Summary
En este artículo se describe un protocolo de hibridación in situ optimizado para la detección colorimétrica de expresión de microARN en secciones de riñón fijas con formalina.
Abstract
En este artículo se describe un método para la detección colorimétrica de miRNA en el riñón a través de la hibridación in situ con digoxigenina etiquetados sondas de microARN. Este protocolo, desarrollado originalmente por Kloosterman y colegas por un amplio uso con sondas Exiqon miARN 1, se ha modificado para superar los desafíos inherentes en el análisis de miRNA en los tejidos renales. Estos incluyen temas como la identificación de la estructura y la fuerza para eliminar la sonda residual y anticuerpos. El uso de relativamente delgada, de 5 mm de espesor, las secciones de tejido se admiten para la visualización clara de las estructuras del riñón, mientras que una señal de la sonda fuerte fue retenido en las células. Además, se han optimizado las condiciones de concentración de la sonda y de incubación para facilitar la visualización de expresión de microARN con bajo fondo y la señal no específica. Aquí, el protocolo optimizado se describe, que cubre la recogida inicial del tejido y la preparación a través del montaje de diapositivas al final del procedimiento. El Compon básicaNTS de este protocolo pueden ser alterados para su aplicación a otros tejidos y modelos de cultivo celular.
Introduction
MicroARN son pequeños (aproximadamente 22 nucleótidos de largo) RNAs no codificantes que se producen de manera endógena. Por lo general, funcionan para suprimir la expresión de la proteína a través de la represión de traducción o degradación de ARNm. miRNAs se unen a los objetivos de mRNA con complementariedad incompleta, por lo que es posible que un solo miARN para suprimir múltiples objetivos.
Entender cuáles son los tipos y estructuras celulares expresan miRNAs es una parte importante de la comprensión de los mecanismos por los que las alteraciones en la expresión de miRNA influencia celular y fenotipos de tejidos. Mientras que los métodos como la secuenciación de los genes miARN, qPCR y transferencia de Northern se pueden utilizar para la detección de miRNAs en tejidos enteros, este enfoque no permite determinar qué tipo de célula específica que llegaron desde el interior de un determinado tejido. La disección de los componentes celulares y estructurales antes del análisis utilizando estos métodos puede ser muy difícil y las condiciones necesarias para lograr aislamientos adecuados puede conducir a alterations en la expresión o la degradación de los ARN de genes. microARN hibridación in situ es un método utilizado para visualizar la ubicación de microARN y los niveles de expresión en los tejidos. Esta técnica es especialmente valiosa en los tejidos compuestos de estructuras heterogéneas, tales como el riñón.
Los microARNs se ha demostrado que desempeñan un papel regulador en 2,3 el desarrollo del riñón y de la fisiología 4. alteraciones de expresión de microARN también se han demostrado estar involucrados con la patología renal, como la fibrosis 5-10, nefropatía diabética 7, carcinoma renal 11,12, y la lesión renal aguda 13. En nuestra investigación, hemos encontrado que la optimización de micro ARN hibridación in situ para los tejidos del riñón era valiosa para determinar las ubicaciones estructurales exactas de los genes miARN expresión tanto en la salud y la enfermedad 14. Determinación de la expresión tubular y celular de diferentes microRNAs es importante porque su regulación de TArgets pueden depender de las funciones celulares. En estados de enfermedad también es importante para determinar cómo las alteraciones en la expresión de los genes miARN pueden ser función impactando.
El objetivo del método descrito aquí era construir en las metodologías existentes ISH desarrollados por Kloosterman et al. 15, otros investigadores 16,17, y los sugeridos por Exiqon 1 y optimizar el método para tejidos renales fijos formalina. Hemos utilizado con éxito este método para identificar las diferencias regionales en distintas renal expresión de microARN miR-382 con obstrucción ureteral unilateral 18. Este enfoque se puede utilizar con otros tejidos, así, con la optimización adicional.
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Protocol
1. Secciones de tejido de riñón
- Fijado en formol (10%) secciones de riñón incluidas en parafina se cortan en portaobjetos de microscopio con un espesor de 5 mm usando una Microm HM 355 S. Los portaobjetos se pueden almacenar durante varios meses antes del análisis.
