Summary
Este artigo descreve um protocolo de hibridização in situ em otimizado para detecção colorimétrica de expressão de microRNA em seções renais fixados em formalina.
Abstract
Neste artigo descrevemos um método de detecção colorimétrica de miRNA no rim através de hibridização in situ com sondas marcadas com digoxigenina microRNA. Este protocolo, desenvolvido originalmente por Kloosterman e colegas para amplo uso com sondas Exiqon miRNA 1, foi modificado para superar os desafios inerentes à análise de miRNA em tecidos renais. Estes incluem questões como a identificação da estrutura e difícil de remover sonda residual e de anticorpos. Utilização de relativamente fina, espessura de 5 mm, as secções de tecido permitido para melhor visualização das estruturas do rim, ao passo que um sinal forte de sonda foi retido nas células. Além disso, as condições de concentração de sonda e de incubação foram otimizados para facilitar a visualização da expressão do microRNA com baixa de fundo e um sinal não específico. Aqui, o protocolo optimizado é descrito, cobrindo a recolha inicial de preparação de tecidos e, através da montagem das lâminas, no final do procedimento. O compone básiconts deste protocolo pode ser alterado por aplicação de outros tecidos e modelos de cultura de células.
Introduction
MicroRNA são pequenos (cerca de 22 nucleótidos de comprimento) que não de codificação RNAs que são produzidos endogenamente. Eles geralmente funcionam para suprimir a expressão da proteína através da repressão de translação ou degradação do mRNA. miRNAs ligam a alvos de RNAm com complementaridade incompleta, tornando possível que um único miRNA para suprimir múltiplos alvos.
Entendimento que tipos e estruturas celulares expressar miRNAs é uma parte importante da compreensão dos mecanismos através dos quais alterações miRNA celular influência expressão e fenótipos de tecido. Enquanto os métodos tais como a sequenciação de miARN, qPCR e Northern blotting pode ser usado para a detecção de miRNAs em tecidos completos, esta abordagem não permitem determinar qual o tipo de célula específico que veio a partir de um determinado tecido. Dissecção de componentes celulares e estruturais antes da análise usando estes métodos pode ser muito difícil, e as condições necessárias para atingir isolamentos adequados pode levar a alterações na expressão de genes ou a degradação de ARN. microRNA hibridação in situ é um método usado para visualizar a localização microRNA e os níveis de expressão em tecidos. Esta técnica é especialmente valiosa em tecidos compostos de estruturas heterogéneas, tais como o rim.
MicroRNAs demonstraram desempenhar um papel regulador no desenvolvimento do rim 2,3 e fisiologia 4. Alterações de expressão microRNA também têm sido mostrados para ser envolvido com a patologia renal, tais como fibrose 5-10, nefropatia diabética 7, carcinoma renal, 11,12, e lesão renal aguda 13. Em nossa pesquisa, descobrimos que a otimização microRNA hibridização in situ para os tecidos renais foi valioso para determinar os locais exatos estruturais de expressão de miRNA em saúde e na doença 14. Determinação da expressão tubular e celular de diferentes microRNAs é importante porque a sua regulação de targets pode ser dependente de funções celulares. No estado de doença, é também importante para determinar como as alterações na expressão de miARN pode ser afectar a função.
O objetivo do método descrito aqui foi a de construir sobre metodologias ISH existentes desenvolvidos por 15 Kloosterman et al., Outros pesquisadores 16,17, e os sugeridos pela Exiqon 1 e otimizar o método para tecidos renais fixados em formalina. Temos utilizado com sucesso este método para identificar as diferenças regionais distintos na expressão renal microRNA miR-382 com obstrução ureteral unilateral 18. Esta abordagem pode ser utilizada com outros tecidos, bem como, com optimização adicional.
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Protocol
1. Rim Tecido Seções
- Fixadas em formalina (10%) secções de rim embebidas em parafina são cortados em lâminas de microscópio a 5 mm de espessura usando um Microm HM 355 S. As lâminas podem ser armazenadas durante vários meses, antes da análise.
