Summary
Een protocol te isoleren, cultuur en imago eilandje cel clusters (ICC), afkomstig van menselijke foetale pancreas cellen wordt beschreven. De methode beschrijft de stappen die nodig zijn om ICC te genereren uit weefsel, cultuur als monolagen of in suspensie als aggregaten, en voor markers van proliferatie en alvleesklier cel beslissingen over het lot.
Abstract
Al bijna 30 jaar, hebben wetenschappers aangetoond dat de menselijke foetale ICC getransplanteerd onder de nier capsule van naakt muizen uitgegroeid tot functionerende endocriene cellen, zoals blijkt uit een significante toename van circulerende humane C-peptide na glucose stimulatie 1-9. Echter in vitro ontstaan van insuline producerende cellen uit menselijke foetale ICC is laag 10; resultaten die doet denken aan de recente experimenten uitgevoerd met menselijke embryonale stamcellen (hESC), een hernieuwbare bron van cellen die grote belofte als potentiële therapeutische behandeling voor diabetes type 1 te houden. Zoals ICC, transplantatie van gedeeltelijk gedifferentieerde hESC genereren glucose responsieve, insuline producerende cellen, maar in vitro ontstaan van insuline producerende cellen van hESC is veel minder robuust 11-17. Een volledig begrip van de factoren die de groei en differentiatie van endocriene voorloper cellen beïnvloeden zal waarschijnlijk vereisen data gegenereerd uit zowel ICC en hijSC. Terwijl een aantal protocollen bestaan insulineproducerende cellen genereren van hESC in vitro 11-22, veel minder aanwezig voor ICC 10,23,24. Een deel van dit verschil waarschijnlijk afkomstig is van de problemen van het werken met menselijke foetale alvleesklier. Hiertoe, zijn we blijven voortbouwen op bestaande methoden om foetale eilandjes te isoleren uit menselijke pancreases met zwangerschapsduur leeftijd variërend 12-23 weken, groeien de cellen als een monolaag of in suspensie, en voor celproliferatie, alvleesklier markers en menselijke hormonen waaronder glucagon en C-peptide. ICC's gegenereerd door de in C-peptide vrijlating onderaan resultaat beschreven na transplantatie onder de nier capsule van naakt muizen die vergelijkbaar zijn met C-peptide niveaus verkregen door transplantatie van verse weefsel 6 zijn protocol. Hoewel de voorbeelden hier gepresenteerde richten op de pancreatische endoderm proliferatie en β cellen ontstaan, kan het protocol worden gebruikt voor andere aspecten van pancreatische ontwikkeling bestuderen, Waaronder exocriene, ductale en andere hormoon-producerende cellen.
Introduction
Een primaire beperking tot cel-gebaseerde insuline vervangende therapieën in type 1 diabetes is het gebrek aan menselijke eilandjes beschikbaar voor transplantatie. Het vermogen om de proliferatie en differentiatie van humane pancreatische voorlopercellen regelen in insulineproducerende cellen die voldoen aan de metabolische behoeften van een insuline-deficiënte toestand blijft een belangrijke bouwsteen voor celtherapie behandeling van type 1 diabetes.
Tot de komst van hESC afgeleid insulineproducerende cellen, humane foetale alvleesklier endocrine cellen of voorlopers werden als potentiële bronnen van cellen voor klinische transplantatie. Hoewel de wetenschappelijke en regelgevende landschap is veranderd in de afgelopen jaren, blijft er een absolute noodzaak om te begrijpen hoe de menselijke foetale pancreas ontwikkelt. Veel nu bekijk therapeutisch gebruik van menselijke foetale cellen onwaarschijnlijk, maar als effectieve en veilige methoden om de cellen te breiden werden vastgesteld, therapeutische gebruik van deze cellen kunnen agAïn worden onderzocht. Een belangrijke hindernis die overblijft is dat in vitro transformatie van menselijke foetale cellen de alvleesklier aggregaten (ICC) in glucose responsieve, insuline afscheidende endocriene cellen is momenteel een inefficiënt proces. Hoewel veel werk over bijna 30 jaar is opgehelderd en afgebakend het expressieprofiel van transcriptiefactoren die nodig zijn voor de ontwikkeling van de endocriene pancreas, blijven er gaten in onze kennis over hoe temporele expressie van transcriptiefactoren wordt gereguleerd en gerelateerd aan celfunctie.
