Summary
מאמר זה מתאר בפרוטוקול הכלאה באתר מותאם לגילוי colormetric ביטוי microRNA בסעיפי כליות קבועים פורמלין.
Abstract
במאמר זה אנו מתארים שיטה לגילוי colorimetric של מירנה בכליות באמצעות הכלאה באתר עם digoxigenin מתויגים בדיקות microRNA. פרוטוקול זה, שפותח במקור על ידי קלוסטרמן ועמיתיו לשימוש רחב בבדיקות Exiqon מירנה 1, כבר שונה כדי להתגבר על אתגרים הכרוכים בניתוח מירנה ברקמות כליה. אלה כוללים נושאים כמו זיהוי מבנה וקשה להסיר בדיקה ונוגדן שיורית. שימוש בדק יחסית, 5 מ"מ עובי, חלקי רקמות אפשרו להדמיה ברורה של מבנים בכליות, ואילו אות בדיקה חזקה נשמרה בתאים. בנוסף, תנאי ריכוז בדיקה ודגירה היו מותאמים כדי להקל על ויזואליזציה של ביטוי microRNA עם רקע נמוך ואות ספציפיות. הנה, בפרוטוקול מותאם מתואר, המכסה את אוסף רקמות הראשוני והכנה דרך ההרכבה של שקופיות בסוף ההליך. Compone הבסיסילילות של פרוטוקול זה יכול להיות שונה ליישום לרקמות אחרות ומודלי תרבית תאים.
Introduction
MicroRNA הם קטנים (אורכו כ -22 נוקלאוטידים) noncoding RNAs שמיוצרים באופן אנדוגני. הם בדרך כלל לתפקד לדכא ביטוי חלבון באמצעות דיכוי translational או השפלה mRNA. לאגד miRNAs למטרות mRNA עם השלמה שלמה, מה שמאפשר למירנה אחת כדי לדכא את המטרות מרובות.
הבנה שסוגי תאים ומבנים להביע miRNAs היא חלק חשוב בהבנת המנגנונים שבאמצעותם שינויים בתא השפעת ביטוי מירנה ופנוטיפים רקמות. בעוד שיטות כגון רצף של מירנה, qPCR וסופג צפון יכולות לשמש לזיהוי של miRNAs בכל רקמות, גישה זו אינה מאפשרת אחד כדי לקבוע איזה סוג תא מסוים שממנו באו בתוך רקמה מסוימת. Dissection של רכיבים סלולריים ומבניים לפני הניתוח באמצעות שיטות אלה יכול להיות מאוד קשה והתנאים הדרושים להשגת בידודים נאותים יכולים להוביל לאלterations בביטוי גנים או השפלה של RNAs. microRNA הכלאה באתר הוא שיטה המשמשת כדי להמחיש מיקום microRNA ורמות ביטוי ברקמות. טכניקה זו היא חשובה במיוחד ברקמות מורכבות של מבנים שונים, כמו למשל בכליות.
מיקרו RNA הוכח לשחק תפקיד רגולציה ב2,3 פיתוח כליות ופיזיולוגיה 4. שינויי ביטוי microRNA יש גם הוכח להיות מעורבים בפתולוגיה של כליות כמו סיסטיק 5-10, נפרופתיה סוכרתית 7, קרצינומה של הכליה 11,12, וניזק כלייתי חריף 13. במחקר שלנו, מצאנו כי אופטימיזציה של microRNA הכלאה באתרו לרקמות כליה הייתה בעל ערך לקביעת המיקומים המבניים המדויקים של ביטוי מירנה בבריאות והן במחלה 14. קביעת הביטוי צינורי וסלולרי של מיקרו RNA השונים היא חשובה משום שהרגולציה שלהם targets עשוי להיות תלוי בתפקודים תאיים. במדינות חולות חשוב גם כדי לקבוע כיצד שינויים בביטוי מירנה עלולים להיות השפעה על תפקוד.