2. Preparación de la Solución
- Preparar 1 l de 1x PBS en ddH2O en un frasco con tapa de rosca autoclavable. Llene otra botella con 1 l de ddH 2 O. Añadir 1 ml de DEPC a cada botella, tapar y agitar enérgicamente. Deje que las soluciones de reposar toda la noche a temperatura ambiente para destruir RNAsas y luego en autoclave. Añadir 400 ml de Tween-20 a 1 l de PBS 1x para hacer PBS-T.
- Preparar tampón de proteinasa K (50 mMTris-HCl, pH 8,0 y 1 mM de CaCl2 en agua tratada con DEPC).
- Preparar una solución de 0,2% de glicina en PBS-T.
3. Preparación de Tejido
- Preparar un gran volumen de tampón de hibridación (50-100 ml) compuesta de 50% de formamida, 5x SSC, 0,1% de Tween, 9,2mM de ácido cítrico para el ajuste a pH 6, 50 mg / ml de heparina, y 500 mg / ml de ARN de levadura en DEPC tratado ddH 2 O. Divida en alícuotas de 1 ml y se almacena a -80 º C.
- Retire la parafina del tejido lavando 3 veces en xileno fresco durante 5 minutos cada uno.
- Rehidratan las secciones de tejido por 5 min incubaciones en concentraciones decrecientes de etanol (100%, 75%, 50%, y 25%) en ddH 2 O.
- Tratar las diapositivas con DEPC suficiente para cubrir completamente las secciones de tejido (aproximadamente 0,4-0,5 ml) durante 1 min. Hacer que los tejidos seguro no se sequen.
- Enjuagar los portaobjetos en DEPC tratados PBS-T dos veces por 5 min, recogiendo el DEPC contiene residuos para su eliminación adecuada. Todos los reactivos deben ser DEPC tratados para eliminar RNAsas partir de este momento.
- Precalentar la proteinasa K tampón y agregar proteinasa K a una concentración final de 10 mg / ml. Cubrir las secciones de tejido con solución de proteinasa K y se incuba a 37 º C durante 5 min.
- Quite rápidamente las proteinassolución de e K y añadir 0,2% de glicina en PBS-T durante 30 segundos.
- Enjuague las diapositivas en DEPC tratados PBS-T dos veces durante 30 segundos cada uno.
- Fijar secciones recién hecho paraformaldehído al 4% durante 10 min.
4. Hibridación
- Añadir 50 l de tampón de hibridación (50% formamida, 5x SSC, 0,1% de Tween, ácido cítrico 9,2 mM para el ajuste a pH 6, 50 mg / ml de heparina, 500 g / ml de ARN de levadura) por sección de tejido y cubrir con RNasa HybriSlips libres cortar justo más grande que las secciones de tejido.
- Secciones Prehybridize en horno de hibridación de humedad controlada durante 2 horas a temperatura de hibridación determinado para el 3 'de la sonda marcada con digoxigenina (generalmente ADN Tm de la sonda -21 ° C, (es decir, 54 ° C durante miR-382, sonda de ADN Tm = 75 º C ), utilizando toallitas de laboratorio de tejido empapado en 50% formamide/50% SSC 5x para mantener la cámara de humidificado.
- Diluir la sonda miRNA, control positivo (U6, ARN pequeño nuclear) y control negativo (revueltossecuencia) a 40 nM en tampón de hibridación (75 l de tampón se necesita por sección).
- Calentar la sonda en tampón de hibridación a 65 º C durante 5 min.
- Retirar los portaobjetos de horno de hibridación y retirar los cubreobjetos y exceso de tampón de hibridación de prehibridación.
- Añadir 75 l de sonda que contiene tampón por sección de tejido, directamente al tejido. Cubra el tejido con HybriSlips lo suficientemente grandes para cubrir las secciones de tejido.
- Mantener el nivel soporte de diapositivas, vuelva al horno de hibridación para la incubación durante la noche a temperatura desde el paso 4.2 (aproximadamente 16 horas).
5. Rigurosidad de lavado
- Añadir 200 l 2x SSC, se calienta a la temperatura de hibridación, justo por debajo de uno de los bordes de los cubreobjetos para ayudar a liberar el cubreobjetos del tejido. Quite el cubreobjetos por la inclinación de la diapositiva.
- Lavar los portaobjetos en 200 l de formamida al 50%, 50% SSC 2x a 3x de temperatura de hibridación durante 30 min cada uno.
