Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

في الجسم الحي 19 F التصوير بالرنين المغناطيسي لتتبع الخليوي

Published: November 25, 2013 doi: 10.3791/50802
Automatic Translation
1, 2, 2, 2,3, 1, 1, 2
1Department of Tumor Immunology, Nijmegen Center for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center, 2In-Vivo-NMR Laboratory, Max Planck Institute for Neurological Research, 3German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

Summary

نحن تصف بروتوكول العامة لفي الجسم الحي تتبع الخلية باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي في نموذج الفأر مع السابقين الخلايا المسمى الجسم الحي. يتم تضمين بروتوكول نموذجي لوضع العلامات الخلية، وتجهيز الحصول على الصور والكمي.

Abstract

في الجسم الحي 19 F التصوير بالرنين المغناطيسي يسمح تتبع الخلية الكمي من دون استخدام الأشعة المؤينة. بل هو أسلوب موسع التي يمكن تطبيقها على البشر. هنا، نحن تصف بروتوكول عام لوضع العلامات الخلية، والتصوير، ومعالجة الصور. تقنية قابلة للتطبيق على مختلف أنواع الخلايا والنماذج الحيوانية، على الرغم من هنا ونحن نركز على نموذج الفأر نموذجية لتتبع الخلايا المناعية الفئران. وصفت أهم القضايا لوضع العلامات الخلية، وهذه هي ذات الصلة لجميع الموديلات. وبالمثل، يتم سرد المعلمات التصوير الأساسية، على الرغم من أن التفاصيل سوف تختلف اعتمادا على نظام التصوير بالرنين المغناطيسي والإعداد الفردية. أخيرا، ونحن تشمل بروتوكول لمعالجة الصور الكمي. الاختلافات لهذا، وأجزاء أخرى من البروتوكول، يتم تقييمها في قسم مناقشة. استنادا إلى إجراءات تفصيلية وصفها هنا، فإن المستخدم بحاجة إلى التكيف مع بروتوكول لكل نوع محدد الخلية، والتسمية الخلية، نموذج حيواني، والإعداد والتصوير. نلاحظ أن عويمكن أيضا أن تتكيف rotocol للاستخدام البشري، طالما تم استيفاء القيود السريرية.

Introduction

في تتبع الخلايا الحية أمر ضروري لتحسين ورصد العلاجات الخلوية 1. نظرا لطبيعتها موسع، والتصوير يوفر فرصا ممتازة لمراقبة الخلايا في الجسم الحي. التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) هو مستقل من الإشعاعات المؤينة ويسمح القرار التصوير متفوقة والجوهرية النقيض من الأنسجة اللينة. وقد تم بالفعل استخدام تتبع خلية مقرها MRI-سريريا لمتابعة الخلايا الجذعية في مرضى سرطان الجلد 2. ويتم التصوير بالرنين المغناطيسي السريرية التقليدية للخروج على 1 H النواة، موجودة في المياه المتنقلة في الأنسجة. ومن الممكن أيضا لتنفيذ التصوير بالرنين المغناطيسي على نواة نشطة أخرى، مثل C 13 و 19 و 23 F نا. ومع ذلك، فقد تم تطبيقه فقط 19 F التصوير بالرنين المغناطيسي بنجاح في الجسم الحي تتبع الخلية، حيث أنها توفر أعلى حساسية بعد 1 H. غياب التصوير بالرنين المغناطيسي للكشف الذاتية F 19 في الأنسجة يسمح عالية الانتقائية إشارة لالكشف عن عوامل التباين الخارجية 19 F ويسمح الكمي لتركيز الفلور مباشرة من بيانات الصورة. للاطلاع على مناقشة مفصلة عن 19 F التصوير بالرنين المغناطيسي، انظر 3-5. وثمة مسألة رئيسية مع 19 F التصوير بالرنين المغناطيسي هو الحاجة إلى تطوير وتحسين مناسبة تسميات الخلية 19 F، على الرغم من أن وضعت العديد من التسميات، مع وجود اتجاه نحو 6 كلاء المتعدد الوسائط.

ويستند البروتوكول وصفنا هنا على الدراسات التي مجموعاتنا 7-9، بما في ذلك أول المقالات التي وصفت في الجسم الحي الكمية 19 خلية مقرها MRI-F تتبع 10،11. وتتلخص الإجراء العام من تتبع الخلية باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي F 19 في الشكل 1. نحن تصف بروتوكول عام لوضع العلامات والتصوير من الخلايا الجذعية (DCS) باستخدام عامل المشبعة النقيض حسب الطلب 8. بروتوكول التصوير تنطبق بصورة عامة على مختلف أنواع الخلايا، والعلامات والنماذج الحيوانية. الوينبغي اتخاذ نوع من الخلايا والحيوانات النموذج الموصوف هنا فقط كمثال، وبالتالي فإننا لا توفر تفاصيل عن العزلة الخلية ووضع العلامات، وإنما تركز على البروتوكول التصوير. وسوف يكون من الضروري إدخال تعديلات على كل تسمية، نوع من الخلايا، نموذج حيواني، والإعداد والتصوير، وهذه يمكن أن تكون موجودة في الأدب أو قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل من قبل الباحثين. يتم تضمين بعض التعديلات المشتركة في المناقشة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يجب أن تتم جميع التجارب والإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية ذات الصلة وتتوافق مع رعاية الحيوان القياسية والمتطلبات الإنسانية.