Tot de komst van hESC afgeleid insulineproducerende cellen, humane foetale alvleesklier endocrine cellen of voorlopers werden als potentiële bronnen van cellen voor klinische transplantatie. Hoewel de wetenschappelijke en regelgevende landschap is veranderd in de afgelopen jaren, blijft er een absolute noodzaak om te begrijpen hoe de menselijke foetale pancreas ontwikkelt. Velen nu zien therapeutische gebruik van menselijke foetale cellen als onwaarschijnlijk, maar als effectiefen veilige methoden groeien de cellen werden vastgesteld, therapeutische gebruik van deze cellen kunnen opnieuw worden onderzocht. Een belangrijke hindernis die overblijft is dat in vitro transformatie van menselijke foetale cellen de alvleesklier aggregaten (ICC) in glucose responsieve, insuline afscheidende endocriene cellen is momenteel een inefficiënt proces. Hoewel veel werk over bijna 30 jaar is opgehelderd en afgebakend het expressieprofiel van transcriptiefactoren die nodig zijn voor de ontwikkeling van de endocriene pancreas, blijven er gaten in onze kennis over hoe temporele expressie van transcriptiefactoren wordt gereguleerd en gerelateerd aan celfunctie.
Onlangs heeft het veld stamcel de geaccumuleerde kennis tijdelijke transcriptiefactor expressie tijdens de ontwikkeling eilandje gebruikt voor de productie van cellen die de markers van rijpe endocrine cellen tot expressie drijven. Hoewel ontstaan van insuline producerende cellen van hESC en geïnduceerde pluripotente cellen (IPSC) aanzienlijk heeft gemaakt ensignificante vooruitgang in de afgelopen jaren de meest effectieve protocollen vereisen twee verschillende differentiatie fasen: 1) een eerste in vitro differentiatie cellen die alvleesklier precursor transcriptiefactoren, gevolgd door 2) in vivo rijping na transplantatie genereren - een zogenaamde "black box "periode. Om vooruit te gaan, de vooruitgang in het begrijpen van de biologie onderliggende eilandje rijping in vivo, ongeacht de bron van cellen, moet worden begrepen op een biochemisch niveau. De overeenkomst tussen de resultaten ICC en hESC resultaat suggereert dat een aantal kritische biochemische processen die de overgang van menselijke pancreatische voorlopercellen in rijpe, glucose responsieve, insuline afscheidende cellen in vitro reguleren blijven onbekend. Een centraal onderdeel van dit inzicht zal zijn om nieuwe methoden te ontwikkelen om functionele endocriene celpopulaties ontlenen pancreas voorlopercellen en hESC zullen niet alleen biochemische ca. vereisenoaches dat de rijping gebeurtenissen, maar methoden om de veranderingen te analyseren helderen.
Waarom geloven we dat de beeldvorming van humane foetale cellen de alvleesklier is een cruciaal aspect van het identificeren van veranderingen in eilandje rijping? Het antwoord ligt deels in de historische zoektocht naar insuline-producerende cellen te genereren. Zowel model en weefsel-kweeksystemen voor alvleesklier precursoren en eilandjes hebben toegestaan onderzoekers om de grote verschillen die er bestaan tussen rijping van dierlijke eilandjes en menselijke eilandjes in vitro onderzoeken. Een beperking bij het navigeren foetale pancreas ontwikkeling is dat de zwangerschapsduur die legaal kan worden gebruikt leiden tot heterogene cel aggregaten. Hoewel de geïsoleerde foetale menselijke cellen lijken eilandjes, kleuring na in vitro kweek van zwangerschapsduur 9-23 weken blijkt minder dan 15% bevatten merkers voor endocrine cellen, met de meeste cellen niet kleuring op eilandje hormonen. Na transplantatie envivo rijping, een grote meerderheid van de cellen brengen endocriene markers 6,25. De resultaten van deze studies worden om herhaald met hESC differentiatie protocollen die alleen kunnen bescheiden populaties van enkele hormoon positieve endocrine cellen genereren na in vitro differentiatie. In vitro werkwijzen populaties hormoon positieve cellen verbeteren waarschijnlijk inzicht in in vivo eilandje rijping. Bovendien, het begrijpen van de moleculaire gebeurtenissen die de menselijke foetale ontwikkeling van de alvleesklier rijden zal waarschijnlijk verbeteren inspanningen om insuline-producerende cellen afkomstig van hESC en verder af te bakenen van de mechanismen die de β-cel regeneratie en alvleesklier cel transdifferentiation reguleren.