המטרה של השיטה שתוארה כאן הייתה לבנות על מתודולוגיות ISH קיימות שפותחו על ידי קלוסטרמן et al. 15, חוקרים אחרים 16,17, ואלה שהוצעו על ידי 1 Exiqon ולייעל את השיטה לרקמות כליה קבועה פורמלין. אנחנו השתמשנו בהצלחה בשיטה זו כדי לזהות הבדלים אזוריים מובהקים בביטוי כליות microRNA miR-382 עם חסימה בשופכן חד צדדית 18. גישה זו יכולה לשמש גם עם רקמות אחרות, עם אופטימיזציה נוספת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סעיפים רקמת כליה
- סעיפי כליות מוטבעים פרפין קבוע פורמלין (10%) נחתכים על גבי שקופיות מיקרוסקופ ב5 מ"מ עובי באמצעות ס microM HM 355 השקופיות יכולות להיות מאוחסנות במשך מספר חודשים לפני הניתוח.
2. פתרון הכנה
- הכן 1 ליטר של 1x PBS בDDH 2 O בבקבוק בראש בורג autoclavable. מלא עוד בקבוק עם 1 ליטר של DDH 2 O. הוסף 1 מיליליטר של DEPC לכל בקבוק, מכסים ולנער במרץ. תן הפתרונות לשבת לילה בטמפרטורת חדר כדי להרוס RNases ולאחר מכן חיטוי. להוסיף 400 מיליליטר 20-Tween עד 1 ליטר של 1x PBS לעשות PBS-T.
- הכן proteinase חיץ K (50 mMTris-HCl, pH 8.0 ו1 מ"מ CaCl 2 בDEPC מים מטופלים).
- הכן פתרון של גליצין 0.2% ב-PBS-T.
3. הכנת רקמה
- הכן כמות גדולה של חיץ הכלאה (50-100 מיליליטר) המורכב מFormamide 50%, 5x SSC, Tween 0.1%, 9.2חומצת לימון מ"מ להתאמה ל-pH 6, 50 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין, ו500 מיקרוגרם / מיליליטר RNA שמרים בDEPC טופלה DDH 2 O. מחלקים ל 1 מיליליטר aliquots ולאחסן ב -80 º C.
- הסר את פרפין מהרקמה על ידי שטיפת 3x בקסילן הטרי במשך 5 דקות כל אחד.
- רעננותם סעיפי רקמות על ידי 5 incubations דקות בהפחתת ריכוזים של אתנול (100%, 75%, 50%, ו25%) בDDH 2 O.
- פנק את השקופיות עם מספיק DEPC כדי לכסות לחלוטין את סעיפי רקמות (כ 0.4-0.5 מיליליטר) דקות 1. רקמות בטוחים הפוך לא יתייבשו.
- יש לשטוף את השקופיות בDEPC טופלו PBS-T פעמיים במשך 5 דקות, איסוף פסולת DEPC מכילים לסילוק נאות. צריכים DEPC יטופלו כל ריאגנטים לחסל RNases מנקודה זו והלאה.
- Prewarm proteinase K חיץ ולהוסיף K proteinase לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר. כסה סעיפי רקמות עם פתרון K proteinase ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- להסיר במהירות את proteinasפתרון e K ולהוסיף גליצין 0.2% ב-PBS-T ל30 שניות.
- מגלשות יש לשטוף בDEPC טופלו PBS-T פעמיים ל30 שניות כל אחד.
- לתקן סעיפים בparaformaldehyde 4% טריים ל10 דקות.
4. הכלאה
- הוסף 50 μl של חיץ הכלאה (Formamide 50%, 5x SSC, Tween 0.1%, חומצת לימון 9.2 מ"מ להתאמה ל-pH 6, 50 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין, 500 מיקרוגרם / שמרים RNA מיליליטר) לכל קטע רקמה ומכסים בHybriSlips RNase ללא לחתוך פשוט גדול מסעיפי הרקמות.
- סעיפי Prehybridize בתנור הכלאת לחות מבוקרת במשך שעה 2 בטמפרטורת הכלאה שנקבעה לבדיקת 3 'שכותרתו digoxigenin (בדרך כלל DNA Tm של החללית -21 ° C, (כלומר 54 מעלות צלזיוס במשך miR-382, הבדיקה DNA Tm = 75 ° C ), תוך שימוש במעבדת רקמת מגבונים ספוגים ב50% formamide/50% SSC 5x כדי לשמור על התא humidified.
