Summary
В этой статье описывается в протокол гибридизация оптимизированный для колориметрического обнаружения микроРНК выражения в формалине секциях фиксированных в почках.
Abstract
В этой статье мы опишем метод колориметрического обнаружения микроРНК в почках через в гибридизация с дигоксигенином отмеченных микроРНК зондов. Этот протокол, первоначально разработанная Клостермана и коллег для обширного использования с Exiqon микроРНК зондов 1, был изменен, чтобы преодолеть проблемы, присущие анализа микроРНК в тканях почек. К ним относятся такие вопросы, как определение структуры и трудно удалить остаточный зонд и антитела. Использование относительно тонкий, толщиной 5 мм, срезы ткани позволили четкой визуализации структур почек, в то время как сильный сигнал зонда был сохранен в клетках. Кроме того, концентрация зонда и условия инкубации были оптимизированы для облегчения визуализации микроРНК выражения с низким фоном и неспецифической сигнала. Здесь, оптимизированный протокол описан, охватывающий первоначальный сбор тканей и подготовку через монтажа слайдов в конце процедуры. Основная ComponeNTS этого протокола могут быть изменены для применения в других тканях и моделей клеточных культур.
Introduction
МикроРНК небольшие (длиной около 22 нуклеотидов) некодирующих РНК, которые эндогенно производится. Как правило, они функционируют для подавления экспрессии белка через репрессии трансляции или деградации мРНК. микроРНК связываются с мРНК мишеней с неполной комплементарности, что делает возможным для одного микроРНК для подавления несколько целей.
Понимание того, какие типы и структуры клеток выразить микроРНК является важной частью понимания механизмов, через которые изменения в микроРНК выражение влияния клеток, тканей фенотипов. Хотя методы, такие как микроРНК последовательности, количественной ПЦР, Нозерн блоттинг может быть использован для обнаружения микроРНК в целом тканей, этот подход не позволяет определить, какой конкретный тип клеток они пришли в данной ткани. Рассечение клеточных и структурных компонентов до анализа с использованием этих методов может быть очень трудно и условия, необходимые для достижения адекватных обособления может привести к альterations в экспрессии или деградации РНК гена. микроРНК в гибридизация является метод, используемый для визуализации местоположения микроРНК и уровни экспрессии в тканях. Этот метод особенно ценен в тканях, состоящих из разнородных структур, таких как почки.
Микро РНК, как было показано играют регуляторную роль в 2,3 развития почек и физиологии 4. экспрессии микроРНК изменения, также было показано, участвуют с почечной патологией, таких как фиброз 5-10, диабетической нефропатии 7, почечной карциномы 11,12 и острой почечной 13. В нашем исследовании, мы обнаружили, что оптимизации микроРНК в гибридизация для тканей почек было ценным для определения точных структурных местоположения выражения микроРНК как в здоровье и болезни 14. Определение трубчатого и клеточной экспрессии различных микроРНК является важным, поскольку их регулирование таrgets может зависеть от клеточных функций. В пораженных государств важно также определить, как изменения в экспрессии микроРНК могут быть функции влияет.
Цель метода, описанного здесь в том, чтобы построить на существующих методологий ISH разработанных Клоостерман др.. 15, другие исследователи 16,17, а те, предложенный Exiqon 1 и оптимизировать метод формалином тканях фиксированных в почках. Мы успешно использовали этот метод для идентификации различных региональных различий в почечной выражения микроРНК микроРНК-382 с односторонним обструкции мочеточника 18. Этот подход может быть использован с другими тканями, а также с дополнительной оптимизации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Почечной ткани Разделы
- Зафиксированные в формалине (10%) разделы почек парафин нарезают на предметных стеклах при толщине 5 мм с использованием Microm HM 355 S. Слайды можно хранить в течение нескольких месяцев анализа.
2. Подготовка решения
- Подготовить 1 л 1x PBS в DDH 2 O в автоклавируемый верхней бутылки винта. Заполните другую бутылку 1 л DDH 2 O. Добавьте 1 мл DEPC каждому бутылки, крышки и энергично встряхивают. Пусть решения на ночь при комнатной температуре, чтобы разрушить РНКазы и затем автоклав. Добавить 400 мл Tween-20 в 1 л 1х PBS, чтобы сделать PBS-T.