De overeenkomsten tussen humane foetale alvleesklier cel en hESC rijping kan worden uitgebreid tot celfunctie. Zoals muizencellen zowel menselijke foetale cellen en gedifferentieerde hESC zijn niet insuline vrij in reactie op glucosena eilandje nieuwvorming in vitro 26,27. Echter, bij transplantatie in naakt muizen en rijping, zowel menselijk eilandje-achtige clusters en insuline producerende cellen, afkomstig van hESC vertonen een endocriene fenotype. Drie maanden na de transplantatie, bijna 90% van de getransplanteerde cellen uit beide populatie insuline positief en normaal functioneren zoals bepaald door de afgifte van C-peptide 17,26. Deze resultaten geven aan dat transplantatie biedt context en onbekende signalen dat eilandje rijping te bevorderen. Geoptimaliseerde beeldvormingsprotocollen, zoals hier beschreven, voor menselijke foetale pancreascellen zal helpen bij het zoeken naar factoren die moduleren en rijping versnellen identificeren. Fundamentele biochemische onderzoek van menselijke foetale pancreascellen en hESC gedifferentieerd naar een endocriene afstammingslijn in dit stadium van ontwikkeling is essentieel voor het meten van de efficiëntie van rijping.
Het volgende protocol, beschreven in Figure 1, verschaft de huidige werkwijze voor de isolatie van humane foetale pancreascellen, zogenaamde ICC van gehele menselijke foetale pancreas en beeldvorming van deze cellen. Dit protocol heeft een initiële bereiding van cellen uit weefsel, dat vervolgens kan worden gekweekt als een monolaag of suspensie. Bereiding van cellen voor beeldvorming van veel gebruikte merkers endocriene cel proliferatie en maturatie beschreven.
Generatie en beeldvorming van ICC in de afwezigheid of aanwezigheid van diverse chemische modificerende middelen verschaft een snelle werkwijze, vergeleken met transplantatie modellen te helpen identificeren omstandigheden en verbindingen die rijping van humane foetale pancreascellen versnellen in volledig functionele exocriene, ductale of cultuur hormoon producerende cellen de alvleesklier.
Protocol
Merkt alvorens aan de slag:
- Foetale alvleesklieren werden verkregen uit de aangeboren afwijkingen Research Laboratory, University of Washington (Seattle, Washington, USA), die het weefsel geoogst. Informed consent voor weefseldonatie, opslag en het gebruik van de monsters werd uit de donoren verkregen door het centrum. Het protocol toestemming verklaring werd schriftelijk verstrekt en de Universiteit van Californië, San Diego Human Research Protections Program goedgekeurd de gehele studie (Protocol # 081237XT).
- Het is essentieel om zowel de foetale pancreas en de container met de alvleesklier op ijs gedurende de gehele procedure te handhaven. De dissociatie en digestie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd.
- Stuur de kliniek waar de foetale pancreas werd verkregen uit de buffer voor opslag en transport van de alvleesklier. (RPMI-1640 + 10% normaal humaan serum (NHS), 300 mM trehalose SG, penicilline / streptomycine en fungizon).
1. Dissectie van foetale alvleesklier
- Los 5 mg RT collagenase XI in HBSS tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 mg / ml. Filter steriliseer de oplossing met een 0,22 micron spuitfilter in een steriele (geautoclaveerd) scintillatieflesje en bewaar bij 4 ° C. In een weefselkweek kap, uiteengezet 2 steriele petrischaaltjes, een steriele kleine schaal (als een smeltkroes niet beschikbaar is, kan een kleine beker worden vervangen), gesteriliseerde schaar en pincet. Voeg 2 ml HBSS een petrischaal de alvleesklier wassen. Zuig vloeistof uit de buis met de foetale pancreas, laat ongeveer 1 ml.
- Verwijder de alvleesklier met een pincet in de 60 mm petrischaal zonder HBSS. Voor deze experimenten worden foetale ICC gegenereerd uit verse pancreata met gestational leeftijd variërend 9-23 weken. Isolatie van pancreata op jongere leeftijd gestionational moeilijk vanwege de grootte van de alvleesklier. Het protocol is waarschijnlijk van toepassing op zwangerschapsduur na 23 weken, maar acquisitie van pancreata na deze tijd moeilijk is vanwege de federale (VS) beperkingen. Af en toe, de foetale pancreas komt met milt-, vet-of bindweefsel bevestigd van de oorspronkelijke dissectie. De extra weefsel gemakkelijk met het blote oog en dienen van de alvleesklier voordat het protocol worden verwijderd.
- Spoel de alvleesklier in een minimaal volume koude HBSS (~ 0,5 ml) in de petrischaal.
