Summary
I artikeln beskrivs en in situ hybridisering protokoll optimerat för colormetric upptäckt av mikroRNA uttryck i formalin fasta njursektioner.
Abstract
I denna artikel beskriver vi en metod för kolorimetrisk detektion av miRNA i njuren genom in situ hybridisering med digoxigenin märkt mikro-RNA-prober. Detta protokoll, som ursprungligen utvecklades av Kloosterman och kollegor för bred användning med Exiqon miRNA sonder 1, har modifierats för att övervinna utmaningar som miRNA analys i njurvävnad. Dessa inkluderar frågor som struktur identifiering och svårt att avlägsna rester sond och antikropp. Användning av relativt tunna, 5 mm tjock, vävnadssektioner som tillåts för tydlig visualisering av njurstrukturer, samtidigt som en stark sondsignal behölls i celler. Dessutom var sond koncentration och inkubationsförhållanden optimerade för att underlätta visualisering av mikroRNA uttryck med låg bakgrund och icke-specifik signal. Här är den optimerade protokollet beskrivet, som täcker den inledande insamlingen preparation av vävnader och genom montering av objektglasen vid slutet av förfarandet. Den grundläggande components av detta protokoll kan ändras vid tillämpningen på andra vävnader och cellkulturmodeller.
Introduction
MikroRNA är små (ca 22 nukleotider långa) icke-kodande RNA som endogent produceras. De fungerar i allmänhet att undertrycka proteinuttryck genom translationell förtryck eller mRNA nedbrytning. miRNA binder till mRNA-mål med ofullständig komplementaritet, vilket gör det möjligt för en enda miRNA för att undertrycka flera mål.
Förstå vilka typer och strukturer cell uttrycker miRNA är en viktig del i att förstå de mekanismer genom vilka förändringar i miRNA uttryck påverkar cell-och vävnads fenotyper. Även metoder som miRNA sekvensering, qPCR och Northern blotting kan användas för detektion av miRNA i hela vävnader, denna metod inte tillåter en att avgöra vilken specifik celltyp de kom inifrån en viss vävnad. Dissektion av cellulära och strukturella komponenter före analys med hjälp av dessa metoder kan vara mycket svårt och de villkor som behövs för att uppnå tillräckliga isoleringar kan leda till alterations i genuttryck eller nedbrytning av RNAs. mikro-RNA in situ hybridisering är en metod som används för att visualisera microRNAen lokalisering och expressionsnivåer i vävnader. Denna teknik är speciellt värdefull i vävnader som består av heterogena strukturer, såsom njuren.
MicroRNAs har visat sig spela en reglerande roll i njurutveckling 2,3 och fysiologi 4. mikroRNA uttryck förändringar har också visats vara involverad med njurpatologi såsom fibros 5-10, diabetesnefropati 7, njurkarcinom 11,12, och akut njurskada 13. I vår forskning har vi funnit att optimera mikroRNA in situ hybridisering för njurvävnad var värdefullt för att fastställa den exakta strukturella placeringen av miRNA uttryck i både hälsa och sjukdom 14. Bestämning av den rörformade och cellulär expression av olika microRNAs är viktigt eftersom deras reglering av TArgets kan vara beroende av cellulära funktioner. I sjukdomstillstånd är det också viktigt att avgöra hur förändringar i miRNA uttryck kan påverka funktionen.
Målet med den här beskrivna metoden var att bygga vidare på befintliga ISH metoder som utvecklats av Kloosterman et al. 15, andra utredare 16,17, och de som föreslås av Exiqon 1 och optimera metoden för formalin fasta njurvävnad. Vi har framgångsrikt använt denna metod för att identifiera tydliga regionala skillnader i njur mikroRNA miR-382 uttryck med unilateral ureteral obstruktion 18. Denna metod kan användas med andra vävnader också, med ytterligare optimering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Njurvävnadssnitt
- Formalinfixerade (10%) paraffininbäddade njursektioner skärs på objektglas vid 5 mm tjocklek med hjälp av en Microm HM 355 S. Bilderna kan lagras i flera månader innan analys.