- Подготовка протеиназы K буфера (50 mMTris-HCl, рН 8,0 и 1 мМ CaCl 2 в DEPC-обработанной воде).
- Готовят раствор 0,2% глицина в PBS-T.
3. Тканевый препарат
- Подготовка большой объем гибридизации буфера (50-100 мл), состоящий из 50% формамида, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2мМ лимонной кислоты для корректировки рН 6, 50 мкг / мл гепарина и 500 мкг / мл дрожжевой РНК в DEPC лечение DDH 2 O. Разделить на 1 мл аликвоты и хранят при температуре -80 ° С.
- Удалить парафин из ткани путем промывки 3 раза в свежем ксилоле в течение 5 мин каждый.
- Увлажняет срезах тканей на 5 мин инкубации в уменьшении концентрации этанола (100%, 75%, 50% и 25%) в DDH 2 O.
- Лечить слайды с достаточно DEPC, чтобы полностью покрыть срезы ткани (примерно 0,4-0,5 мл) в течение 1 мин. Убедитесь ткани не высыхают.
- Промойте скользит в DEPC лечить PBS-T дважды в течение 5 мин, собирая DEPC содержащих отходов для надлежащей утилизации. Все реагенты должны быть DEPC лечение для устранения РНКаз с этого момента.
- Prewarm протеиназы К буфер и добавить протеиназы К до конечной концентрации 10 мкг / мл. Крышка срезах ткани протеиназой К раствору и инкубируют при 37 ° С в течение 5 мин.
- Быстро удалить proteinasрешение для электронной К и добавить 0,2% глицин в PBS-T в течение 30 сек.
- Промыть скользит в DEPC обрабатывали PBS-T дважды в течение 30 секунд каждый.
- Fix разделы в свежеприготовленный 4% параформальдегида в течение 10 мин.
4. Гибридизация
- Добавить 50 мкл буфера для гибридизации (50% формамид, 5x SSC, 0,1% Tween, 9,2 мМ лимонной кислоты для корректировки рН 6, 50 мкг / мл гепарина, 500 мкг / мл дрожжевой РНК) на срез ткани и покрытие с РНКазы HybriSlips сократить просто больше, чем срезах тканей.
- Prehybridize секции в контролируемой влажностью гибридизации печи в течение 2 ч при температуре гибридизации, определенной для «дигоксигенин меченым зондом 3 (обычно ДНК Tm зонда -21 ° С, (т.е. 54 ° C в течение микроРНК-382, ДНК-зонд Tm = 75 ° C ), с помощью ткани лабораторных салфетки, пропитанные 50% formamide/50% 5x SSC, чтобы держать камеру увлажняется.
- Развести зонд микроРНК, положительный контроль (U6, небольшой ядерный РНК) и отрицательный контроль (яичницупоследовательность) до 40 нМ в гибридизации буфер (75 мкл буфера необходимо в каждой секции).
- Нагреть зонда гибридизации в буфере при 65 ° С в течение 5 мин.
- Удалить слайды из гибридизации духовке и удалить покровные и избыточный буфер гибридизации с Предгибридизацию.
- Добавить 75 мкл зонда, содержащего буфера на срез ткани, непосредственно в ткани. Обложка ткани с HybriSlips просто достаточно большой, чтобы покрыть срезы ткани.
- Ведение слайд уровень держатель, вернуться к гибридизации духовке в течение инкубации в течение ночи при температуре от шага 4.2 (примерно 16 ч).
5. Строгость Вымойте
- Добавить 200 мкл 2x SSC, с подогревом до температуры гибридизации, как раз под одного края покровные, чтобы помочь освободить покровное из ткани. Удалить покровное, наклоняя слайд.
- Промыть слайды в 200 мкл 50% формамида, 50% 2х SSC при 3x температуры гибридизации в течение 30 мин каждый.
- Прополоскатьслайды 5x в PBS-T при комнатной температуре в течение 5 мин каждый на орбитальном шейкере на низкой скорости.