- Verplaats de schoongemaakte alvleesklier om de kleine steriele smeltkroes met steriele pincet en plaats in een ijsemmer. Plaats de kroes in een houder voor een centrifugebuis van 50 ml en met behulp van 2 scharen, krachtig snijd de alvleesklier gedurende enkele minuten. (Gewoonlijk 2-5 minuten, maar het is afhankelijk van de grootte en stevigheid van het weefsel). Cutting techniek is belangrijk. Houd de ene kant van de schaar in een vaste positie te bewegen alleen het tegenovergestelde handgrepen. De uiteinden van de schaar moet rusten op de bodem van de kroes. Ga verder met de snelle schaar motie om de pancreas te breken in kleinestukken. Hoe kleiner de stukjes weefsel, hoe beter de collagenase werken.
- Voeg 1,5 ml HBSS + de gehakte alvleesklier om de flacon met de collagenase en plaats in een waterbad shaker set tot 37 ° C bij 200 rpm tot maximaal 10 minuten. Controleer niet vaker dan een keer tijdens de eerste 5 minuten. Spijsvertering is afhankelijk van het weefsel kwaliteit kan slechts 6 minuten voldoende. Het eindpunt is wanneer de deeltjes klein en uniform.
- Vul het flesje (10-15 ml) met koud HBSS de collagenase activiteit te stoppen. Plaats op ijs en laat de bosjes te regelen voor 10 minuten. Vaak op dit moment sommige celdood heeft plaatsgevonden en DNA wordt vrijgegeven in de media. Dit kan de media 'draderig' maken; in dit geval, voeg 100 ul DNase (10 mg / ml voorraad) aan de oplossing.
- Nadat het weefsel in de scintillatieflesje is geregeld voor 10 min, zuigen van de toplaag waardoor het iets minder dan de helft (7-8 ml). Breng de cellen om een 15 ml conische buis, Voeg 5 ml HBSS. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g.
- Zuig het HBSS en resuspendeer de cellen in 5 ml medium dat RPMI-1640, glutamax, 10% normaal humaan serum (NHS), 10 mM HEPES pH 7,2, penicilline / streptomycine en fungizon. Plaat op 60 mm petrischaal. Voor onderzoekers proberen β te genereren, voeg HGF (10 ng / ml eind) aan het medium. Bovendien, een aantal groepen hebben aangetoond dat aanvulling van het kweekmedium de incretine hormoon GLP-1 verhoogt ook β-cellen 28. De cellen moeten worden achtergelaten in suspensie voor 72 uur te aggregeren en te vormen ICC.
- Na 72 uur in suspensie kunnen cellen worden uitgeplaat op de matrix van de humane cellijn HTB9 matrix zoals eerder 29 beschreven. Ongeacht de groeiomstandigheden, moeten de media worden veranderd om de 48 uur.
2. Immunofluorescentie van merkers van Endocriene celproliferatie en rijping in ICC in suspensie gegroeid, Monolayer, of op glas Coverslips
- Om celproliferatie te bepalen, wordt BrdU labeling van zowel hechtende cellen of cellen in suspensie uitgevoerd gedurende 12 uur voorafgaand aan fixatie PFA. BrdU reagens verdund 1:100 en filter gesteriliseerd in RPMI-1640, glutamax, 10% NHS, 10 mM HEPES pH 7,0, penicilline / streptomycine en fungizon.
- Voor cellen in suspensie: centrifugeren gedurende 5 min bij 300 xg en zuig kweekmedium. Voeg 10 ml PBS te wassen de ICC, centrifuge gedurende 5 minuten bij 300 xg en aspireren. Als het ICC zullen worden ingebed in paraffine, volg facultatief protocol 3,1-3,17 Voor hechtende cellen:. Verwijder kweekmedium en wassen cellen met PBS zoals hierboven beschreven. Fix cellen voor 20 minuten met 4% PFA bij kamertemperatuur, vervolgens tweemaal wassen met PBS. Op dit punt kunnen de platen worden omwikkeld met Parafilm en opgeslagen in PBS bij 4 ° C gedurende 1 week.
- Incubeer de cellen met 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen tweemaal met PBS en toepassen Blocking Buffer (2% doennkey serum, 2% runderserumalbumine, 50 mM glycine verdund in PBS) gedurende 1 uur. Was de cellen met Working Buffer (Blokkeringsbuffer 1:10 verdund). Verdun het antilichaam in werkbuffer. Voor cellen gekweekt op dekglaasjes, verdunnen het antilichaam in 60 ul totaal volume. Voor cellen in een 6-putjes Verdun het antilichaam in 600 ul totaal volume. Om meerdere epitopen vlek, kan een cocktail van antilichamen worden toegepast. Als controle gebruikt IgG of pre immune serum in plaats van specifiek antilichaam. Controlemonsters worden geïncubeerd met controle IgG van dezelfde soort als het primaire antilichaam gebruikt.