2. Preparação de Solução
- Prepare 1 litro de PBS 1x em DDH 2 O em um parafuso de garrafa top autoclave. Encha uma garrafa com 1 L de DDH 2 O. Adicionar 1 ml de DEPC para cada garrafa, tampa e agitar vigorosamente. Deixe a solução assentar durante a noite à temperatura ambiente, para destruir ARNases e, em seguida, autoclave. Adicionar 400 ml de Tween-20 a 1 L de 1x PBS para fazer PBS-T.
- Preparar tampão de proteinase K (50 mMTris-HCl, pH 8,0 e 1 mM de CaCl2 em água tratada com DEPC).
- Prepara-se uma solução de 0,2% de glicina em PBS-T.
3. Preparação Tissue
- Prepara-se uma grande quantidade de tampão de hibridação (50-100 ml), composto de 50% de formamida, 5x SSC, 0,1% de Tween, 9,2mM de ácido cítrico para o ajuste de pH de 6, 50 ug / ml de heparina, e 500 ug / ml de ARN de levedura em DEPC tratados ddH 2 O. Divida em 1 ml alíquotas e armazenar a -80 º C.
- Retirar a parafina do tecido por lavagem 3x em xileno fresco, durante 5 minutos cada.
- Re-hidratar as secções de tecido por 5 min em incubações concentrações decrescentes de etanol (100%, 75%, 50% e 25%) em ddH 2 O.
- Tratar as lâminas com DEPC suficiente para cobrir completamente as secções de tecidos (cerca de 0,4-0,5 ml) durante 1 min. Fazer tecidos certeza não sequem.
- Enxaguar as lâminas em DEPC tratados PBS-T duas vezes por 5 min, recolhendo o DEPC contendo resíduos para o descarte adequado. Todos os reagentes devem ser tratados DEPC para eliminar RNAses a partir deste ponto.
- Pré-aquecer proteinase K e adicionar tampão de proteinase K para uma concentração final de 10 ug / ml. Cobrir as secções de tecido com uma solução de proteinase K e incubar a 37 º C durante 5 min.
- Remover rapidamente as proteinassolução de e K e adicionar 0,2% de glicina em PBS-T, durante 30 seg.
- Lavar as lâminas em DEPC tratados PBS-T duas vezes por 30 segundos cada.
- Fix seções acabado de fazer paraformaldeído 4% por 10 min.
4. Hibridização
- Adicionar 50 ul de tampão de hibridação (formamida a 50%, 5x SSC, 0,1% de Tween, ácido cítrico 9,2 mM, para o ajuste de pH de 6, 50 ug / ml de heparina, 500 ug / ml de ARN de levedura) por secção de tecido e cobrir com RNAse HybriSlips livres corte maior do que as secções de tecido.
- Secções Prehybridize em humidade controlada forno de hibridação durante 2 horas à temperatura de hibridização para determinar a extremidade 3 'da sonda marcada com digoxigenina (usualmente ADN Tm da sonda de -21 ° C, (isto é, 54 ° C durante o miR-382, a sonda de DNA Tm = 75 ° C ), usando lenços de laboratório tecido embebido em 50% formamide/50% 5x SSC para manter a câmara úmida.
- Diluir a sonda miRNA, controle positivo (U6, RNA nuclear pequeno) e controle negativo (mexidossequência) a 40 nM em tampão de hibridação (75 ul de tampão é necessária por secção).
- Aquece-se a sonda em tampão de hibridação a 65 º C durante 5 min.
- Retirar as lâminas do forno de hibridização e remover lamelas e tampão de hibridação excesso de pré-hibridização.
- Adicionar 75 ul de tampão sonda contendo por secção de tecido, directamente para o tecido. Cubra com tecido HybriSlips apenas grandes o suficiente para cobrir os cortes de tecido.
- Manutenção do nível de suporte de slides, voltar ao forno de hibridização para incubação durante a noite à temperatura do passo 4.2 (aproximadamente 16 horas).
5. Lavagem rigorosa
- Adicionar 200 ul de 2xSSC, aquecida à temperatura de hibridação, pouco menos de uma borda das lamelas para ajudar a libertar a lamela do tecido. Retirar as lamelas pela inclinação do slide.
- Lavar as lâminas em 200 ul de 50% de formamida, 50% 2x SSC à temperatura de hibridação 3x durante 30 minutos cada.
- Enxaguaras lâminas 5x em PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min cada, num agitador orbital de velocidade baixa.