- לדלל את הבדיקה מירנה, בקרה חיובית (U6, RNA הגרעיני קטן) ובקרה שלילית (מקושקשתרצף) ל40 ננומטר במאגר הכלאה (75 μl של חיץ נחוץ לכל סעיף).
- מחממים את הבדיקה במאגר הכלאה ב65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- הסר את השקופיות מתנור הכלאה ולהסיר coverslips וחיץ הכלאה עודף מprehybridization.
- הוסף 75 μl של חללית המכילה חיץ לכל קטע רקמה, ישירות לרקמות. כסה רקמות עם HybriSlips פשוט גדול מספיק כדי לכסות את חלקי רקמות.
- שמירה על רמת מחזיק שקופיות, לחזור לתנור הכלאה לדגירת הלילה בטמפרטורה מהשלב 4.2 (כ 16 hr).
5. החמרת שטפי
- הוסף 200 μl 2x SSC, מחומם לטמפרטורת ההכלאה, רק תחת קצה אחד של coverslips כדי לעזור לשחרר את coverslip מהרקמות. הסר את coverslip על ידי הטיית השקופיות.
- שטוף את השקופיות ב200 μl של פוראמיד 50%, SSC 2x 50% ב3x טמפרטורת ההכלאה ל30 דקות כל אחד.
- לשטוףשקופיות 5x ב-PBS-T בטמפרטורת חדר במשך 5 דקות כל אחד בייקר מסלולית במהירות נמוכה.
6. איתור
- דגירה שקופיות בחסימת המאגר (עז 2% או בסרום סוס, 2 מ"ג / מיליליטר BSA ב PBS-T) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר בייקר מסלולית במהירות נמוכה.
- לדלל ברים אנטי DIG-AP Fab בחסימת מאגר ב1:100. להוסיף לקטע רקמה 100 μl ומכסים בHybriSlips לחתוך פשוט גדול מספיק כדי לכסות את הסעיף.
- דגירה נוגדן בתא humidified על 4 מעלות צלזיוס (כ 16 שעה) למשך הלילה.
- שטוף את שקופיות PBS-T 7x, במשך 5 דקות כל אחד בייקר מסלולית במהירות נמוכה.
- שטוף את השקופיות במאגר AP (100 מ"מ TrisHCl pH 9.5, 50 מ"מ MgCl 2, 100mm NaCl, 0.1% Tween 20) 3x, במשך 5 דקות כל אחד.
- הוספת פתרון NBT / BCIP לחיץ AP (200 חיץ מיליליטר μl/10)
- להוסיף 400-500 מיליליטר של תמיסת NBT / BCIP מדולל לכל שקופית כדי לכסות את כל חלקי הרקמות לחלוטין. לפתח בחושך, ברמה, humidifתא מטען ל4-5 שעות.
7. שקופיות הרכבה
- מייבש את החלקים בהגדלת ריכוזים של אתנול (25%, 50%, 75%, 100%) במשך 5 דקות כל אחד.
- דגירה ב5x קסילן כדי לנקות את החלקים.
- הר שקופיות בהרכבה הבינוני Permount ולילה יבש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
האזורים של קטע רקמה שהופכים התייבש במהלך ההכלאות, incubations או לשטוף צעדים בדרך כלל בסופו של הכתמה כהה יותר במהלך פיתוח NBT / BCIP. איור 1 מציג חלק מסעיף בכליות שבי HybriSlip החליק מהקצה הרקמות, שמאפשרים לו להתייבש באופן חלקי. למרות החזרת נוזלים וכיסוי בשלבים הנותרים, האות בחלק מיובש היא גבוהה באופן מלאכותי.
החשיבות של שליטה על הזמן של פיתוח NBT-BCIP באה לידי ביטוי בדמויות ו2A 2B. תקופות פיתוח זמן רב יותר מאשר 4-5 תוצאת HR בפיתוח מבוטא ספציפי צבע ברקמות שליטה מקושקשת-miR נחקרו לאורך (איור 2 א) בכליות. כליות נחקרו על מטרות גבוהות שפע, כגון שליטת RNA הגרעיני הקטנה U6, אינן מציגות אותות משופרים עם incubations יותר מ 4-5 שעות (איור יור 2B).