- Incubeer het primaire antilichaam ofwel 1,5 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. Zuig het primaire antilichaam en was 3x met Werken Buffer bij RT.
- Verdun het secundaire antilichaam bij 1:200 voor Rhodamine en FITC geconjugeerde antilichamen, 1:500 - 1:1000 voor Alexa geconjugeerde antilichamen. Het is belangrijk op te merken dat alle secundaire antilichamen zijn lichtgevoelig. Bedek de monstersin aluminiumfolie om signaalverlies te voorkomen. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
Optioneel: om de kernen te visualiseren, kan DAPI worden toegevoegd aan 1:500 tijdens de tweede incubatie. Dit is handig voor kwantificering van eiwitexpressie in de totale celpopulatie. - Zuig het secundaire antilichaam en was 3x met Werken Buffer bij RT. Voor cellen gekweekt op een dekglaasje, til het dekglaasje met een tang, terwijl ondergedompeld in de buffer; wassen door onderdompeling in PBS. Voor cellen gekweekt in een 6-wells plaat toevoegen PBS te wassen en zuigen. Op dit moment zijn ze klaar om te onderzoeken onder een omgekeerde microscoop.
- Raak de rand van het dekglaasje voorzichtig op een Kimwipe om zich te ontdoen van overtollige PBS. Voeg een druppel montage gel op een glasplaatje en keer het dekglaasje op de dia. Verwijder overtollig montage gel door aspiratie. Tik op het dekglaasje voorzichtig met de achterkant van een 200 ul pipet tip om luchtbellen te verwijderen.
- Droog bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 20 minuten of O / N bij 4 ° C en onderzocht onder een fluorescentie of confocale microscoop.
3. (Optioneel) immunofluorescentiekleuring van eiwitten uit paraffine ingebedde ICC
- Bereid een 3% agarose-oplossing en laat afkoelen tot 55-60 ° C.
- Breng de ICC geïncubeerd in suspensie een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
- Zuig het medium van de cellen en bevestig met 500 pi 4% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Laat de pellet niet mengen, tenzij de pellet is zeer groot.
- Was de pellet twee keer met 750 pl PBS. Net als de 4% PFA, wordt dit afval als gevaarlijk beschouwd en dienen te worden vernietigd volgens de specificaties van gevaarlijk afval van uw instelling.
- Tik zachtjes tegen de cel pellet los te maken en voeg 150-200 ul van de agarose langs de wand van de 15 ml conische buis.
- Meng door zachtjes te tikken de buis, maar bellen niet vormen.
- Laten stollen bij 4 ° C gedurende 5-10 minuten.
- Gebruik een 21 G naald te verjagende pellet en plaats in een verse 15 ml conische buis.
- Paraffine inbedding en de bereiding van de punten op de dia's kan worden gedaan ter plaatse met een microtoom of door uw core microscopie faciliteiten.
- Deparaffinize weefsel, hydrateren, en wassen met water snel.
- Voeg 0,2 M glycine gedurende 30 min bij RT om het resterende aldehyd blussen.
- Was de dia tweemaal met PBS gedurende 2 minuten elk.
- Voor antigen retrieval, brengen 10 mM citraat buffer (pH 6,0) aan de kook over hete plaat. Dompel de dia's in de buffer, wachten tot het weer aan de kook komen, en wacht 15 minuten.
- Verwijder het bekerglas van de kookplaat. Wacht ongeveer 40 minuten voor de dia afkoelen in de buffer.
- Was de dia tweemaal met H2O gedurende 5 min elk, was de dia tweemaal met PBS gedurende 5 minuten elk blok met 2% normaal ezel serum in PBS gedurende 1 uur.
- Incubeer met primaire antilichaam, verdund tot de juiste concentratie Bruikbare buffer bevattende 0,2% Triton X-100.In het algemeen wordt het primaire antilichaam overnacht geïncubeerd als kleuring voor transcriptiefactoren en 1,5 uur als kleuring op hormonen, merkers van proliferatie en / of differentiatie.
- Volg de stappen 2,3-2,9 hierboven beschreven.