1. وسم الخلية (بروتوكول قياسي مع Coincubation)

  1. إضافة 19 F التسمية 8 إلى البلدان النامية غير ناضجة بتركيز 4 mg/10 6 خلايا (في 2 مل متوسطة). دوامة برفق لمزج.
  2. احتضان الخلايا مع التسمية لمدة 3 أيام قبل النضج وحصاد البلدان النامية.
  3. جمع البلدان النامية وإزالة الزائد عن طريق التسمية غسل 3X على الأقل في برنامج تلفزيوني. عد الخلايا.
  4. resuspend في حجم صغير من برنامج تلفزيوني للحقن أو إجراء مزيد من التجارب.

ملاحظة: هذا البروتوكول هو ذات الصلة لهذه البلدان النامية وتسمية معينة. تم تحسين الإجراء في منشور آخر 8 وشملت هنا ليست سوى خطوات لإعداد نموذج لصورة، لأن التركيز من هذا البروتوكول هو على التصوير. Hسينعقد، فإن بروتوكول للعزلة، والثقافة، ووضع العلامات من نوع خلية معينة تحتاج إما أن تكون موجودة في الأدب أو الأمثل من قبل الباحث. ويرد موجز لجميع 19 F التسميات الأخرى التي استخدمت في الأدب أماكن أخرى 6.

2. تحديد 19 F / خلية عن طريق 19 F NMR

  1. وضع عدد معروف من الخلايا المسمى (عادة أكثر من 0.5 × 10 6، أو الرقم الذي ينتج إشارة كافية) في أنبوب NMR.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من حمض trifluoroacetic 5٪ (TFA). إذا كان تردد صدى TFA غير مناسب وذلك بسبب التداخل مع التسمية، استخدم مركب قابل للذوبان البديلة، ويفضل مع واحد 19 F الرنين.
  3. وضع العينة في مطياف الرنين المغناطيسي النووي والحصول على الطيف 19 F. تأكد من أن عرض النطاق الترددي كافية لكل من TFA (المرجعية) وكيل.

ملاحظة: يجب أن تكون طويلة بما فيه الكفاية لTR وULL الاسترخاء من المرجعية والعينة يدور (حوالي 5 مرات خميس الساعة 1 الاسترخاء من أطول T 1 عنصر في الأنبوب، وعادة TR ~ 5-8 ثانية). بعض الطيف تتطلب D 2 O للإشارة قفل تردد. وهناك معيار 19 F الطيف كافية. وسوف تكون هناك حاجة في المتوسط ​​أو أعلى أرقام الخلية واسعة إذا امتصاص الخلية التسمية رديئة أو إذا أرقام الخلية منخفضة. وينبغي أن تركز الطيف بين المرجعية وقمم التسمية ذات الصلة، ما لم يتم إجراء التصحيحات لحساب الإثارة جزئية.

  1. حساب المناطق النسبي تحت قمم المرجعية والعينة (أو ذروة الرئيسي من العينة)، ثم حساب متوسط ​​عدد 19 F ل / خلية في العينة.

ملاحظة: يجب تكرار العملية برمتها، وبلغ متوسط ​​على نطاق واسع بما فيه الكفاية للوصول إلى دلالة إحصائية. ويمكن أيضا أن يتم ذلك باستخدام التحليل الطيفي مباشرة في الماسح الضوئي التصوير بالرنين المغناطيسي. However، لاحظ أن هذا الإجراء يكشف فقط من متوسط ​​19 F التحميل لعدد كبير من الخلايا، وليس التباين بين الخلايا. التحقق من التوحيد امتصاص الخلية يتطلب وجود عنصر الفلورسنت في 19 وكيل F، بحيث يمكن تحليلها أن امتصاص الخلايا باستخدام المجهر أو التدفق الخلوي.

3. اعتبارات لتصميم التجارب - حقن الخلايا

نظرا لحساسية فقيرة نسبيا من 19 F التصوير بالرنين المغناطيسي لتتبع الخلية، نموذج حيواني حيث الخلايا وتوطين أعداد كبيرة من الضروري لنجاح التصوير في الجسم الحي. وتتراوح قيم حساسية نموذجية من 1،000-100،000 cells/voxel/1 ساعة وقت تفحص 6، مع تحميل خلية في نطاق من 10 11 -10 13 ذرات الفلور.

يجب أن يخطط لها عدد وتواتر دورات التصوير بعناية، لأن هذا يؤثر على اختيار مخدر. لاحظ أنه قد لا يكون isoflurane وsuitablه لمدة 19 F التصوير بالرنين المغناطيسي إذا كان تردد 19 F صدى isoflurane وعلى مقربة من هذا المجمع التسمية المستخدمة. isoflurane وربما لا يزال مناسبة إذا كانت جلسات التصوير هي قصيرة بما فيه الكفاية لمنع تراكم كبير. وقد استخدمت العديد من التخدير البديلة في الأدب 10،11؛ يتم تضمين مثال في البروتوكول التصوير. قد تحتاج إلى التخدير يكون الأمثل لسلالات الفئران مختلفة ونماذج المرض.

