Bu makalede, formalin içerisinde tespit edilmiş böbrek bölümlerinde microRNA ifade Renkölçer tespiti için optimize edilmiş bir in situ hibridizasyon protokolü tarif eder.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Bu yazıda microRNA problar etiketlenmiş digoksijenin ile in situ melezleme yoluyla böbrekte miRNA kolorimetrik tespiti için bir yöntem tarif eder. Başlangıçta Kloosterman ve Exiqon miRNA sondalar 1 ile geniş kullanım için meslektaşları tarafından geliştirilen bu protokol, böbrek dokularında miRNA analizinde doğal zorlukları aşmak için modifiye edilmiştir. Bunlar yapı tespiti ve kalıntı prob ve antikor çıkarmak zor gibi konuları içerir. Nispeten ince kullanımı olup, 5 mm kalınlığında, güçlü bir prob sinyal hücrelerinde muhafaza ederken, böbrek yapıları net bir görünüm için izin verilen doku kesitleri. Ayrıca, prob konsantrasyonu ve inkübasyon koşulları Düşük arka plan ve spesifik olmayan sinyal ile mıkroRNA ifade görselleştirme kolaylaştırmak için optimize edildi. Burada, optimize edilmiş prosedür protokolü sonunda slaytların montajı yoluyla ilk doku toplanması ve hazırlama kaplama açıklanmaktadır. Temel componeBu protokolün nts diğer doku ve hücre kültürü modelleri uygulama için değiştirilebilir.
Giriş
MicroRNA endojen olarak üretilir kodlayıcı olmayan RNA'lar (yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda) küçüktür. Bunlar genellikle translasyon baskı veya mRNA degradasyon yoluyla protein ekspresyonunu engellemek için çalışır. eksik tamamlayıcılık mRNA hedeflere miRNA'ların bağlamak mümkün, tek bir miRNA çoklu hedefleri bastırmak için yapım.
Hücre tipleri ve yapılarının miRNA'lar ifade anlayış mekanizmaların anlaşılmasında önemli bir parçası olan aracılığıyla miRNA ifade etkisi hücre ve doku fenotipleri değişiklikler. Bu tür sıralama MiRNA, QPCR ve Kuzey beneklemesi gibi yöntemler bütün dokularda miRNAs tespiti için kullanılabilecek ol....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1.. Böbrek Doku Bölümler
- Formalin-sabit (% 10) parafin-gömülü böbrek bölümleri slaytlar analizden önce birkaç ay boyunca saklanabilir bir Microm HM 355 S. kullanılarak 5 mm kalınlığında mikroskop lamı üzerine kesilir.
2. Çözüm Hazırlığı
- Bir Otoklavlanabilir vida üst şişede GKD 2 O 1x PBS 1 L hazırlayın. GKD 2 O. 1 L ile bir şişe doldurun Her şişe, kapak DEPC 1 ml ekleyin ve şiddetle çalkalanır. Çözümler RNaz'larına yok etmek ve daha sonra otoklavlanmasıdır gece oda sıcaklığında bekletin. PBS-T için 400 ml Tween-20 1x PBS L 1 ekle.
- Proteinaz K tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 8.0 v....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Hibridizasyonlar, inkubasyon sırasında kurutulmuş veya NBT / BCIP gelişimi sırasında daha koyu lekelere sona genellikle yıkama aşamaları olur bir doku kesitinin alanları. 1 HybriSlip kenarının kaymış olduğu bir böbrek bölümünün bir bölümünü göstermektedir, Şekil kısmen susuz olmak sağlayan doku. Kalan adımda rehidrasyon ve içerisinde rağmen, susuz kısmında sinyal yapay yüksektir.
NBT-BCIP gelişme zamanını kontrol önemi, Şekiller 2A ve
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalenin amacı formalin sabit böbrek dokularında iyi çalışır in situ hibridizasyon miRNA için bir protokol açıklar oldu. Bu protokol üzerinde çalışırken boyama dışlayıcı birçok önemli kaynakları tespit edilmiştir. Bu noktalara dikkat ve özen boyama objeyi önlemek ve başarılı ISH çalıştırmak olasılığını artırabilir.
Haline doku bölümleri uzun inkubasyon sırasında kuruduğunda boyama dışlayıcı en önlenebilir nedenlerinden biri oluşabilir. Bu durumda, kurutuldu olur doku bölümü NBT .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen HL082798 ve HL111580 verir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehit | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Dietil Pirokarbonat | Sigma | D5758 | |
| Ara-20 | Sigma | P1379 | |
| Ksilenler | Sigma | 534056 | |
| Etanol | Ultra Saf | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Ömrü Teknolojiler | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glisin | JT Baker | 4059-00 | |
| Sitrik Asit | Sigma | C2404 | |
| Formamid | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Tampon Ömrü | Teknolojileri | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Maya RNA | Yaşam Teknolojileri | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | JT Baker | 4058-01 | |
| Proteinaz K | Fermentas | EO0491 | |
| 3' DIG- miRNA probu | Exiqon | miR bağımlı-05 | |
| 3' DIG- Şifreli miR probu | Exiqon | 99004-05 | |
| 3' DIG- U6 miR probu | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Lameller | Fisher | Doku boyutuna | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| Kaydıraklı Hibridizasyon Fırını | Boekel | 241000 | |
| Alüminyum Tepsi Montajı | Boekel | C2403973 | |
| Paslanmaz Çelik Raf Geçmeli | Boekel | C2403754 |
Kaynaklar
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