Representative Results
Zorgvuldige voorbereiding van foetale ICC's is cruciaal voor het succes van dit protocol. Representatieve foto's van hoe de cellen gewoonlijk op zoek naar bepaalde tijdstippen na plating zijn weergegeven in figuur 2. Na zuivering, de vers geplateerde cel aggregaten verschijnen als kleine, dun duidelijk clusters die weinig cellen (Figuur 2A) bevatten. Na de eerste 24 uur (figuur 2B), veel van de celgroepen groter worden, maar vele kleine clusters bestaan. Door 48 uur, hebben de clusters aanzienlijk uitgebreid, maar asymmetrisch (figuur 2C) blijven. Bij 72 uur, dient het ICC duidelijk zijn relatief uniform van grootte en vorm (figuur 2D). Het is op dit punt dat de cellen ofwel worden uitgeplaat op matrices, zoals HTB-9, 24 uur vóór immunofluorescentie of laten groeien van een 72 uur in de afwezigheid of aanwezigheid van chemische stoffen of geneesmiddelen die de expressie van genen kunnen veranderen nodig voor alvleesklier endocriene cel gENERATIE. Figuur 3 hoogtepunten van een aantal veel gebruikte antilichamen om ofwel ICC proliferatie of differentiatie naar alvleesklier endoderm beoordelen. In figuur 3A, zijn ICC uitgeplaat op HTB-9, gekweekt gedurende 4 dagen en gekleurd voor Pdx1, een kritische marker van pancreatische ontwikkeling. Hoewel in vitro kleuring van 'ICC routinematig wordt uitgevoerd in ons laboratorium, vaker, foetale ICC worden getransplanteerd onder de nier capsule van naakt muizen en toegestaan om te groeien en te differentiëren in vivo 6,9,30-32. Op gespecificeerde tijdstippen na transplantatie worden de muizen gedood en de nieren die het getransplanteerde ICC wordt verwijderd, in 4% paraformaldehyde, en ingebed in paraffine. Sequentiële 5-um secties worden gegenereerd op de locatie met behulp van een microtoom of door een kern microscopie faciliteit. Epitoop ontmaskering en kleuring van eiwitten uit paraffine-ingebed weefsel voor immunofluorescent microscopie wordt beschreven in een facultatief protocol 3,10-3.. 17 In figuur 3B, getransplanteerde ICC werden gekleurd met de epitheliale cel merker cytokeratine pan (PanCK, groen) en Ki67 (rode) celproliferatie te beoordelen. In een ander voorbeeld, zowel humane insuline (groen) en glucagon (rood) werden gedetecteerd na transplantatie en rijping onder de nier capsule van een naakt muis (Figuur 3C).
Figuur 1. Stroomdiagram van menselijke foetale ICC voorbereiding en kleuring voor immunofluorescentie.
Figuur 2. Vertegenwoordiger foetale ICCs voorbereiding op 0, 24, 48, of 72 uur na plating (A) ICC.in suspensie werden onmiddellijk na plating afgebeeld, (B) 24 uur na plating, (C) 48 uur na plating, of (D) 72 uur na plating. Schaal bar voor AC, 10x vergroting = 300 micrometer, schaal bar voor D, 20 vergroting = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
.. Figuur 3 Immuunfluorescentie van vergulde ICC Routinematig ICC's worden afgebeeld voor (A) de pancreas endoderm marker Pdx1 (groen), (B) endocriene cellen (pan-CK, groen) en proliferatie (Ki67, rood), (C) insuline (groen) en glucagon (rood). Schaal bar voor AC, 40x vergroting = 20 micrometer.
Discussion
De hier gepresenteerde methoden in staat een om ICC te genereren uit humane foetale pancreas beeld en vervolgens voor markers van celproliferatie en alvleesklier endoderm. Het proces van menselijke foetale pancreas dissociatie vereist ongeveer 90 minuten, gevolgd door 72 uur ICC vormingstijdstip, een aanpak die aanzienlijk van protocollen β cel progenitorcellen isoleren van muis. De hier gepresenteerde protocol verschaft een reproduceerbare werkwijze waarmee de onderzoeker foetale pancreas ontwikkeling verkennen. Twee verschillende longitudinale studies kunnen worden uitgevoerd. Ten eerste kan het potentieel functionele pancreas celtypen (ductale cellen, exocriene cellen en hormoon positieve cellen) produceren van verschillende zwangerschapsduur worden geëvalueerd na transplantatie. Ten tweede kan ICC uit een zwangerschapsduur worden in kweek, behandeld met geselecteerde farmacologische agentia en getransplanteerd op verschillende tijdstippen tijdens ICC kweek verschillen ontdekkenin cel lot. Met de enorme inspanningen momenteel gericht op hESC differentiatie in insuline producerende cellen, worden de problemen in verband met insuline uitscheiding in reactie op fysiologische stimuli weer tot leven gebracht. Human ICC bieden een unieke modelsysteem om dit cruciaal aspect van foetale pancreas celproliferatie en β cel ontwikkeling te bestuderen.