2. Lösning Beredning
- Bered 1 L av 1x PBS i DDH 2 O i ett autoklaverskruvlock flaska. Fyll en flaska med 1 L av DDH 2 O. Tillsätt 1 ml DEPC till varje flaska, lock och skaka kraftigt. Låt lösningarna stå över natten vid rumstemperatur för att förstöra RNAs och sedan autoklaveras. Addera 400 ml Tween-20 till 1 L av 1 x PBS för att göra PBS-T.
- Förbered proteinas K-buffert (50 mMTris-HCl, pH 8,0 och 1 mM CaCl2 i DEPC-behandlat vatten).
- Bered en lösning av 0,2% glycin i PBS-T.
3. Vävnadsberedning
- Förbered en stor volym av hybridiseringsbuffert (50 till 100 ml) bestående av 50% formamid, 5 x SSC, 0,1% Tween, 9,2mM citronsyra för justering till pH 6, 50 | ig / ml heparin, och 500 | ig / ml jäst-RNA i DEPC-behandlat DDH 2 O. Dela upp i 1 ml alikvoter och förvara vid -80 º C.
- Avlägsna paraffin från vävnaden genom att tvätta 3x med färskt xylen under 5 min vardera.
- Rehydrera vävnadssnitt med 5 min inkubationer i minskande koncentrationer av etanol (100%, 75%, 50% och 25%) i DDH 2 O.
- Behandla glasen med tillräckligt DEPC för att helt täcka de vävnadssnitt (ca 0,4 till 0,5 ml) under 1 min. Se till att vävnader inte torka ut.
- Skölj objektglasen i DEPC behandlade PBS-T två gånger i 5 minuter, samla in DEPC innehåller avfall för korrekt avfallshantering. Alla reagenser ska DEPC behandlas för att eliminera RNAs från och med nu.
- Förvärm Proteinas K-buffert och lägga proteinas K till en slutlig koncentration av 10 pg / ml. Täck vävnadssnitt med proteinas K-lösning och inkubera vid 37 ° C i 5 min.
- Snabbt bort Proteinase K-lösning och tillsätt 0,2% glycin i PBS-T för 30 sek.
- Skölj objektglasen i DEPC behandlade PBS-T två gånger under 30 sekunder vardera.
- Fix sektioner i nygjorda 4% paraformaldehyd under 10 min.
4. Hybridisering
- Addera 50 pl av hybridiseringsbuffert (50% formamid, 5 x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM citronsyra för justering till pH 6, 50 | ig / ml heparin, 500 ^ ig / ml jäst-RNA) per vävnadssektion och täck med RNas-fritt HybriSlips skär bara större än vävnadssnitt.
- Prehybridize sektioner i fuktighetsreglerad hybridisering ugn under 2 h vid hybridiseringstemperaturen bestäms för 3'digoxigenin märkt prob (vanligen DNA Tm av proben -21 ° C, (det vill säga 54 ° C i miR-382, sond-DNA Tm = 75 ° C ), med hjälp av vävnads lab våtservetter indränkt i 50% formamide/50% 5x SSC för att hålla kammaren fuktig.
- Späd miRNA sond, positiv kontroll (U6, små nukleära RNA) och negativ kontroll (oordningsekvens) till 40 nM i hybridiseringsbuffert (75 ul av buffert behövs per sektion).
- Värm prob i hybridiserings-buffert vid 65 ° C i 5 min.
- Ta bort bilder från hybridisering ugnen och ta bort täckglas och överflödigt hybridisering buffert från förhybridisering.
- Lägg till 75 l av sond som innehåller buffert per vävnadssnitt, direkt till vävnaden. Täck vävnad med HybriSlips precis stor nog att täcka vävnadssnitt.
- Att hålla diapositivhållare nivå, återvänder till hybridisering ugn över natten inkubation vid temperatur från steg 4.2 (ca 16 tim).
5. Stringenstvätt
- Tillsätt 200 | il 2 x SSC, upphettades till hybridiseringstemperaturen, strax under en kant av täckglas för att hjälpa till att frigöra täckglas från vävnaden. Ta bort täckglas genom att luta bilden.
- Tvätta bilderna i 200 ul av 50% formamid, 50% 2x SSC vid hybridiseringstemperaturen 3x under 30 min vardera.