- Enjuaguelas diapositivas 5x en PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min cada uno en un agitador orbital a baja velocidad.
6. Detección
- Incubar diapositiva en tampón de bloqueo (2% de suero de caballo o cabra, 2 mg / ml de BSA en PBS-T) durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador orbital a baja velocidad.
- Diluir fragmentos anti-DIG-AP Fab en tampón de bloqueo a 1:100. Añadir 100 l por sección de tejido y cubrir con HybriSlips corte lo suficientemente grande como para cubrir la sección.
- Incubar anticuerpo en una cámara humidificada a 4 ° C durante la noche (aproximadamente 16 horas).
- Se lavan los portas en PBS-T 7x, durante 5 min cada uno en agitación a baja velocidad.
- Lavar los portaobjetos en tampón de AP (100 mM Tris HCl pH 9,5, 50 mM de MgCl 2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) 3x, durante 5 min cada uno.
- Añadir la solución de NBT / BCIP de tampón AP (200 μl/10 ml de tampón)
- Añadir 400-500 ml de solución de NBT / BCIP diluida a cada diapositiva para cubrir completamente todas las secciones de tejido. Desarrollar en un lugar oscuro, nivel, Humidifcámara de IED durante 4-5 horas.
7. Diapositivas de montaje
- Deshidratar secciones en concentraciones crecientes de etanol (25%, 50%, 75%, 100%) durante 5 min cada uno.
- Incubar en 5x de xileno con el fin de borrar secciones.
- Monte desliza en medio de montaje Permount y secar toda la noche.
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Representative Results
Las zonas de una sección de tejido que se convierten secó a cabo durante las hibridaciones, las incubaciones o etapas de lavado, generalmente, terminan tinción más oscura durante el desarrollo de NBT / BCIP. Figura 1 muestra una parte de una sección del riñón en la que el HybriSlip deslizó fuera del borde de el tejido, permitiendo que se convierta parcialmente deshidratado. A pesar de la rehidratación y la cobertura en los pasos restantes, la señal en la porción deshidratada es artificialmente alta.
La importancia de controlar el tiempo de desarrollo de NBT-BCIP se demuestra en las Figuras 2A y 2B. Períodos de desarrollo de más de 4-5 horas en consecuencia el desarrollo de color no específica pronunciada en los tejidos de control sondeadas revueltos-Mir durante todo el riñón (Figura 2A). Riñones sondeadas para objetivos de alta abundancia, como el pequeño mando a ARN nuclear U6, no muestran señales de mejora con incubaciones de más de 4-5 horas (Fig. ure 2B).
La aplicabilidad del método de ISH se describe aquí para la detección de los genes miARN en el tejido renal se demostró en la Figura 3, una figura reproduce a partir de Kriegel et al. 18 En ese estudio, se encontró que la obstrucción ureteral unilateral (OUU) indujo un aumento de casi 3 veces en la qPCR detectado la expresión de miR-382 en el tejido del riñón homogeneizado en comparación con los animales con operación simulada. Este aumento fue bloqueado por entregar intravenosa de anti-miR-382 (datos no mostrados). El uso de ISH en estos tejidos renales indicó que la detección de miR-382 proporcionado por esta sonda era lo suficientemente sensible como para proporcionar resultados cuantificables que reflejaban el análisis de expresión con base qPCR. Además, ISH nos permitió medir las diferencias regionales distintos en los genes miARN expresión dentro del riñón.
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Figura 1. El efecto de la deshidratación parcial de una sección de riñón de rata durante la etapa de hibridación. Bar Calibración = 100 mm. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Optimización de la duración del desarrollo NBT / BCIP. Permitiendo el desarrollo NBT / BCIP continúe por más de 4-5 hr resultados de la tinción de fondo significativo en revueltos-MIR sondeó tejidos (Figura 2A), mientras que proporciona una mejora adicional en la señal en el control positivo, U6 pequeñas muestras sondeadas ARN nuclear (Figura 2B). Haga clic aquí para ver laAmpliar imagen.