Zoals bij elk protocol om cellen te isoleren uit weefsels, details zijn essentieel voor succes. Een aantal parameters nog buiten de controle van het laboratoriumpersoneel die het experiment uitvoert. Twee problemen van dit laboratorium zijn de slechte kwaliteit van het uitgangsmateriaal en de levering van niet-pancreas weefsel. Gezond foetale pancreas weefsel is stevig om een schaar te snijden. Als het weefsel snijdt te gemakkelijk, is een teken dat de pancreasenzymen begonnen de alvleesklier verteren zelf. Dit is er helaas geen herstel en de voorbereiding is best geannuleerd. Zelden is een inervaren technicus verwijderen van de pancreas gedeelten van de darm verwarren van de alvleesklier. Deze monsters zullen veel meer elasticiteit dan een pancreas en een opmerkelijke lumen zullen aanwezig zijn. Nogmaals, deze monsters worden weggegooid.
Wanneer het protocol hierboven wordt gevolgd zoals beschreven, zijn er zelden problemen die zich voordoen om het isolement te werpen off track. Een paar punten om te onthouden voor een soepele isolatie zorgen, met name, te scherpe schaar voor nauwkeurige alvleesklier snijden gebruiken en zorg ervoor dat elk weefsel monster te groot is om te verteren niet verlaten. Als de bezuinigingen zijn niet klein genoeg is, dan is de collagenase niet doeltreffend werkt, en enkele ICC's worden gevormd. Omgekeerd, wanneer het gebruik van een nieuwe partij van collagenase, beginnen met een vergelijkbaar niveau als IE (internationale eenheden) voor de spijsvertering, zoals eerder gebruikt. Echter, verminderen de incubatietijd zodat via vertering niet optreedt. Deze techniek oplossen van problemen zorgt ervoor dat de IE etiket niet aanzienlijk verschillen van partij tot batch.
Genomen in perspectief, deze techniek voor het isoleren van foetale ICC relatief standaard in het veld. De meeste laboratoria bevestigden onze bevindingen dat toevoeging van HGF aan de media helpt de cellen overleven en vermenigvuldigen 33. Samengevat hebben we een methode om foetale ICC te isoleren verse pancreata zwangerschapsduur variërend 9-23 weken ontwikkeld. De cellen kunnen worden gekweekt als een monolaag of suspensie voor experimenten endocriene pancreas transcriptiefactoren en humane insuline visualiseren.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het California Institute for Regenerative Medicine (RB3-02266) en de NIH (DK54441).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trehalose SG | Hayashibara | Trehalose SG | |
| Collagenase XI | Sigma | C-9407 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 24020-117 | |
| RPMI 1640 with glutamate | Life Technologies | 11879020 | no glucose or HEPES |
| Human AB Sera, Male Donors | Omega Scientific | HS-30 | |
| Fungizone | Life Technologies | 15290018 | |
| Gentamicin Solution 50 mg/ml | Invitrogen | 15750060 | |
| 1 M Hepes, pH 7.0 | Life Technologies | 15630080 | |
| Penicillin/streptomycin 100x solution | Life Technologies | 15070063 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Peprotech | 100-39 | |
| GLP-1 | Peprotech | 130-08 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| Dnase | Sigma | DN25 | |
| Sterile Petri dishes, 60 x 15 mm; stackable, venting ribs | Spectrum Laboratory Products, Inc. | D210-13 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| BrdU | Life Technologies | 00-0103 | |
| anti-insulin (mouse monclonal; 1:1,000) | Sigma | I2018 | |
| anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2,000) | Sigma | G2654 | |
| PDX1 (mouse monoclonal) | Novus Biologicals | NBP1-47910 | |
| PDX1 (goat polyclonal) | AbCam | 47383 | |
| PDX1 (rabbit polyclonal) | AbCam | 47267 | |
| Alexa Fluor 546 (rabbit) | Invitrogen | A11010 | |
| Alexa Fluor 546 (mouse) | Invitrogen | A11003 | |
| Alexa Fluor 488 (rabbit) | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 488 (mouse) | Invitrogen | A11001 | |
| Ki67 | Lab Vision Neomarkers | RM 9016-50 | |
| pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) | Immunotech | 2128 | |
| CK19 | AbD Serotech | MCA 2145 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| HTB9 cell line | ATCC | 5637 | see Beattie 1997 reference to generate matrix |
| Agarose | Sigma | A-6013 |
References
- Tuch, B. E., Ng, A. B. P., Jones, A., Turtle, J. R. Histologic differentiation of human fetal pancreatic explants transplanted into nude mice. Diabetes. 33, 1180-1187 (1984).