- Sköljsliderna 5x i PBS-T vid rumstemperatur under 5 min vardera på orbitalskak på låg hastighet.
6. Detektion
- Inkubera objektglaset i blockeringsbuffert (2% get eller hästserum, 2 mg / ml BSA i PBS-T) under 1 timme vid rumstemperatur på orbitalskak på låg hastighet.
- Späd anti-DIG-AP-Fab-fragment i blockerande buffert vid 1:100. Tillsätt 100 l per vävnadssektionen och täck med HybriSlips klippa precis stor nog att täcka avsnittet.
- Inkubera antikropp i en befuktad kammare vid 4 ° C över natten (ca 16 h).
- Tvätta objektglasen i PBS-T 7x, för 5 min vardera på orbitalskak vid låg hastighet.
- Tvätta bilderna i AP-buffert (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 3x, under 5 minuter vardera.
- Lägg NBT / BCIP-lösning till AP-buffert (200 μl/10 ml buffert)
- Lägg 400-500 ml utspädd NBT / BCIP lösning på varje bild för att helt täcka alla vävnadssnitt. Utveckla i en mörk, nivå, humidified kammare under 4-5 timmar.
7. Monterings Slides
- Torka avsnitt i ökande koncentrationer av etanol (25%, 50%, 75%, 100%) i 5 minuter vardera.
- Inkubera i xylen 5x för att rensa delar.
- Mount glider i Permount monteringsmedium och torka över natten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De områden av en vävnadssektion som blir uttorkad under hybridiseringarna, inkubationer eller tvättsteg i allmänhet sluta färgning mer mörkt under NBT / BCIP-utveckling. Figur 1 visar en del av en njursektion i vilken den HybriSlip gled av av kanten av vävnaden, så att den blir delvis dehydratiserad. Trots rehydrering och täckning i de återstående stegen, är signalen i uttorkad delen artificiellt höga.
Vikten av att styra tidpunkten för NBT-BCIP-utveckling visas i figurerna 2A och 2B. Utvecklingsperioder längre än 4-5 tim förorsaka uttalad ospecifik färgutveckling i oordning-miR kontrollsonde vävnader i hela njure (Figur 2A). Njurar sonderade för hög överflöd mål, såsom U6 små nukleära RNA-kontroll, inte uppvisar förbättrade signaler med inkubationer längre än 4-5 timmar (Fig ure 2B).
Huruvida ISH metod som beskrivs här för att miRNA upptäckt i njurvävnad visas i figur 3, en siffra som återges från Kriegel et al. 18 I denna studie fann vi att ensidiga ureteral obstruktion (UUO) inducerade en nästan 3-faldig ökning av qPCR upptäckt miR-382 uttryck i homogeniserad njurvävnad jämfört med skenopererade djur. Denna ökning blockerades av intravenös leverera anti-miR-382 (data visas ej). Användningen av ISH på dessa njurvävnad indikerade att miR-382 upptäckt som denna sond var känslig nog för att ge mätbara resultat som speglade qPCR baserad expressionsanalys. Dessutom ISH tillät oss att mäta tydliga regionala skillnader i miRNA uttryck i njuren.
600px "/>
Figur 1. Effekten av den partiella uttorkning av en råttnjursektion i samband med hybridisering. Kalibrerings bar = 100 mm. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Optimering av varaktigheten av NBT / BCIP utveckling. Att tillåta NBT / BCIP utveckling att fortsätta i mer än 4-5 tim medför betydande bakgrundsfärgning i oordning-miR sonderade vävnader (Figur 2A), samtidigt som den ger ingen ytterligare förbättring signalen i den positiva kontrollen, U6 små nukleära RNA sonderade prover (Figur 2B). Klicka här för att sestörre bild.