Figura 3. Imágenes representativas de la expresión de miR-382 en las secciones de riñón de ratones obtenidos por hibridación in situ barra de calibración. = 50 m. (B) la expresión de miR-382 como porcentaje IOD promedio de farsa + ratones tratados con anti-revueltos. Esta cifra ha sido modificado desde Kriegel et al., (Figura 5), que describe los detalles de los grupos de tratamiento, métodos y resultados 18. Anti revueltos tratados con n = 10/grupo; anti-miR-382 n = 8/grupo; * significativamente diferente de los ratones tratados con anti-revueltos con misma cirugía (P <0,05), # significativamente diferentes de los animales con operación simulada recibir la misma contra -MIR tratamiento. Haga clic aquípara ver la imagen más grande.
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Discussion
El objetivo de este artículo es describir un protocolo de miRNA de hibridación in situ que funciona bien en los tejidos renales fijas con formalina. Si bien la elaboración de este protocolo se han identificado varias fuentes importantes de artefactos de tinción. Una cuidadosa atención a estos puntos puede ayudar a evitar artefactos de tinción y aumentar la probabilidad de una exitosa carrera ISH.
Una de las causas más evitables de artefactos de tinción puede ocurrir cuando las secciones de tejido se convierten secos durante las incubaciones largas. Cuando esto ocurre, la porción del tejido que se vuelve seca se mancha muy oscuro durante el desarrollo de NBT / BCIP (Figura 1). A lo largo de este protocolo es crítico que las secciones de tejido permanecen completamente cubiertos por el líquido a lo largo de todas las incubaciones y que las diapositivas se mantienen completamente nivel. Además, las secciones de tejido deben permanecer completamente cubierto por HybriSlips durante las incubaciones largas, tales como etapas de hibridación y la incubación del anticuerpo, para ayudar a prevenir la pérdida de líquido. Si se observa un secado parcial o completa de una sección de tejido es poco probable que las muestras producirán tinción óptima, que no permitirá que los genes miARN expresión debe interpretarse en esas muestras.
Otros pasos en el protocolo donde la cobertura líquida es esencial son durante la digestión de proteinasa K y tratamiento paraformaldehído. Se necesita esta digestión para permitir el acceso de la sonda miARN en las células. Si la cobertura del tejido es incompleta durante este corto de incubación, las áreas que no están expuestos a la digestión de la enzima no se permiten tanto la sonda para entrar y se unen, y en última instancia, no mancha tan oscura como otro como otras áreas del tejido. Al aplicar el presente Protocolo a otros tipos de tejido, puede ser necesario optimizar la duración de proteinasa K digestión. El paraformaldehído fijación posterior es también esencial para evitar la pérdida de miRNAs siguiente permeabilización.
nt "> La duración del desarrollo NBT / BCIP también es una variable importante a controlar. Encontramos que las incubaciones NBT / BCIP de más de 4 o 5 horas significativa artefacto fondo comienza a desarrollarse en los tejidos sondeadas con las sondas de control revueltos-Mir ( Figura 2A). Cuatro horas de desarrollo NBT / BCIP es suficiente para la detección de la sonda objetivos expresados en abundancia relativamente alta, como la U6 pequeños ARN de control positivo (Figura 2B). incubaciones más largas no parecen permitir la expresión adicional de bajo nivel para detectar, más esto puede simplemente a un aumento artefacto fondo.Esto lleva a la importante cuestión de la detectabilidad de miRNAs expresados inferiores. Aunque hemos encontrado oligonucleótidos conjugados con digoxigenina el 5 'para proporcionarnos suficiente sensibilidad de detección para nuestras aplicaciones en el riñón. El desarrollo de color basado fosfatasa alcalina permite múltiples partículas señal a medir para each molécula de la sonda, sin embargo algunos miRNA bajo nivel todavía puede no ser detectable. Exiqon había desarrollado sondas miARN que se etiquetan tanto en el 5 'y 3' que permite la posibilidad de que en dos ocasiones el desarrollo colorimétrico por molécula de microARN. Aunque nuestro laboratorio no ha probado estas sondas, su uso en los tejidos renales con un protocolo similar se ha reportado 8.
Este protocolo básico se puede adaptar a otros tipos de tejidos y sondas de genes miARN mediante la optimización de proteinasa K tiempo de digestión, concentraciones de sonda miARN, las temperaturas de hibridación, y tiempos de desarrollo de NBT / BCIP. También es posible utilizar la primera parte del protocolo en combinación con anticuerpos fluorescentes en los tejidos donde autofluorescencia es apropiadamente bajo.
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Disclosures
No hay nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos otorga HL082798 y HL111580.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
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