4. تصميم خارجي 19 F المرجعي

  1. استخدام مرجع خارجي يحتوي على كمية معروفة من 19 F إشارة لتقدير 12. اختيار كثافة إشارة من المرجع أن يكون مقاربا لذلك يتوقع من هذا الموضوع.

ملاحظة: عموما، فمن أبسط إذا كان مركب المرجعية هو نفس التسمية الخلية، لتتناسب مع المعلمات الاسترخاء. إذا تم استخدام تسلسل الطيفية أو متواليات دون توطين المكاني، ثم ميلانompound مع تحول كيميائية مختلفة قد تكون ضرورية.

  1. تعديل وضع وحجم وشكل الإشارة عند الاقتضاء، تعتمد على المنطقة ذات الاهتمام (ROI). ملاحظة: ومن المسلم به عموما أسهل للاستخدام مع أنابيب موحدة المقطع العرضي للمرجعية.

5. التصوير وإعداد ماوس

  1. تمييع المتاحة تجاريا الكيتامين وزيلازين 01:10 ت / ت مع المالحة الفسيولوجية لانتاج الحلول الأسهم من 10 ملغ الكيتامين / مل و 2 ملغ / مل زيلازين.
  2. تشغيل نظام التدفئة في الماسح الضوئي (الهواء الحار عادة) لضمان ان تتحمل أن تكون دافئة قبل تصويرها الماوس.
  3. حقن 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 مغ / كغ زيلازين داخل الصفاق لبدء التخدير. ملاحظة: لقد تم اختبار هذه الجرعات لCD1 (ICR) وNU-Foxn1 نو 8 أسابيع الفئران الذكور القديمة. سلالات أخرى قد تحتاج جرعات مختلفة قليلا، والذي ينبغي أن يكون الأمثل في تجربة منفصلة. وهذه الجرعة حفاظ على الماوس تخدير لنوبة 45 دقيقة. ملاحظة: عمق التخدير هو عادة كافية إذا يظهر أي رد فعل الحيوان لقرصة القدم.
  4. مرة واحدة تخدير، ضع الحيوان في مهد الحيوانية وشل لمنع الحركة أثناء التصوير بالرنين المغناطيسي. إذا لزم الأمر، ضع مرجع خارجي بجانب الحيوان. يجب أن يكون كل من المراجع والعائد على الاستثمار (الموقع المتوقع للحقن الخلايا) في وسط لفائف. يجب أن تكون متصلا الحيوان لدرجة الحرارة والتحكم في التنفس لرصد الفسيولوجية أثناء المسح.
  5. تغطية عيون الماوس مع مرهم العين عقيمة لمنع الجفاف خلال جلسات التصوير الطويلة.
  6. إذا كان وقت التصوير يتجاوز 40 دقيقة، وإعداد القسطرة إضافية للحقن إضافية من الكيتامين / زيلازين قبل الحيوان قد استيقظ. موقف اثنين القسطرة تحت الجلد منفصلة مع حلول العمل من الكيتامين وزيلازين. استخدام هذا قسطرة لإعطاء الماوس على 2.5 ملغ إضافية من الكيتامين كل 20 دقيقة بعد أول دقيقة 40. إذا لزم الأمر، كذلك إطالة التخدير عن طريق الحقن من زيلازين إضافية 0.5 ملغ من خلال القسطرة، و 100 دقيقة بعد الحقن الأولي. في جميع الحالات، ينبغي ألا يتجاوز الوقت التجريبية 3 ساعة، باستثناء ربما تحت التخدير الطرفي.
  7. التأكد من أن درجة حرارة الماوس مباشرة بعد الحقن الأولى والإبقاء على 37 درجة مئوية درجة حرارة الجسم. مع هذا البروتوكول، <تم الكشف عن 80٪ الأوكسجين في الدم تحت جو التنفس الهواء. لمنع الآثار الجانبية من الأوكسجين في الدم خفضت، استخدام 100٪ من الأكسجين (0.3 لتر / دقيقة). يجب السيطرة على درجة حرارة الجسم والتنفس في كافة مراحل التجربة برمتها وحتى الشفاء التام من الحيوان. نلاحظ أن معدل التنفس التلقائي تحت الكيتامين / زيلازين عالية جدا (200-250/min). مخالفات في نمط التنفس، بدلا من معدل التنفس، ويمكن أن تشير إلى أن جرعة أعلى من الضروري للحفاظ على حالة مناسبة من التخدير. سوف توقظ الماوس بشكل عفوي في غضون 20-30 دقيقة بعد عملية الشراءص آخر جرعة من مخدر.

ملاحظة: للحصول على تتبع الخلية، فمن الضروري لصورة نفس الحيوان أكثر من مرة. في هذه الحالة، ينبغي تحديد مواعيد جلسات التصوير مع مراعاة الوقت اللازم لإزالة التخدير من النظام والحيوان المبادئ التوجيهية استخدام المعهد.