Figur 3. Representativa bilder av miR-382-expression i mus-njursnitt erhållna genom in situ-hybridisering. Kalibrering bar = 50 | im. (B) miR-382 uttryck som procent genomsnittlig IOD av sham + anti-kodade behandlade möss. Denna siffra har modifierats Kriegel et al., (Figur 5), som beskriver detaljerna i behandlingsgrupperna, metoder och resultat 18. Anti-oordning behandlas n = 10/grupp; anti-miR-382 n = 8/grupp, * signifikant skild från anti-scrambled behandlade möss med samma operation (P <0,05), # olika signifikant från skenopererade djur som fick samma anti -miR behandling. klicka härför att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denna artikel var att beskriva ett protokoll för miRNA in situ hybridisering som fungerar bra i formalin fasta njurvävnad. Samtidigt tränar detta protokoll flera viktiga källor för färgning artefakt har identifierats. Noggrann uppmärksamhet på dessa punkter kan hjälpa till att undvika missfärgning artefakt och öka sannolikheten för en lyckad ISH körning.
En av de mest påverkbara orsaker till färgning artefakt kan uppstå när vävnadssnitt blir uttorkad under långa inkubationer. När detta inträffar den del av vävnaden som blir torkat färgar väldigt mörkt under NBT / BCIP utveckling (figur 1). Under hela detta protokoll är det viktigt att de vävnadssnitt fortfarande helt täckt av vätska i alla inkubationer och att glasen hålls helt nivå. Dessutom bör de vävnadssnitt fortfarande helt täckt av HybriSlips under långa inkubationer såsom hybridisering steg och antikropp inkubation, för att förhindra vätskeförlust. Om partiell eller fullständig torkning av en del vävnad observeras att det är osannolikt att proven kommer att ge optimal färgning, vilket inte kommer att tillåta miRNA uttryck tolkas i dessa prover.
Andra steg i protokollet där flytande täckning är viktigt är under proteinas K matsmältningen och paraformaldehyd behandling. Behövs Denna spjälkning för att tillåta åtkomst av miRNA sond in i cellerna. Om täckningen av vävnaden är ofullständigt under denna korta inkubation kommer de områden som inte är utsatta för enzymet matsmältningen inte tillåter så mycket sond för att komma in och binda, och i slutändan kommer inte fläckar så mörkt som andra som andra delar av vävnaden. Vid tillämpning av detta protokoll till andra vävnadstyper, kan tidsåtgången för proteinas K matsmältningen behöver optimeras. Den efterföljande paraformaldehyd fixering är också viktigt att förhindra förlust av miRNA efter permeabilization.
nt "> är Varaktigheten av NBT / BCIP utveckling också en viktig variabel att kontrollera. Vi fann att NBT / BCIP inkubationer längre än 4 eller 5 tim betydande bakgrund artefakt börjar utvecklas i vävnader sonderade med de kodade-miR kontrollsonder ( Figur 2A). Fyra timmars NBT / BCIP-utveckling är tillräcklig för detektion av sond mål som uttrycks i relativt högt överflöd, såsom U6 small RNA positiv kontroll (Figur 2B). Har Längre inkubationer som inte visas för att medge extra låg expressionsnivå för upptäckas, snarare detta kan helt enkelt resulterar i ökad bakgrunds artefakt.Detta leder till den viktiga frågan om upptäcktsrisken lägre uttryckta miRNA. Även om vi har hittat 5 'digoxigenin konjugerade sonder att förse oss med tillräcklig känslighet för våra applikationer i njur upptäckt. Den alkaliska fosfatas-baserad färgutveckling möjliggör multipla signal partiklarna som skall mätas för each molekyl av sonden, men vissa låg nivå miRNA ändå kanske inte är detekterbar. Exiqon hade utvecklat miRNA prober som är märkta på både 5'-och 3'-ändarna som medger möjligheten till två gånger den kolorimetriska utvecklingen per mikro-RNA-molekyl. Medan vårt labb inte har testat dessa sönder har deras användning i njurvävnad med ett liknande protokoll rapporterats 8.
Denna grundläggande protokollet kan anpassas till andra vävnadstyper och miRNA prober genom att optimera proteinas-K-spjälkning gången miRNA probkoncentrationer, hybridiseringstemperaturer och NBT / BCIP utvecklingstider. Det är också möjligt att använda den första delen av protokollet i kombination med fluorescerande antikroppar i vävnader där autofluorescens är lämpligt låg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av amerikanska National Institutes of Health bidrag HL082798 och HL111580.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
- Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
- Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
- Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
- Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
- Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
- Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
- Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
- Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
- Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
- Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
- Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
- Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
- Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).
