En este artículo se describe un protocolo de hibridación in situ optimizado para la detección colorimétrica de expresión de microARN en secciones de riñón fijas con formalina.
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En este artículo
Resumen
Resumen
En este artículo se describe un método para la detección colorimétrica de miRNA en el riñón a través de la hibridación in situ con digoxigenina etiquetados sondas de microARN. Este protocolo, desarrollado originalmente por Kloosterman y colegas por un amplio uso con sondas Exiqon miARN 1, se ha modificado para superar los desafíos inherentes en el análisis de miRNA en los tejidos renales. Estos incluyen temas como la identificación de la estructura y la fuerza para eliminar la sonda residual y anticuerpos. El uso de relativamente delgada, de 5 mm de espesor, las secciones de tejido se admiten para la visualización clara de las estructuras del riñón, mientras que una señal de la sonda fuerte fue retenido en las células. Además, se han optimizado las condiciones de concentración de la sonda y de incubación para facilitar la visualización de expresión de microARN con bajo fondo y la señal no específica. Aquí, el protocolo optimizado se describe, que cubre la recogida inicial del tejido y la preparación a través del montaje de diapositivas al final del procedimiento. El Compon básicaNTS de este protocolo pueden ser alterados para su aplicación a otros tejidos y modelos de cultivo celular.
Introducción
MicroARN son pequeños (aproximadamente 22 nucleótidos de largo) RNAs no codificantes que se producen de manera endógena. Por lo general, funcionan para suprimir la expresión de la proteína a través de la represión de traducción o degradación de ARNm. miRNAs se unen a los objetivos de mRNA con complementariedad incompleta, por lo que es posible que un solo miARN para suprimir múltiples objetivos.
Entender cuáles son los tipos y estructuras celulares expresan miRNAs es una parte importante de la comprensión de los mecanismos por los que las alteraciones en la expresión de miRNA influencia celular y fenotipos de tejidos. Mientras que los mét....
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Protocolo
1. Secciones de tejido de riñón
- Fijado en formol (10%) secciones de riñón incluidas en parafina se cortan en portaobjetos de microscopio con un espesor de 5 mm usando una Microm HM 355 S. Los portaobjetos se pueden almacenar durante varios meses antes del análisis.
2. Preparación de la Solución
- Preparar 1 l de 1x PBS en ddH2O en un frasco con tapa de rosca autoclavable. Llene otra botella con 1 l de ddH 2 O. Añadir 1 ml de DEPC a cada botella, tapar y agitar enérgicamente. Deje que las soluciones de reposar toda la noche a temperatura ambiente para destruir RNAsas y luego en autoclave. Aña....
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Resultados
Las zonas de una sección de tejido que se convierten secó a cabo durante las hibridaciones, las incubaciones o etapas de lavado, generalmente, terminan tinción más oscura durante el desarrollo de NBT / BCIP. Figura 1 muestra una parte de una sección del riñón en la que el HybriSlip deslizó fuera del borde de el tejido, permitiendo que se convierta parcialmente deshidratado. A pesar de la rehidratación y la cobertura en los pasos restantes, la señal en la porción deshidratada es artificialmente alta.
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Discusión
El objetivo de este artículo es describir un protocolo de miRNA de hibridación in situ que funciona bien en los tejidos renales fijas con formalina. Si bien la elaboración de este protocolo se han identificado varias fuentes importantes de artefactos de tinción. Una cuidadosa atención a estos puntos puede ayudar a evitar artefactos de tinción y aumentar la probabilidad de una exitosa carrera ISH.
Una de las causas más evitables de artefactos de tinción puede ocurrir cuando las secci.......
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Divulgaciones
No hay nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos otorga HL082798 y HL111580.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehído | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Pirocarbonato de Dietilo | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xilenos | Sigma | 534056 | |
| Etanol | Ultra Puro | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Tecnologías | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glicina | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Ácido cítrico | Sigma | C2404 | |
| Formamida | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC | Buffer Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparina | SAGENT | 25021-400-30 | |
| ARN de levadura | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinasa K | Fermentas | EO0491 | |
| 3' Sonda DIG-miRNA | Exiqon | miR dependiente-05 | |
| 3' DIG- Sonda miR codificada | Exiqon | 99004-05 | |
| 3' Sonda DIG- U6 miR | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Cubreobjetos | Fisher Ajuste | al tamaño | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| Horno de hibridación deslizable | Boekel | 241000 | |
| Conjunto de bandeja de aluminio | Boekel | C2403973 | |
| Inserto de rejilla de acero inoxidable | Boekel C2403754 |
Referencias
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A.
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