6. التصوير

1 H التعديلات والتصوير

  1. وضع الحيوان داخل الماسح الضوئي بحيث العائد على الاستثمار هو في مركز التساوي باستخدام منخفضة الدقة، مسح التشريحية مع توجهات شريحة مختلفة (أ كالايزر).
  2. استخدام بروتوكول الملئ العادية في 1 H، مثل الرقائق العالمية على وحدة التخزين بأكملها داخل الملف.
  3. ضبط مكاسب نبض المرجعية (RG)، أي قوة الارسال تقاس في ديسيبل ل1 ميللي ثانية هيرميت 90 ° RF نبض، وذلك باستخدام الفحص التعديل المقدمة من قبل البائع.

ملاحظة: هذا التعديلتختلف مع نوع من لفائف الترددات اللاسلكية، كما أنها ضرورية لمدة 19 F التصوير بالرنين المغناطيسي منذ إشارة على 19 F التردد هو عادة منخفضة جدا لإجراء تعديلات مباشرة. نتيجة لذلك، تقديرا لRG يجب أن تكون مصنوعة من القياسات على 1 H الإشارة. لنقل RF مع لفائف السطح، ينبغي تعديل H 1 RG للطائرة وبالتوازي مع لفائف من خلال جزء من الفائدة، لفائف حجم متجانسة مع B 1 البيانات الشخصية، والضبط الدقيق للتسوية هي أقل أهمية.

  1. بروتوكول التالية من 19 F إشارة النبض ضبط الربح تعمل إلا إذا تم تنفيذ كل من H 1 و 19 انتقال F RF بها مع نفسه (واحد أو ضبطها المزدوج) لفائف الترددات اللاسلكية. لمثل هذا الإعداد والتصوير، ويجب الشخصى لفائف (B 1 حقل الإرسال) في 1 H يكون متناسبا مع البيانات الشخصية لفائف 19 F، عندما يتم تطبيق RG ثابتة، أي ب 1،1 H = C * B 1،19 F مع دعامةortionality المستمر C.
    1. للتأكد من أن ملامح فائف متناسبة لإعداد محددة، الحصول على 1 H و19 F الوجه خريطة زاوية (انظر القسم التالي على تصحيح B 1) على انبوب مع تتركز بشكل كبير 19 F، مثل TFA في الماء (01:01 ت / ت) باستخدام الحقول متطابقة من رأي (FOVs)، سلفا (الشكل 3).
    2. باستخدام نفس RG، والتحقق من أن كلا من الخرائط متطابقة باستثناء عامل C. العالمية
    3. مرة واحدة يتم تحديد H 1 RG، لاحظ هذا الرقم إلى أسفل.
  2. تنفيذ التقليدية 1 H التصوير بالرنين المغناطيسي كمرجع التشريحية للتصوير 19 F. ضبط النظام إلى 19 F تردد من علامة الخلية وإجراء مسح 19 F MR. مثالي الفحص بالرنين المغناطيسي 19 F سيكون لها نفس الحقل من رأي واختيار شريحة مثل 1 H التصوير بالرنين المغناطيسي، على الرغم من أن عادة مع انخفاض القرار. يمكن إحياؤها الحيوان بمجرد imagiنانوغرام كاملة. ويمكن بعد ذلك أن يتم معالجة الصور من دون اتصال.
  3. تحديد 19 F RG عبر العلاقة ديسيبل 19F = ديسيبل -20 1H * تسجيل 10 (C). تقدير تردد كيل 19 F في تجربة منفصلة في المختبر.

ملاحظة: في الجسم الحي، ويمكن تكرار بالضبط تختلف قليلا من تجربة إلى تجربة بسبب ظروف الملئ مختلفة. لمنع القطع الأثرية التحول الكيميائي ولذا ينبغي أن تحدد بالضبط تردد في كل تجربة بنسبة 19 F MRS، إذا كان ذلك ممكنا. ومن شأن مسح نموذجي للمنخفض جدا 19 F إشارة تكون عالمية (نبض اكتساب) التحليل الطيفي (TR = 200 ميللي ثانية، NEX = 3،000، TA = 10 دقيقة، BW = 50 كيلو هرتز). NEX، مما TA، ويمكن تخفيض بشكل كبير لارتفاع 19 F إشارة. يتم تحديد 19 F تردد وكيل من الطيف فورييه بعد التحول والتصحيح المرحلة. NEX يشير إلى عدد من الإثارات، TA هو اكتساب الوقت وBW هوعرض النطاق الترددي.

ملاحظة: معلمات التصوير نموذجي 9 على 11.7T/16 سم مخصص الماسح الضوئي الحيوانية هي: والتشريحية مسح 1 H التصوير باستخدام توربو تدور الصدى (TSE) التسلسل مع TR / صدى الوقت الفعلي (TE EFF) = 2،200 msec/42.8 ميللي ثانية، 8 أصداء في الإثارة، NEX = 2، 10 على التوالي، 1 ملم شرائح سميكة، فوف = 1.92 X 1.92 سم 2، 128 ​​× 128 مصفوفة، أي قرار من 150 × 150 × 1،000 ميكرون 3، TA = 1 دقيقة، BW = 50 كيلو هرتز ونظام ترميز المرحلة الخطية، بينما حصل 19 F الصور مع نفس تسلسل والهندسة مطابقة، ولكن في دقة أقل في الطائرة، وانخفاض BW (NEX = 256، 48 × 48 المصفوفة، أي القرار 400 س 400 س 1،000 ميكرون 3، TA = 57 دقيقة، BW = 10 كيلو هرتز).