תחולתה של שיטת ISH המתוארת כאן לאיתור מירנה ברקמת כליה מודגמת באיור 3, דמות לשכפל מקריגל ואח'. 18 במחקר שמצאנו כי חסימה בשופכן חד צדדית (UUO) גרמה לעלייה של פי 3 כמעט בqPCR זוהה ביטוי miR-382 ברקמת כליה הומוגני בהשוואה לחיות דמה פעל. גידול זה היה חסום על ידי עירוי לספק אנטי miR-382 (מידע לא מוצג). השימוש בש ברקמות הכליה אלה מצביע על כך שזיהוי miR-382 מסופק על ידי חללית זו היה רגיש מספיק כדי לספק תוצאות לכימות ששקפו את ניתוח ביטוי מבוסס qPCR. בנוסף, ISH אפשר לנו למדוד הבדלים אזוריים מובהקים בביטוי מירנה בתוך הכליה.
600px "/>
איור 1. ההשפעה של ההתייבשות החלקית של סעיף בכליות חולדה במהלך שלב הכלאה. בר כיול = 100 מ"מ. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. אופטימיזציה של משך פיתוח NBT / BCIP. מתן אפשרות לפיתוח NBT / BCIP להמשיך ליותר מ 4-5 שעות בתוצאות מכתים רקע משמעותי במקושקש-miR בחנה רקמות (איור 2 א), תוך מתן לא חלה שיפור נוסף ב האות בשליטה החיובית, דגימות U6 קטנות RNA הגרעיני נחקרו (תרשים 2B). לחץ כאן לצפייהתמונה גדולה יותר.
איור 3. נציג תמונות של ביטוי miR-382 בסעיפי כליות עכבר מתקבלים על ידי הכלאה באתר. בר כיול = 50 מיקרומטר. (ב) ביטוי miR-382 כIOD ממוצע אחוזים מהדמה + אנטי מקושקשות עכברים שטופלו. נתון זה שונה מאל קריגל et., (איור 5), המתאר את הפרטים של קבוצות טיפול, שיטות ותוצאות 18. -מקושקשת אנטי טופל n = 10/group; אנטי miR-382 n = 8/group; * שונה באופן משמעותי מאנטי מקושקשת עכברים שטופלו באותו ניתוח (P <0.05), # שונה באופן משמעותי מחיות דמה פעל לקבל את אותו אנטי MiR-טיפול. לחץ כאןלצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מטרתו של מאמר זה הייתה לתאר את הפרוטוקול למירנה הכלאה באתרו שפועל היטב ברקמות כליה קבועות פורמלין. תוך כדי העבודה בחוץ פרוטוקול זה כמה מקורות חשובים של חפץ מכתים זוהו. תשומת לב רבה לנקודות אלה יכולים לסייע במניעת חפץ מכתים ומעלה את הסבירות לריצה ISH מוצלחת.
אחת הסיבות למניעה ביותר של חפץ מכתים יכול להתרחש כאשר חלקי רקמה הפכו התייבשו במהלך incubations הארוך. כאשר זה קורה החלק מהרקמה שהופכת יבשה יהיה כתם כהה מאוד במהלך פיתוח NBT / BCIP (איור 1). לאורך כל פרוטוקול זה זה קריטי, כי סעיפי הרקמות יישארו מכוסים לחלוטין על ידי נוזל בכל incubations וכי השקופיות נשמרות רמה לחלוטין. בנוסף, סעיפי הרקמות צריכים להישאר מכוסים לחלוטין על ידי HybriSlips במהלך incubations הארוך כגון צעדי הכלאה ו הדגירה נוגדנים, כדי למנוע אובדן נוזלים. אם ייבוש חלקי או מלא של קטע רקמה הוא ציין שלא סביר שהדגימות תניב צביעה אופטימלית, אשר לא תאפשר ביטוי מירנה להתפרש בדגימות אלה.