6. Обнаружение
- Инкубировать слайд в блокирующем буфере (2% козьей сыворотки лошади или, 2 мг / мл BSA в PBS-T) в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном шейкере на низкой скорости.
- Развести анти-DIG-AP Fab фрагменты в блокирующем буфере 1:100. Добавить 100 мкл на срез ткани и накрыть HybriSlips сократить достаточно большой, чтобы покрыть срезы.
- Инкубируйте антитело в увлажненной камере при 4 ° С в течение ночи (около 16 ч).
- Вымойте слайдов в PBS-T 7x, в течение 5 мин каждый на круговой качалке при низкой скорости.
- Промыть слайдов в AP буфера (100 мМ TrisHCl рН 9,5, 50 мМ MgCl 2, 100 мМ NaCl, 0,1% Tween 20) 3x, в течение 5 мин каждый.
- Добавить решение НБТ / BCIP А.П. буфера (200 мкл/10 буфер мл)
- Добавить 400-500 мл разведенного раствора НБТ / BCIP к каждому слайду, чтобы полностью покрыть все срезах тканей. Разработать в темном, уровня, увлажнительIED камера для 4-5 часов.
7. Монтажные Слайды
- Высушить секции в возрастающих концентраций этаноле (25%, 50%, 75%, 100%) в течение 5 мин каждый.
- Выдержите в ксилола 5x, чтобы очистить разделы.
- Гора скользит в предметный столик Permount монтажа средних и сухой в течение ночи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Области раздела тканей, которые становятся высохли в течение гибридизации, инкубации или мыть шаги обычно в конечном итоге окрашивания темнее при разработке НБТ / BCIP. Рисунок 1 показывает часть секции почек, в которых HybriSlip соскользнул из краю ткань, что позволяет ему стать частично обезвожен. Несмотря регидратации и область покрытия для оставшихся шагов, сигнал в обезвоженной части является искусственно завышены.
Важность управления время разработки NBT-BCIP продемонстрирована на фиг.2А и 2В. Периоды развития больше, чем 4-5 результате ч в выраженной неспецифической развития цвета в яичницу-Мир контроля исследуемых тканей по всей почки (рис. 2а). Почки исследовали на высокой численности целей, таких, как U6 малого управления ядерной РНК, не обладают улучшенными сигналы с инкубаций дольше, чем 4-5 часов (рис. Юр 2В).
Применимость метода ISH описанной здесь, чтобы обнаружения микроРНК в почечной ткани демонстрируется на рисунке 3, Рисунок, воспроизведенный из Кригель др.. 18 В этом исследовании мы обнаружили, что одностороннее обструкция мочеточника (UUO) вызывал почти 3-кратное увеличение кПЦР обнаружены выражение микроРНК-382 в усредненной почечной ткани по сравнению с ложнооперированных животных. Это увеличение было заблокировано внутривенного доставить анти-микроРНК-382 (данные не показаны). Использование ISH на этих тканях почек указано, что обнаружение микроРНК-382, предусмотренных настоящим зонда был достаточно чувствительным, чтобы обеспечить количественные результаты, что зеркальные анализ экспрессии на основе КПЦР. Кроме того, ISH позволило нам измерить различные региональные различия в экспрессии микроРНК внутри почки.
600px "/>
Рисунок 1. Влияние парциального дегидратации разделе почки крысы во время гибридизации шаг. Калибровка бар = 100 мм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Оптимизация продолжительности развития NBT / BCIP. Способствующего развитию NBT / BCIP продолжать в течение более 4-5 час приводит к значительному фоновое окрашивание в скремблированной-MIR исследовали ткани (рис. 2а), а не предоставляя дальнейшее улучшение сигнал в положительном контроле, U6 небольшие ядерной РНК зондировали образцы (рис. 2б). Щелкните здесь для просмотраувеличить.