  1. B 1 التصحيح
    باستخدام لفائف RF غير متجانسة مع البيانات الشخصية ب 1، مثل لفائف السطح، يمكن أن تعوق الكمي للبيانات 19 F منذ إشارة يعتمدليس فقط على 19 F تركيز ولكن أيضا على مسافة واحدة من لفائف. الحصول على خريطة B 1 على 1 H القناة من أجل 19 F البيانات الصحيحة بأثر رجعي. هذا يتطلب أن 1 H و 19 F ملامح لفائف متطابقة، باستثناء عامل التناسب C، وشريطة أن كافية 1 H إشارة الخلفية في مناطق 19 F. ويرد بروتوكول سبيل المثال لتصحيح من 19 F تدور تسلسل صدى، وذلك باستخدام تكساس / آر إكس فائف سطح الانضباطي واحد ضبطها لكلا H 1 F و 19 ومع النسبي B 1 لمحات 13.
    1. الحصول على خريطة 1 H الوجه زاوية مع اثنين من طريقة زاوية الوجه 14. الحصول على التدرج صدى المسح الضوئي مع طويلة جدا TR (> 3 مرات 1 HT 1) مع زاوية الوجه المقدرة فقط أقل من 90 درجة. إغلاق لفائف. الحصول على التدرج الثاني صدى المسح الضوئي مع RG = ديسيبل 1H -6، أي ضعف الوجهزاوية من مسح الأول.
    2. حساب 1 H زاوية الوجه، α، في فوكسل (س، ص، ض) عن طريق شدة إشارة (SI) من الأولى والثانية بمسح التدرج الصدى: α (س، ص، ض) = اركوس (SI GE، 1 ( س، ص، ض) / 2SI GE، 2 (س، ص، ض)) 14. زاوية الوجه 19 F مماثلة (باستثناء عامل 1 / C) نظرا ليتناسب B 1 الملامح. وفقا لمبدأ فاراداي المعاملة بالمثل 15، والتوهين من 19 F كثافة إشارة من زيادة ونقصان صدى التسلسل (α زاوية الإثارة الوجه، إعادة تركيز الوجه زاوية 2α) خلال استقبال إشارة تى تى آر إكس (X، Y، Z) ~ α (س، ص ، ض) توهين بسبب الإثارة الكمال هو توري تكساس (س، ص، ض) ~ الخطيئة 3 (α (س، ص، ض)) 16. يتم كتابة توهين الشاملة كما توري = attRx * attTx = α * الخطيئة 3 (α) / 90 درجة. لاحظ أنه تطبيع إلى 1 في حالة مثالية زاوية 90 درجة / 180 درجة الإثارة / إعادة تركيز الوجه. ب 1 تصحيحيتم احتساب 19 F صورة شدة إشارة SI 19F، 19F نيوس عبر SI، المراسل (س، ص، ض) = SI 19F (س، ص، ض) / توري (س، ص، ض).
    3. من أجل مقارنة شدة إشارة من التجارب المختلفة، ووضع أنبوب مرجعية محددة مع تركيز 19 F في مجال الرؤية، وتطبيع SI 19F، المراسل إلى إشارة يعني في المرجع.

ملاحظة: 1 HB أساليب أخرى 1 / الوجه رسم الخرائط زاوية يمكن استخدامها ومختلفة تسلسل نبض 19 F تتطلب تعديلات توري تكساس، 19F. فإن أي نوع من مخطط التصحيح B1 إدخال خطأ إضافية في الإجراء الكمي الخلية. إذا دقيقة الكمي الخلية هو المنطلق الرئيسي، لفائف RF مع متجانسة الشخصي B1 يمكن استخدامها للتحايل على هذا الجزء من البروتوكول.