- Tuch, B. E., Grigoriou, S., Turtle, J. R. Growth and hormonal content of human fetal pancreas passaged in athymic mice. Diabetes. 35, 464-469 (1986).
- Hullett, D. A., Falany, J. L., Love, R. B., Butler, J. A., Sollinger, H. W. Human fetal pancreas: Potential for transplantation. Transplantation Proceedings. XIX (1), 909-910 (1987).
- Hullett, D. A., Bethke, K. P., Landry, A. S., Leonard, D. K., Sollinger, H. W. Successful long-term cryopreservation and transplantation of human fetal pancreas. Diabetes. 38, 448-453 (1989).
- Tuch, B. E. Reversal of diabetes by human fetal pancreas. Transplantation. 51, 557-562 (1991).
- Beattie, G. M., Lopez, A. D., Otonkoski, T., Hayek, A. Transplantation of human fetal pancreas: fresh vs. cultured fetal islets or ICCS. J Mol Med. 77, 70-73 (1999).
- Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
- Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Joglekar, S. V., Hardikar, A. A. Human fetal pancreatic insulin-producing cells proliferate in vitro. J Endocrinol. 201, 27-36 (2009).
- Kayali, A. G., et al. The SDF-1alpha/CXCR4 Axis is Required for Proliferation and Maturation of Human Fetal Pancreatic Endocrine Progenitor Cells. PLoS One. 7, (2012).
- Otonkoski, T., et al. Hepatocyte growth factor/scatter factor has insulinotropic activity in human fetal pancreatic cells. Diabetes. 43, 947-953 (1994).
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24, 1392-1401 (2006).
- Xu, X., et al. Endoderm and pancreatic islet lineage differentiation from human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells. 8, 96-107 (2006).
- Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1940-1953 (2007).
- Shim, J. H., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate. Diabetologia. 50, 1228-1238 (2007).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26, 443-452 (2008).
- Van Hoof, D., D'Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lees, J. G., Tuch, B. E. Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny. Regen Med. 1, 327-336 (2006).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61, 2016-2029 (2012).
- Bai, L., Meredith, G., Tuch, B. E. Glucagon-like peptide-1 enhances production of insulin in insulin-producing cells derived from mouse embryonic stem cells. J Endocrinol. 186, 343-352 (2005).
- Semb, H. Definitive endoderm: a key step in coaxing human embryonic stem cells into transplantable beta-cells. Biochem Soc Trans. 36, 272-275 (2008).
- Van Hoof, D., Mendelsohn, A. D., Seerke, R., Desai, T. A., German, M. S. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm in patterned size-controlled clusters. Stem Cell Res. 6, 276-285 (2011).
- Beattie, G. M., Otonkoski, T., Lopez, A. D., Hayek, A. Maturation and function of human fetal pancreatic cells after cryopreservation. Transplantation. 56, 1340-1343 (1993).
- Sandler, S., et al. Tissue culture of human fetal pancreas. Effects of nicotinamide on insulin production and formation of isletlike cell clusters. Diabetes. 38 Suppl 1, 168-171 (1989).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Cirulli, V., Mally, M. I., Hayek, A. Pancreatic regeneration. Sharvetnick, N., Landes, R. G. , (1997).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Mally, M. I., Ricordi, C., Hayek, A. Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells. J Clin Invest. 92, 1459-1466 (1993).
- Xie, R., et al. Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 224-237 (2013).
- Hardikar, A. A., et al. Functional maturation of fetal porcine beta-cells by glucagon-like peptide 1 and cholecystokinin. Endocrinology. 143, 3505-3514 (2002).
- Beattie, G. M., Cirulli, V., Lopez, A. D., Hayek, A. Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells. J Clin Endocrinol Metab. 82, 1852-1856 (1997).
- Beattie, G. M., et al. Trehalose: a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage. Diabetes. 46, 519-523 (1997).
- Hayek, A., Beattie, G. M. Experimental transplantation of human fetal and adult pancreatic islets. J Clin Endocrinol Metab. 82, 2471-2475 (1997).
- Otonkoski, T., Beattie, G. M., Lopez, A. D., Hayek, A. Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant. Proc. 26, 33-34 (1994).
- Beattie, G. M., et al. A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function. Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).