6. Detecção
- Incubar corrediça em tampão (2% de soro de cabra ou cavalo, 2 mg / ml de BSA em PBS-T) de bloqueio, durante 1 hora à temperatura ambiente num agitador orbital de velocidade baixa.
- Dilui-se os fragmentos de anti-DIG-AP Fab em tampão de bloqueio a 1:100. Adicionar 100 l por secção de tecido e cubra com HybriSlips cortado apenas suficientemente grande para cobrir a seção.
- Incubar anticorpo numa câmara humidificada a 4 ° C durante a noite (aproximadamente 16 horas).
- Lavar as lâminas em PBS-T 7x, durante 5 min cada, num agitador orbital a uma velocidade baixa.
- Lavar as lâminas em tampão de AP (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 50 mM de MgCl 2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) 3x, durante 5 minutos cada.
- Adicionar solução de NBT / BCIP de tampão AP (200 μl/10 tampão ml)
- Adicionar 400-500 ml de solução diluída de NBT / BCIP a cada slide para cobrir completamente todas as seções do tecido. Desenvolver em um escuro, nível, humidifcâmara de IED para 4-5 horas.
7. Slides de montagem
- Desidratar secções em concentrações crescentes de etanol (25%, 50%, 75%, 100%) durante 5 minutos cada.
- Incubar em 5x xileno para limpar seções.
- Monte desliza Permount montagem médio e secar durante a noite.
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Representative Results
As áreas de uma secção de tecido que se tornam secas durante as hibridações, as incubações ou passos de lavagem geralmente acabam coloração mais escura, durante o desenvolvimento de NBT / BCIP. Figura 1 mostra uma porção de uma secção de rim em que o HybriSlip escorregou da borda o tecido, permitindo tornar-se parcialmente desidratado. Apesar de re-hidratação e de cobertura nas etapas restantes, o sinal na porção desidratado é artificialmente elevada.
A importância de controlar o tempo de desenvolvimento de NBT-BCIP é demonstrada nas Figuras 2A e 2B. Períodos de desenvolvimento de mais de 4-5 resultado hr em pronunciado desenvolvimento da cor inespecífica em mexidos-miR controle tecidos sondadas em todo o rim (Figura 2A). Rins sondado para alvos alta abundância, como o U6 pequeno controle RNA nuclear, não apresentam sinais de melhoria com incubações mais do que 4-5 horas (Fig ure 2B).
A aplicabilidade do método descrito aqui ISH para detecção miARN no tecido do rim é demonstrado na Figura 3, uma figura reproduzida de Kriegel et al. 18 Neste estudo verificou-se que a obstrução uretral unilateral (UUO) induziu um aumento de quase 3 vezes na qPCR detectada expressão de miR-382 em tecido renal homogeneizado quando comparado ao sham operado animais. Este aumento foi bloqueado por injecção intravenosa de fornecer anti-miR-382 (dados não mostrados). O uso de ISH nesses tecidos renais indicou que a detecção de miR-382 fornecida por esta sonda foi sensível o suficiente para proporcionar resultados quantificáveis que espelhados análise de expressão baseado qPCR. Além disso, ISH nos permitiu medir as diferenças regionais distintos na expressão de miRNA dentro do rim.
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Figura 1. O efeito da desidratação parcial de uma seção de rim de ratos durante a etapa de hibridização. Barra de Calibração = 100 mm. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Otimização da duração do desenvolvimento NBT / BCIP. Permitindo o desenvolvimento NBT / BCIP para continuar por mais de 4-5 resultados de RH em coloração de fundo significativa em mexidos-miR sondado tecidos (Figura 2A), ao fornecer mais nenhuma melhoria na o sinal do controlo positivo, de ARN nuclear pequeno U6 amostras sondadas (Figura 2B). clique aqui para visualizarAmpliar Imagem.
Figura 3. Imagens representativas da expressão de miR-382 em secções de rim de ratinho obtidos por hibridação in situ de barras de calibração. = 50 um. (B) a expressão de miR-382 por cento como IOD média de sham + camundongos tratados anti-mexidos. Esta figura foi modificado a partir de Kriegel et al., (Figura 5), o qual descreve os detalhes de grupos de tratamento, os métodos e os resultados de 18. Anti-mexidos tratados n = 10/grupo, anti-miR-382 n = 8/grupo, * significativamente diferente de ratinhos tratados com anti-mexidos mesma cirurgia (P <0,05), # significativamente diferente de falsos operado animais que receberam o mesmo anti miR-tratamento. Clique aquipara ver a imagem maior.