7. معالجة الصور

  1. جعل H 1 و 19 F تراكب الصور
    1. تصدير بيانات الصورةللنهائي 1 H و 19 F حجم الصور من الماسح الضوئي.
    2. فتح الملفات في برنامج معالجة الصور، مثل يماغيج (مجانية، NIH).
    3. تنفيذ التعديلات صورة عند الضرورة (المحاصيل، والسطوع والتباين) الحفاظ على نفس التعديلات لجميع الصور. سوف تحتاج إلى 19 F الصور عادة أن نشرا إلى دقة أعلى لمطابقة الموافق 1 H الصور.
    4. تقديم 19 F الصور في اللون كاذبة (تحديد جدول نظرة متابعة مختلفة، ضمن القائمة "صورة" في صورة J) ثم تراكب على المقابلة 1 H الصور من أجل توطين الإشارة.
  2. 19 F الكمي
    1. تحديد 19 F الصورة (صورة الحجم) مع الخلايا ذات الصلة ومرجعية واضحة.
    2. في برنامج مثل صورة J، رسم رويس على الخلايا ذات الصلة، ومرجعية والمنطقة خارج الموضوع (الضوضاء).
    3. استخدام الأمر تحليلومن ثم قياس (أو ببساطة على Ctrl + M) لحساب متوسط ​​كثافة بكسل داخل هذه المناطق، ومنطقتهم. دعونا S (الخلايا) الرجوع إلى كثافة بكسل متوسط ​​العائد على الاستثمار في أكثر من الخلايا. تتضاعف أنه بحلول حجم (= منطقة خ شريحة سمك) لحساب إشارة المجموع.
    4. حساب SNR، على سبيل المثال باستخدام SNR الصيغة = 0.65 س S (خلايا) / σ، حيث σ هو الانحراف المعياري لكثافة بكسل في العائد على الاستثمار خارج العينة التي هي خالية من أي قطعة أثرية التحول الكيميائي (عادة في الهواء الخلفية) 17. إذا كان SNR هو أقل من 5، تصحيحا للإشارة بسبب الضوضاء قد تكون ضرورية ويمكن القيام بها في أي مكان آخر كما هو موضح 11 10.
    5. خلاف ذلك، وحساب المبلغ الإجمالي لل19 F مسؤولة عن إشارة في العائد على الاستثمار خلال الإشارة بضرب مجال الإشارة في شريحة من قبل شريحة سمك (لحساب حجم) من خلال تركيز 19 F في المرجع،والذي يعرف ويفترض أن تكون متجانسة.
    6. تتضاعف هذه القيمة عن طريق إشارة الكلي في العائد على الاستثمار أكثر من الخلايا، مقسوما على مجموع أكثر من إشارة مرجعية لحساب مبلغ 19 F في الخلايا.
    7. حساب عدد الخلايا بقسمة هذا العدد من القيمة لمدة 19 F / الخلية، والتي تم حسابها في القسم 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نحن هنا تظهر نتائج نموذجية للبروتوكول التي تنطوي على نقل 19 F الخلايا المسمى صاروخ موجه إلى العقدة الليمفاوية استنزاف. ويبين الشكل 2 طيف 19 F NMR من 10 6 الخلايا المسمى باستخدام مرجع TFA. تم تنفيذ الإعداد التصوير خارج كما هو موضح في البروتوكول (الشكل 3). لفي الجسم الحي التصوير، وكنا إشارة تتكون من اسطوانة مختومة من نفس التسمية المستخدمة للخلايا وضعت بين القدمين من الفأرة. وأظهرت صورة معالجتها ممثل في الشكل 4. عن طريق تطبيق البروتوكول هو موضح في القسم 7.2، حسبنا عدد الخلايا تقريبا. 1.2 × 10 6 على أساس 19 F الخام صورة الحجم.

الشكل 1
الشكل 1. الخطوات الرئيسية لتتبع خلية مقرها MRI-19 F. في الجسم الحي. مستنسخة الرقم بإذن 6. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 2
الشكل 2. ممثل 19 F NMR الطيف. يظهر الطيف إشارة F 19 التي تم الحصول عليهاويرجع ذلك إلى كمية معروفة من الإشارة، في هذه الحالة TFA، وعدد معروف من الخلايا، المسمى "عينة". وهذا يمكن أن تستخدم لحساب كمية الفلور في كل خلية، وهو أمر ضروري لفي الجسم الحي الكمي من بيانات الصورة MR.

الرقم 3
الرقم 3. تم الحصول على الوجه الخرائط زاوية أنابيب مع TFA في الماء في 1 H و 19 F القناة. تم حساب عامل التناسب أن يكون 1.03 ± 0.08 لهذا الإعداد. FA: الوجه زاوية.

الرقم 4
الشكل 4. في الجسم الحي 1 H / F 19 صورة من الخلايا الجذعية صاروخ موجه إلى العقدة الليمفاوية استنزاف. ويوضح الشكل صورة ممثل ماوس، مع 19 F إشارة مرئية،في اللون كاذبة، في اشارة (R) والخلايا المسمى. تم تصوير فقط الساقين من الفأرة هنا. في هذا المثال، ترحيل حقن الخلايا المسمى إلى العقدة الليمفاوية استنزاف. وتتلخص المعلمات التصوير في النص الرئيسي. هذا الرقم هو لأغراض التوضيح فقط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول المذكورة هنا يصف الإجراء العام لفي الجسم الحي 19 F التصوير بالرنين المغناطيسي تتبع الخلية. على الرغم من الأسلوب شارك في الحضانة وصفها، هناك عدة بروتوكولات مختلفة لوصفها الخلايا مع 19 وكيل F. ومع ذلك، غالبا ما يتم استخدام المشاركين في الحضانة، ويمكن كذلك أن يكون الأمثل على سبيل المثال عن طريق إضافة وكلاء ترنسفكأيشن 6. سوف بروتوكول وضع العلامات الخلية الفعلية تعتمد على نوع من الخلايا. يتم وصف خطوات فقط وضع العلامات الرئيسية في البروتوكول هنا. عموما، يتم إعداد التسمية وإضافتها إلى خلايا لفترة محددة تتراوح بين بضع ساعات إلى بضعة أيام. أخيرا، لا بد من غسلها الخلايا بعناية لإزالة أي فائض من التسمية، وخاصة إذا سيتم تنفيذ الكمي من بيانات الصورة من 3. إذا كان 19 عامل F يتضمن علامة مضان، وجود التسمية خارج (أو لا بد أن) يمكن أن يتم الكشف عن الخلايا باستخدام المجهر. بعد وضع العلامات، وأنه من الضروري لدراسة الخليةسلامة وظيفة، فيما يتعلق خلايا nonlabeled (مثلا عن طريق التريبان الأزرق الاستبعاد مقايسة). اختبارات وظائف خلية محددة، مثل القدرة على تنشيط خلايا T في حالة البلدان النامية، كما يجب القيام بها. أخيرا، وكما بعض العلامات غير 19 F التصوير بالرنين المغناطيسي يكون لها تأثير على الهجرة الخلية 18، وينبغي أيضا إدراج مثل هذه الاختبارات لمدة 19 F التسميات، وخاصة مع تحميل خلية عالية.