Рисунок 3. Представитель изображения микроРНК-382 выражения в срезов почек мыши, полученных в гибридизация. Бар Калибровка = 50 мкм. (В) микроРНК-382 выражение в виде процента среднего ОМО Шам + анти-яичницы мышей. Эта цифра была изменена с Кригель и соавт., (Рис. 5), который описывает детали группами лечения, методов и результатов 18. Анти-омлет обрабатывают п = 10/group; анти-микроРНК-382 п = 8/group; * значительно отличается от анти-скремблированных обработанных мышей с таким же операции (р <0,05), # значительно отличается от ложнооперированных животных, получавших один и тот же анти -микроРНК лечение. Нажмите здесьчтобы просмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Целью этой статьи было описать протокол для микроРНК в гибридизация, который хорошо работает в формалине тканей фиксированных в почках. При разработке этого протокола несколько важных источников окрашивания артефакта были определены. Пристальное внимание к этим вопросам может помочь избежать окрашивания артефакт и увеличить вероятность успешного ISH перспективе.
Одним из наиболее можно избежать причин окрашивания артефакта может произойти, когда срезах ткани становятся сушат в течение длительного инкубации. Когда это происходит, часть ткани, которая становится высушенной окрасит очень мрачно ходе разработки НБТ / BCIP (рис. 1). На протяжении всего этого протокола очень важно, что срезы ткани остаются полностью покрыта жидкостью во всех инкубации и что слайды хранятся полностью уровне. Кроме того, срезы ткани должны оставаться полностью покрыта HybriSlips во время длительных инкубации, таких как шаги гибридизации и Инкубационный антитела, чтобы помочь предотвратить потерю жидкости. Если наблюдается частичное или полное высыхание раздела тканей маловероятно, что образцы даст оптимальный окрашивание, которое не позволит выражение микроРНК следует интерпретировать в этих образцах.
Другие шаги в протоколе, где жидкость покрытие является существенным являются в протеиназой К пищеварения и параформальдегидной обработки. Это пищеварение необходимо, чтобы разрешить доступ зонда миРНК в клетки. Если охват ткани является неполным в течение этого короткого инкубации, области, которые не подвергаются воздействию ферментов пищеварения не позволит столько зонд ввести и связать, и в конечном итоге не испачкать как мрачно другу, как в других областях ткани. При применении этого протокола для других типов тканей, длительность протеиназой К пищеварения, возможно, должны быть оптимизированы. Последующее фиксация параформальдегиде также имеет важное значение для предотвращения потери микроРНК следующие пермеабилизации.
нт "> Продолжительность развития НБТ / BCIP также важной переменной для управления. Мы обнаружили, что НБТ / BCIP инкубации из более чем 4 или 5 часов значительным фон артефакт начинает развиваться в тканях зондированных контрольных датчиков яичница-Mir ( Фигура 2А). Через четыре часа развития NBT / BCIP является достаточным для обнаружения зонда целей, выраженных в избытке относительно высокой, например, U6 небольшой РНК положительного контроля (рис. 2В). Более длинные инкубации видимому, не позволяют дополнительной экспрессии низком уровне, чтобы быть обнаружены, а это может просто приводит к увеличению фона артефакта.Это приводит к важному вопросу о выявляемости нижних выраженных микроРНК. Хотя мы нашли 5 'дигоксигенином сопряженные зонды, чтобы предоставить нам с достаточной чувствительности обнаружения для наших приложений в почках. На основе развития цвет щелочной фосфатазы позволяет несколько частиц измеряемого сигнала для ВАСч молекула зонда, однако некоторые низкий уровень микроРНК могут по-прежнему не может быть определен. Exiqon были разработаны микроРНК зондов, которые помечены как на 5 'и 3' концы позволяет потенциал для колориметрического два раза в развитии микроРНК молекулы. В то время как наша лаборатория не проверяет эти зонды, их использование в тканях почек с аналогичным протоколом сообщалось 8.
Этот основной протокол может быть адаптирован к другим типам ткани и микроРНК зондов путем оптимизации протеиназы К время пищеварения, концентрации микроРНК зонд, температура гибридизации и время разработки NBT / BCIP. Кроме того, можно использовать первую часть протокола в сочетании с флуоресцентными антителами в тканях, где аутофлюоресценция соответствующим низким.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Там нет ничего, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана американскими Национальными Институтами Здоровья предоставляет HL082798 и HL111580.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
- Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
- Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
- Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
- Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
- Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
- Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
- Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
- Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
- Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
- Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
- Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
- Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
- Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).
