnet fem 'Digoxigenin konjugerte sonder for å gi oss med tilstrekkelig følsomhet for våre applikasjoner i nyre. Den alkaliske fosfatase basert fargeutvikling gjør det mulig for flere signal partikler som skal måles i each molekyl av sonden, men noen lavt nivå miRNA fremdeles er ikke påvisbar. Exiqon hadde utviklet miRNA prober som er merket på både 5 'og 3' ender som åpner for muligheten for dobbelt kolorimetriske utvikling mikroRNA per molekyl. Mens vår lab ikke har testet disse sondene, har deres bruk i nyre vev med en lignende protokoll blitt rapportert åtte.
Denne grunnleggende protokollen kan tilpasses andre typer vev og miRNA prober ved å optimalisere proteinase K fordøyelse tid, miRNA probe konsentrasjoner, hybridiserings-temperaturer, og NBT / BCIP utviklingstider. Det er også mulig å benytte den første del av protokollen i kombinasjon med fluoriserende antistoffer i vev hvor autofluorescens er tilstrekkelig lav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av amerikanske National Institutes of Health gir HL082798 og HL111580.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
- Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
- Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
- Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
- Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
- Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
- Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
- Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
- Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
- Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
- Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
- Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
- Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
- Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).