بروتوكول للنموذج حيواني يعتمد أيضا على احتياجات المستخدم. ومع ذلك، فمن المهم أن نتذكر حدود حساسية الصارم 19 F التصوير بالرنين المغناطيسي عند التخطيط التجارب. وتتراوح قيم حساسية نشرت من 1،000-00،000 cells/voxel/1 ساعة الوقت 6، مع تحميل خلية في نطاق من 10 11 -10 13 19 F. حساسية والتركيز التسمية المتوقعة في المنطقة ذات الاهتمام أيضا تؤثر على المعلمات التصوير. على سبيل المثال، وسمك شريحة تستخدم ل19 F صورة يمكن صفة usted ليتطابق مع 1 H صور أو لتغطية منطقة سمكا بكثير (مثل العقدة الليمفاوية بأكملها أو منطقة الفائدة في شريحة واحدة). عادة، يتم تنفيذ 19 F التصوير بها في دقة أقل لتحقيق أقصى قدر من الكشف عن إشارة، لا سيما وأن ارتفاع القرار ليس من الضروري التمييز بين هياكل مثل الغدد الليمفاوية عادة. إذا كانت إشارة غير كافية، وعدد أكبر من شرائح أرق يمكن الحصول عليها وإشارة الكاملة على حجم الفائدة المحسوبة من هذه. ومع ذلك، سوف تحتاج المعلمات المثلى التي يمكن جنيها لكل تطبيق على حدة.

وصفنا بروتوكول التخدير حقن الكيتامين مع / زيلازين تجنب استنشاق الغازات المفلورة مثل isoflurane و. وقد استخدمت بروتوكولات أخرى في الأدب 10،11. ومع ذلك، في جميع الحالات، وسوف تحتاج هذه البروتوكولات إلى تعديل لسلالة الماوس والعمر والجنس والصحة وطول وتواتر دورات التصوير.

ontent "> وقد استخدمت عدة 19 F متواليات التصوير بالرنين المغناطيسي التصوير لتتبع الخلية، لاستعراض رؤية 6. بروتوكول التصوير لدينا يمكن تعديلها بسهولة لتشمل تسلسل التصوير الأخرى. ومع ذلك، الأسلوب الكمي وصفها هنا لا يأخذ بعين الاعتبار أي حجم جزئية الآثار، وصفت اختلافات في اختيار رويس، والتغيرات في المعايير الاسترخاء التسمية في الجسم الحي، أو تغييرات في الخلوية 19 F التحميل. هذه القضايا في أماكن أخرى 3. وباختصار، فقد وجد الخطأ أن يكون ضمن حدود مقبولة لتتبع خلية طولية 10. وبالمقارنة مع هذه الأعمال في وقت سابق ونحن بالإضافة إلى ذلك يقترح خطة لتصحيح الصورة باستخدام لفائف RF السطح عن طريق تعيين الحقل B1. محددة اعتمادا على الإعداد لفائف RF من المهم أن يكون على بينة من القيود المفروضة على تقنيات رسم الخرائط B1، التي كانت كذلك درس في سياق 1 H التصوير بالرنين المغناطيسي 16. على سبيل المثال، للأسلوب زاوية مزدوجة قدمت هنا B1الخريطة هي الأكثر دقة لأزواج زاوية الوجه أدناه فقط 90 ° -180 ° 14 ويمكن إدخال خطأ كبير في مناطق أخرى. لا يزال، بعد التحقق من صحة سليمة في المختبر، مثل التصحيح بأثر رجعي يمكن زيادة تحسين الكمي الخلية. بشكل عام، ونحن نوصي التثبت من البيانات مع تقنيات أكثر رسوخا، على الأقل في البداية. وعادة ما يتم ذلك بالاشتراك مع الجسم الحي في تقنيات التصوير الأخرى، مثل التصوير الضوئي، للمساعدة على استبعاد أخطاء كبيرة. في معظم الحالات، وتقييم النسيجي هو ضروري لتقييم 19 F موقع التسمية على وجه التحديد والسماح ارتباط مع بيانات التصوير. قد يتطلب هذا إضافة صبغة الفلورسنت إلى 19 وكيل F.