צעדים אחרים בפרוטוקול שבו כיסוי נוזל חיוני הם במהלך proteinase עיכול K וטיפול paraformaldehyde. יש צורך בעיכול זה על מנת לאפשר גישה של חללית מירנה לתוך התאים. אם הכיסוי של הרקמה אינו שלם במהלך דגירה קצרה זה, באזורים שאינם חשופים לעיכול האנזים לא יאפשר כמה שחללית להיכנס ולהיקשר, וסופו של דבר לא כתם כמו בקדרות כאחרת בתחומים אחרים של הרקמה. בעת החלת פרוטוקול זה לסוגים אחרים של רקמות, משך עיכול K proteinase ייתכן שיצטרך להיות מותאם. קיבעון paraformaldehyde הבא הוא גם חיוני כדי למנוע אובדן של miRNAs הבא permeabilization.
NT "> משך פיתוח NBT / BCIP הוא גם משתנה חשוב לשליטה. מצאנו כי incubations NBT / BCIP של יותר מ -4 או 5 שעות חפץ רקע משמעותי מתחיל להתפתח ברקמות מששו עם בדיקות הבקרה המקושקשת-miR ( איור 2 א). ארבע שעות של פיתוח NBT / BCIP מספיקות לצורך זיהוי של מטרות הבדיקה באו לידי ביטוי בשפע גבוה יחסית, כגון שליטת U6 הקטנה RNA החיובי (איור 2). Incubations יותר אינו מופיע כדי לאפשר ביטוי ברמה נמוכה נוסף להיות מזוהה, ולא זה יכול פשוט התוצאה חפץ רקע מוגבר.זה מוביל לנושא החשוב של יכולת הגילוי של miRNAs הביע נמוך יותר. למרות שאנחנו מצאנו בדיקות מצומדות digoxigenin '5 כדי לספק לנו רגישות זיהוי מספיק עבור היישומים שלנו בכליות. פיתוח הצבע המבוסס phosphatase אלקליין מאפשר לחלקיקי אות מרובים כדי למדוד לEACמולקולת שעות של בדיקה, עם זאת כמה מירנה רמה נמוכה עדיין לא יכולה להיות לזיהוי. Exiqon פיתח בדיקות מירנה שמתויגות בשני 5 'ו 3' מסתיים ומאפשר לפוטנציאל לפעמי פיתוח colorimetric לכל מולקולת microRNA. בעוד במעבדה שלנו לא בדקה בדיקות אלו, השימוש שלהם ברקמות כליה עם פרוטוקול דומה כבר דווח 8.
פרוטוקול בסיסי זה יכול להיות מותאם לסוגי רקמות אחרים ובדיקות מירנה על ידי אופטימיזציה של proteinase זמן עיכול K, ריכוזי הבדיקה מירנה, טמפרטורות הכלאה, וזמני פיתוח NBT / BCIP. כמו כן ניתן להשתמש בחלק הראשון של הפרוטוקול בשילוב עם נוגדני ניאון ברקמות שבי autofluorescence הוא כראוי נמוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני בריאות הלאומיים של ארה"ב מעניק HL082798 וHL111580.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xylenes | Sigma | 534056 | |
| Ethanol | Ultra Pure | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Life Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Citric Acid | Sigma | C2404 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparin | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3’ DIG- miRNA probe | Exiqon | miR dependent-05 | |
| 3’ DIG- Scrambled miR probe | Exiqon | 99004-05 | |
| 3’ DIG- U6 miR probe | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenin-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Coverslips | Fisher | Fit to tissue size | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| In-slide Out Hybridization Oven | Boekel | 241000 | |
| Aluminum Tray Assembly | Boekel | C2403973 | |
| Stainless Steel Rack Insert | Boekel | C2403754 |
References
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors. J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).
- Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis. Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).
- Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1. Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).
- Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes. Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).
- Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).
- Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).
- Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β. Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).
- Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells. Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).
- Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).
- Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer. Urol. 75 (4), 835-841 (2010).
- Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21. Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).
- Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension. 122 (10), 439-447 (2012).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes. Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).
- Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).
- Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis. Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).