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Discussion
O objetivo deste artigo foi descrever um protocolo para miRNA hibridização in situ que funciona bem em tecidos renais formol fixos. Enquanto trabalham fora deste protocolo várias fontes importantes de artefato coloração foram identificados. Atenção especial para estes pontos podem ajudar a evitar manchas artefato e aumentar a probabilidade de uma corrida ISH bem sucedida.
Uma das causas mais evitáveis de artefato coloração pode ocorrer quando cortes de tecidos tornam-se secos durante incubações longas. Quando isto ocorre, a parte do tecido que fica seca mancha muito escura durante o desenvolvimento de NBT / BCIP (Figura 1). Ao longo deste protocolo, é fundamental que as secções de tecido permanecem completamente cobertas pelo líquido ao longo de todas as incubações, e que as lâminas são mantidos completamente nivelada. Além disso, as secções de tecido deve permanecer completamente coberto por HybriSlips durante incubações longas, tais como os passos de hibridação e a incubação do anticorpo, para ajudar a impedir a perda de líquido. Se a secagem total ou parcial de uma secção de tecido é observado, é improvável que as amostras produzirá coloração óptima, o que não irá permitir a expressão miARN para ser interpretado nas amostras.
Outros passos do protocolo em que a cobertura líquida é essencial são durante a digestão com proteinase K e tratamento de paraformaldeído. Esta digestão é necessário para permitir o acesso da sonda miARN para dentro das células. Se a cobertura de tecido é incompleta durante este curto de incubação, as áreas que não estão expostas à digestão enzimática não irá permitir que tanto a sonda entra e se ligam, e em última análise, não manchará, como escura como outros como outras áreas do tecido. Ao aplicar este protocolo para outros tipos de tecidos, a duração da proteinase K digestão pode precisar de ser otimizado. A fixação paraformaldeído posterior também é essencial para evitar a perda de miRNAs seguinte permeabilização.
nt "> A duração do desenvolvimento NBT / BCIP também é uma variável importante para o controle. Descobrimos que incubações NBT / BCIP de mais de 4 ou 5 horas significativo artefato fundo começa a desenvolver-se nos tecidos sondado com as sondas de controle mexidos-miR ( Figura 2A). Quatro horas de desenvolvimento de NBT / BCIP é suficiente para a detecção de alvos de sondagem expressos em abundância relativamente elevada, como por exemplo o pequeno U6 ARN de controlo positivo (Figura 2B). incubações mais longas não aparecem para permitir a expressão de baixo nível adicional ser detectado, e isso pode simplesmente resulta em maior fundo artefato.Isso leva à importante questão da detectabilidade de miRNAs expressos inferiores. Embora tenhamos encontrado sondas conjugadas digoxigenina 5 'para fornecer-nos com a sensibilidade de detecção suficiente para as nossas aplicações no rim. O desenvolvimento de cor com base fosfatase alcalina permite múltiplas partículas de sinais a serem medidos para each molécula de sonda, no entanto alguns baixo nível miRNA ainda não pode ser detectável. Exiqon tinham desenvolvido sondas miRNA que estão marcadas em ambas as extremidades 5 'e 3' permitindo que o potencial para o desenvolvimento colorimétrico duas vezes, por molécula de microRNA. Enquanto o nosso laboratório não testou estas sondas, o seu uso em tecidos renais com um protocolo semelhante foi relatado 8.
Este protocolo de base pode ser adaptado a outros tipos de tecidos e sondas miRNA através da optimização do tempo de digestão de proteinase K, as concentrações de sonda miARN, as temperaturas de hibridação, e o tempo de desenvolvimento de NBT / BCIP. Também é possível utilizar a primeira parte do protocolo em combinação com anticorpos fluorescentes em tecidos onde a autofluorescência é apropriadamente baixo.
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Disclosures
Não há nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health dos EUA concede HL082798 e HL111580.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
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