I denna video artikeln beskriver vi en automatiserad analys för att mäta effekten av hunger eller mättnad på luktberoende mat sökbeteende i den vuxna bananflugan Drosophila melanogaster.
För många djur, främjar hunger förändringar i luktsystemet på ett sätt som underlättar sökandet efter lämpliga livsmedel källor. I denna video artikeln beskriver vi en automatiserad analys för att mäta effekten av hunger eller mättnad på luktberoende mat sökbeteende i den vuxna bananflugan Drosophila melanogaster. I en ljustät låda belyst med rött ljus som är osynligt för bananflugor, en kamera kopplad till anpassade datainsamling programvara övervakar positionen för sex flugor samtidigt. Varje fluga är begränsad till vandra i enskilda arenor som innehåller en mat lukt i centrum. Test arenor vilar på en porös våning som fungerar för att förhindra lukt ackumulering. Latens för att lokalisera luktkällan, ett mått som speglar lukt känslighet under olika fysiologiska tillstånd, bestäms av programvaruanalys. Här diskuterar vi de kritiska mekanik för att driva detta beteende paradigm och täcka specifika frågor om fluga loading, luktförorening, analystemperatur, datakvalitet, och statistisk analys.
Staterna av hunger främjar två typer av begärs beteenden: mat sök-och konsumtions 1 mat. Denna enkla beteendeanalys är användbar för att studera kemotaktiska beteenden i samband med födosök 2,3. Specifikt, följer den fluga läge, gånghastighet och latens att hitta en livsmedels lukt mål. Latens för att hitta mat tjänar som mått för att mäta förändringar i känslighet flugans luktdetektionssystem nedströms förändringar i sin interna appetitive tillstånd. En manuell version av denna analys har tidigare använts för att visa GABA-B-receptorsignalering är viktigt för lukt lokalisering beteenden i vuxna flugor 3. Den nuvarande automatiserade versionen av analysen bidrog till studiet av hur kort neuropeptid-F (sNPF) signalering omformar lukt kartan i Drosophila och influenser appetitive beteenden 2.
Provningen utförs på en mörk, kontrollerad temperatur och luftfuktighet rum. Digitalvideokameror som anges ovan de klara akryl testplattor spårar flugor backlit av 660-nm LED-belysning. Information från kameran bearbetas i realtid av en dator stationerad bredvid testområdet. Vi använder datainsamling programvara för att spela in och spara koordinaterna för flyga positioner under testperioden.
I detta paradigm, är ämnet släpps ut i en arena som innehåller en livsmedels lukt i centrum, lukt objektet skapar en mat lukt lutning i arenan som inducerar mat sökbeteende i gylfen. Ett liknande lukt sökprotokoll har tillämpats mot studier av chemosensation i enstaka Drosophila larver 7. Medan andra beteendemässiga analyser såsom fyra fälts olfactometer 4,5 eller t-labyrint 6 utvärdera lukt aversion eller attraktion beteenden är detta paradigm bäst lämpade för att utvärdera luktkänslighet och kemotaxi beteenden.
Flera viktiga fördelar följa denna assay. Först tillåter det snabba förvärv av stora datamängder, eftersom datainsamling och analys är oftast automatiserade. För det andra, isolerar denna analys och mäter beteendet hos enskilda flugor, vilket eliminerar sociala lukt ledtrådar som kan påverka deras beteende. För det tredje, enkelheten i protokollet och enkel experimentell design gör analysen effektiv och lätt att lära andra.
Dessutom kan denna analys användas för att ytterligare undersöka neurala kretsar underliggande mat sökning beteende genom att kombinera det med den omfattande genetiska verktyg tillgängliga för Drosophila melanogaster 8. Targeted expression av transgener som tystnad eller exciterar neuroner kan uppnås med verktyg såsom GAL4-UAS-systemet såväl som UAS-shibire TS1, UAS-tetanus-toxin, och UAS-TRPA1 (B) transgener 9-12.
I detta protokoll, beskriver vi en steg-för-steg-förfarande för mat sökbeteende analysen. Förutom livsmedelsrelaterade lukter, kan det också vara anpassad för att studera flugan förmåga att lokalisera andra luktobjekt. Till exempel kan den tillämpas mot studiet av mate lokalisering beteende manliga flugor 3 Det finns flera ytterligare överväganden för detta protokoll som vi kommer att nämna här om detta förfarande.:
Först bestämmer uppfödning temperaturen hur l?…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av forskningsanslag till JWW från National Institute of Health (R01DK092640) och National Science Foundation (0.920.668).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Apple Cider Vinegar | Spectrum | commercially available | |
Agarose, Type VII | Sigma-Aldrich | A0701 | low gelling temperature agarose |
Acrylic Testing Plate | custom | Plate contains 6 arenas. Each arena is 60 mm in diameter 6 mm in height. See testing plate diagrams for specific measurements. | |
LabVIEW V.8.5 | National Instruments | 776670-09 | platform for programs: PositioningTool.vi, FlyTracking–Six Zones.vi NOTE: "elapsed time.vi", "time into file.vi", and "two object detect.vi" are included subroutines that must be available in order for the main data acquisition program "FlyTracking–Six zones.vi" to run. |
LabVIEW Vision 8.5 | |||
LabVIEW Vision Acquisition Software 8.5 | |||
LabVIEW Vision Builder AI 3.5 | |||
Igor Pro V.6 | Wavemetric, Inc. | platform for macro: Data Analysis for Fly Tracking–Six Zones | |
Basler scA1390-17fm | National Instruments | 779980-01 | Digital Camera NOTE: driver for camera available at Baslerweb.com |
8 mm lens | National Instruments | 780024-01 | Lens for Basler Digital Camera |
Ground Glass Diffuser Plate | Edmund Optics | custom | Diffuses light, 25 cm x 30 cm |
US Std. No. 100 | Fischer Scientific | 04-881X | Sieve with nominal opening of 150 μm |
Lighting Option 1 | |||
LED backlight 660 nm (20 cm x 20 cm) | Spectra West | BL47192 | a simpler but more expensive lighting option. |
Power Supply for LED Backlight | Spectra West | ||
Lighting Option 2 | |||
660 nm LEDs | Superbrightleds | RL5R1330 | Wavelength 660 nm (approximately 7 x 7 LED array for a 14.7 inch x 9.75 inch panel) |
Linear DC Power Supply | GW Instek | GPS-1830D | Power supply for LED Panel |
Solderless Breadboard | Digikey | 922354-ND | Breadboard for LEDs |