أخيرا، على الرغم من أن 19 F التصوير بالرنين المغناطيسي لم يتم تطبيقها على تتبع الخلايا سريرية، سيكون من الممكن تعديل هذا البروتوكول للاستخدام البشري. ان التعديلات اللازمة الرئيسي يكون لتنفيذ أكبر قدر من OPTIMسعودة والإعداد مسبقا ممكن (لتقليل طول الوقت هذا الموضوع هو في الماسح الضوئي)، وضبط معايير التصوير للحفاظ على داخل السريرية معدل امتصاص محددة (ريال سعودي) القيود.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

Acknowledgments

نود أن نعترف نادين هين وأرند Heerschap على مساعدتهم القيمة. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الهولندي للطب التجديدي (NIRM، FES0908)، وبرنامج الاتحاد الأوروبي FP7 ENCITE (HEALTH-F5-2008-201842) وTargetBraIn (HEALTH-F2-2012-279017)، منحة من مؤسسة فولكس واجن ( I/83 443)، والمنظمة الهولندية للبحوث العلمية (VENI 700.10.409 وفيدي 917.76.363)، ERC (المنحة المتقدم 269019)، ومركز جامعة رادبود نيميجن الطبية (AGIKO 2008-2-4).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
PBS Sigma-Aldrich MFCD00131855
TFA Sigma-Aldrich 76-05-1
Ketamine (Ketavet) Pfizer 778-551
Xylazine (Rompun) Bayer QN05 cm92
Ophtosan Produlab Pharma 2702 eye ointment
Material name
MRI scanner Bruker Biospec
NMR spectrometer Bruker Biospec

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Srinivas, M., et al. Imaging of cellular therapies. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1080-1093 (2010).
  2. de Vries, I. J., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat. Biotechnol. 23, 1407-1413 (2005).
  3. Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. MRI for quantitative in vivo cell tracking. Trends Biotechnol. 28, 363-370 (2010).
  4. Ruiz-Cabello, J., Barnett, B. P., Bottomley, P. A., Bulte, J. W. Fluorine (19F) MRS and MRI in biomedicine. NMR Biomed. 24, 114-129 (2011).
  5. Stoll, G., Basse-Lusebrink, T., Weise, G., Jakob, P. Visualization of inflammation using 19F-magnetic resonance imaging and perfluorocarbons. Wires Nanomed. Nanobiol. 4, 438-447 (2012).
  6. Srinivas, M., Boehm-Sturm, P., Figdor, C. G., de Vries, I. J., Hoehn, M. Labeling cells for in vivo tracking using (19)F. MRI. Biomaterials. 33, 8830-8840 (2012).
  7. Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol. 23, 983-987 (2005).
  8. Srinivas, M., et al. Customizable, multi-functional fluorocarbon nanoparticles for quantitative in vivo imaging using 19F MRI and optical imaging. Biomaterials. 31, 7070-7077 (2010).
  9. Boehm-Sturm, P., Mengler, L., Wecker, S., Hoehn, M., Kallur, T. In vivo tracking of human neural stem cells with 19F magnetic resonance imaging. PLoS One. 6, e29040 (2011).
  10. Srinivas, M., et al. In vivo cytometry of antigen-specific t cells using (19)F. MRI. Magn. Reson. Med. , (2009).
  11. Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model. Magn. Reson. Med. 58, 725-734 (2007).
  12. Mangala Srinivas, E. T. A. Cellular labeling and quantification for nuclear magnetic resonance techniques. US patent. , 11787521 (2007).
  13. Boehm-Sturm, P., Pracht, E. D., Aswendt, M., Henn, N., Hoehn, M. Proceedings of the International Society for Magnetic Resonance in Medicine. , Melbourne, Australia. (2012).
  14. Insko, E. K., Bolinger, L. Mapping of the Radiofrequency Field. J. Magn. Res. A. 103, 82-85 (1993).
  15. Haacke, E. M., Brown, R. W., Thompson, M. R. Magnetic resonance imaging: physical principles and sequence design. , Wiley. (1999).
  16. Scheffler, K. A pictorial description of steady-states in rapid magnetic resonance imaging. Concepts Magn. Res. 11, 291-304 (1999).
  17. Firbank, M. J., Coulthard, A., Harrison, R. M., Williams, E. D. A comparison of two methods for measuring the signal to noise ratio on MR images. Phys. Med. Biol. 44, 261-264 (1999).
  18. de Chickera, S. N., et al. Labelling dendritic cells with SPIO has implications for their subsequent in vivo migration as assessed with cellular MRI. Contrast Media Mol. Imaging. 6, 314-327 (2011).

Tags

الطب، العدد 81، نماذج الحيوان، أمراض الجهاز المناعي، التصوير بالرنين المغناطيسي،
<em>في الجسم الحي</em> <sup>19</sup> F التصوير بالرنين المغناطيسي لتتبع الخليوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srinivas, M., Boehm-Sturm, P.,… More

Srinivas, M., Boehm-Sturm, P., Aswendt, M., Pracht, E. D., Figdor, C. G., de Vries, I. J., Hoehn, M. In vivo 19F MRI for Cell Tracking. J. Vis. Exp. (81), e50802, doi:10.3791/50802 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter