In vivo ¹⁹ F MRI per il tracciamento cellulare

Summary

Descriviamo un protocollo generale per il monitoraggio in vivo cella utilizzando la risonanza magnetica in un modello di topo con cellule ex vivo etichettati. Un tipico protocollo di marcatura delle cellule, elaborazione acquisizione delle immagini e la quantificazione è inclusa.

Abstract

In vivo ¹⁹ F RM consente il monitoraggio delle cellule quantitativa, senza l'uso di radiazioni ionizzanti. Si tratta di una tecnica non invasiva che può essere applicata agli esseri umani. Qui, descriviamo un protocollo generale per la marcatura delle cellule, imaging e di elaborazione delle immagini. La tecnica è applicabile a vari tipi cellulari e modelli animali, anche se qui ci concentriamo su un modello tipico del mouse per il monitoraggio cellule immunitarie murine. Le questioni più importanti per l'etichettatura delle cellule sono descritti, in quanto questi sono rilevanti per tutti i modelli. Analogamente, i parametri di imaging chiave sono elencati, anche se i dettagli possono variare a seconda del sistema MRI e la configurazione individuale. Infine, includiamo un protocollo di elaborazione delle immagini per la quantificazione. Variazioni di questo, e di altre parti del protocollo, sono valutati nella sezione di discussione. Sulla base della procedura dettagliata qui descritto, l'utente dovrà adattare il protocollo per ogni specifico tipo cellulare, etichetta della cella, modello animale, e la configurazione di imaging. Si noti che il protocol può anche essere adattato per uso umano, purché siano soddisfatte le restrizioni clinici.

Introduction

Nel monitoraggio delle cellule in vivo è essenziale per l'ottimizzazione e il monitoraggio delle terapie cellulari ^1. Grazie alla sua natura non invasiva, imaging offre eccellenti opportunità per monitorare le cellule in vivo. Magnetic Resonance Imaging (MRI) è indipendente da radiazioni ionizzanti e permette una risoluzione di immagini di qualità superiore e contrasto dei tessuti molli intrinseca. Inseguimento cell-based MRI è già stato usato in clinica per seguire le cellule dendritiche in pazienti affetti da melanoma ^2. Convenzionale MRI clinica viene effettuata sul nucleo ¹ H, presenti nell'acqua cellulare nei tessuti. E 'anche possibile effettuare MRI su altri nuclei attivi, come ¹³ C, ¹⁹ F e ²³ Na. Tuttavia, solo ¹⁹ F MRI è stata applicata con successo in vivo di monitoraggio delle cellule in quanto offre la più alta sensibilità dopo il ¹ ° H. L'assenza di MRI rilevabile endogeno ¹⁹ F nei tessuti consente elevata selettività segnale per larivelazione di agenti di contrasto ¹⁹ F esogeni e consente la quantificazione di concentrazione di fluoro direttamente dai dati di immagine. Per una discussione dettagliata sui ¹⁹ F MRI, vedere ^3-5. Una questione chiave con ¹⁹ F MRI è la necessità di sviluppare e ottimizzare le opportune etichette cellulari ¹⁹ F, anche se sono state sviluppate diverse etichette, con una tendenza verso agenti multimodali ^6.

Il protocollo che descriviamo qui è basata su studi dai nostri gruppi di ^7-9, inclusi i primi articoli che descrivevano in vivo quantitativa ¹⁹ cell-based RM F inseguimento ^10,11. La procedura generale di inseguimento cellulare mediante ¹⁹ F MRI è riassunto nella Figura 1. Descriviamo un protocollo generale per l'etichettatura e l'imaging di cellule dendritiche (DC) con un agente di contrasto perfluorocarbonio misura ^8. Il protocollo di imaging è generalmente applicabile a differenti tipi di cellule, etichette e modelli animali. Iltipo di cellula e animale modello qui descritto dovrebbe essere presa solo come esempio, e quindi non forniamo dettagli sul isolamento e marcatura delle cellule, ma piuttosto concentrarsi sul protocollo di imaging. Le modifiche saranno necessarie per ciascuna etichetta, tipo di cellula, modelli animali, e la configurazione di imaging, e questi possono essere trovati in letteratura o possono avere bisogno di essere ottimizzato dai ricercatori. Alcune modifiche sono stati inseriti nella discussione.

Protocol

Nota: Tutti gli esperimenti e le procedure che coinvolgono gli animali devono essere eseguite conformemente alle pertinenti orientamenti etici e conformi con la cura degli animali standard ed esigenze umane.

1. Etichettatura cellulare (protocollo standard con Coincubation)

1. Aggiungere ¹⁹ F etichetta ⁸ a DC immature ad una concentrazione di 4 mg/10 ⁶ cellule (in media 2 ml). Agitare delicatamente per mescolare.
2. Incubare le cellule con l'etichetta per 3 giorni prima della maturazione e della raccolta dei PVS.
3. Raccogliere i PVS ed eliminare l'eccesso di etichetta mediante lavaggio almeno 3 volte in PBS. Contare le cellule.
4. Risospendere in un piccolo volume di PBS per iniezione o ulteriori test.

Nota: Questo protocollo è rilevante per questi controller di dominio e l'etichetta specifici. La procedura è stata ottimizzata in un'altra pubblicazione ⁸ e incluso qui sono solo i passaggi per preparare un campione per l'immagine, dal momento che il focus di questo protocollo è il imaging. Hza, il protocollo per l'isolamento, la cultura e l'etichettatura di un tipo cellulare specifico sia bisogno di essere trovato in letteratura o ottimizzate dal ricercatore. Un elenco di tutti gli altri ¹⁹ etichette F che sono stati utilizzati in letteratura sono presentate altrove ^6.

2. Determinazione dei ¹⁹ F / cell Utilizzo ¹⁹ F NMR

1. Collocare un numero noto di cellule marcate (tipicamente più di 0,5 x 10 ^6, o un numero che si traduce in segnale sufficiente) in un tubo NMR.
2. Aggiungere 10 ml di acido trifluoroacetico 5% (TFA). Se la frequenza di risonanza di TFA è inadatto a causa della sovrapposizione con l'etichetta, usare un composto solubile alternativa, preferibilmente con un singolo ¹⁹ F risonanza.
3. Trasferire il campione in uno spettrometro NMR e ottenere lo spettro ¹⁹ F. Assicurarsi che la larghezza di banda è sufficiente sia per il TFA (riferimento) e l'agente.

Nota: Il TR deve essere abbastanza lungo per full rilassamento del riferimento e il campione gira (circa 5 volte il tempo T ₁ rilassamento della più lunga T ₁ componente nel tubo, tipicamente TR ~ 5-8 sec). Alcuni spettrometri richiedono D ₂ O per un segnale di blocco di frequenza. Uno spettro standard da ¹⁹ F è sufficiente. I numeri delle medie o delle cellule superiore estese saranno necessari se l'assorbimento cellulare del marchio è scarsa o se il numero di cellule sono bassi. Lo spettro deve essere centrato tra il riferimento e relative ai picchi di etichette, a meno che le correzioni sono fatte per spiegare l'eccitazione parziale.

4. Calcolare le relative aree sotto i picchi di riferimento e il campione (o il picco principale del campione), quindi calcolare il numero medio di ¹⁹ F / cellule nel campione.

Nota: L'intero processo deve essere ripetuto e media ampiamente sufficiente a raggiungere la significatività statistica. Questo può essere fatto utilizzando la spettroscopia direttamente sullo scanner MRI. Huttavia, notare che questa procedura rivela solo la media ¹⁹ F carico per un gran numero di cellule, non la variabilità tra le celle. Controllo uniformità di assorbimento delle cellule richiede la presenza di un componente fluorescente al F agente ^19, in modo che l'assorbimento delle cellule può essere analizzata mediante microscopia o citometria a flusso.

3. Considerazioni per Experimental Design - iniezione di cellule

A causa è necessaria per il successo relativamente scarsa sensibilità di ¹⁹ F risonanza magnetica per il monitoraggio delle cellule, un modello animale in cui le cellule si localizzare in gran numero imaging in vivo. Valori di sensibilità tipiche vanno da 1,000-100,000 cells/voxel/1 hr tempo di scansione ^6, con un carico cella nell'intervallo di 10 ¹¹ -10 ¹³ atomi di fluoro.

Il numero e la frequenza delle sessioni di imaging devono essere programmati attentamente, in quanto questo influenza la scelta di anestetico. Si noti che isoflurano non sia suitable per ¹⁹ F MRI se la frequenza di risonanza ¹⁹ F di isoflurano è vicino a quello del composto etichetta utilizzata. isoflurano può ancora essere adatto se le sessioni di imaging sono sufficientemente breve per impedire significativo accumulo. Diversi anestetici alternativi sono stati utilizzati in letteratura ^10,11; un esempio è incluso nel protocollo di imaging. Anestetici possono avere bisogno di essere ottimizzato per i diversi ceppi di topi e di modelli di malattia.

4. Progettazione di un ¹⁹ F riferimento esterno

1. Utilizzare un riferimento esterno contenente una quantità nota di segnale ¹⁹ F per la quantificazione ^12. Scegliere l'intensità del segnale di riferimento per essere approssimativamente paragonabile a quella prevista dal soggetto.

Nota: In generale, è più semplice se il composto di riferimento è lo stesso come l'etichetta cella, corrispondenti ai parametri di rilassamento. Se si utilizzano sequenze spettroscopiche o sequenze senza localizzazione spaziale, poi acompound con uno spostamento chimico differente può essere necessario.

2. Modificare il posizionamento, le dimensioni e la forma del riferimento, se necessario, a seconda della regione di interesse (ROI). Nota: E 'generalmente più facile da usare tubi con sezione trasversale costante per il riferimento.

5. Imaging e preparazione mouse

1. Diluire disponibile in commercio chetamina e xilazina rapporto 1:10 v / v con soluzione salina fisiologica per produrre soluzioni stock di 10 mg di ketamina / ml e 2 mg / ml xilazina.
2. Accendere il sistema di riscaldamento in scanner (tipicamente aria calda) per garantire il foro sarà caldo prima che il mouse è ripreso.
3. Iniettare 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xilazina intraperitoneale di avviare anestesia. Nota: Queste dosi sono state testate per CD1 (ICR) e NU-Foxn1 ^nu 8 settimane vecchi topi maschi. Altri ceppi possono avere bisogno di dosi leggermente diverse, che dovrebbero essere ottimizzati in un esperimento separato. Questa dose manterrà il mouse anestetizzato per unattacco 45 min. Nota: La profondità dell'anestesia è normalmente sufficiente se l'animale non mostra alcuna reazione ad un pizzico piede.
4. Una volta anestetizzato, posizionare l'animale in una culla animale e immobilizzare per impedire il movimento durante la risonanza magnetica. Se necessario, posizionare il riferimento esterno accanto all'animale. Sia il riferimento e il ROI (posizione prevista delle cellule iniettate) dovrebbe essere nel centro della bobina. L'animale deve essere collegato alla temperatura e controllo di respirazione per monitoraggio fisiologico durante la scansione.
5. Coprire gli occhi del mouse con sterile unguento occhio per evitare che si secchi durante le sessioni di imaging lunghi.
6. Se il tempo di imaging supera i 40 minuti, preparare cateteri supplementari per l'iniezione di ulteriori ketamina / xylazina prima che l'animale può svegliarsi. Posizione due cateteri sottocutanei separati con le soluzioni di lavoro del ketamina e xilazina. Utilizzare questo catetere per dare il mouse un ulteriore 2,5 mg di ketamina ogni 20 minuti dopo i primi 40 min. Se necessario, prolungare ulteriormente anestesia mediante iniezione di ulteriore 0,5 mg xilazina attraverso il catetere, 100 min dopo l'iniezione iniziale. In tutti i casi, il tempo sperimentale non deve superare 3 ore, tranne possibilmente in anestesia terminali.
7. Assicurarsi che il mouse viene riscaldato direttamente dopo la prima iniezione e mantenuta a 37 ° C la temperatura corporea. Con questo protocollo, <80% ossigenazione del sangue è stata rilevata in atmosfera di respirare aria. Per evitare gli effetti collaterali della ossigenazione del sangue abbassata, utilizzare il 100% di ossigeno (0,3 L / min). La temperatura corporea e la respirazione devono essere controllati durante l'intero esperimento e fino al pieno recupero dell'animale. Si noti che il tasso di respirazione spontanea sotto ketamina / xylazina è molto elevata (200-250/min). Irregolarità nel modello di respirazione, piuttosto che la frequenza respiratoria, possono indicare che una dose elevata è necessaria per mantenere uno stato adeguato di anestesia. Il mouse risveglierà spontaneamente entro 20-30 min after l'ultima dose di anestetico.

Nota: Per il monitoraggio delle cellule, è necessario immagine stesso animale più di una volta. In tal caso, le sessioni di imaging dovrebbero essere programmate tenendo in considerazione il tempo necessario per la liquidazione di anestesia dal sistema e animali linee guida sull'uso dell'istituto.

6. Imaging

¹ adeguamenti H e l'imaging

1. Posizionare l'animale all'interno dello scanner in modo che il ROI è in isocentro con una bassa risoluzione, scansione anatomica con orientamenti diversi fetta (un localizzatore).
2. Utilizzare il protocollo spessoramento ordinario il ¹ H, ad esempio uno spessore globale su tutto il volume all'interno della bobina.
3. Regolare il guadagno impulso di riferimento (RG), cioè la potenza del trasmettitore misurata in dB per 1 msec Hermite 90 ° impulsi RF, mediante la scansione di regolazione fornito dal venditore.

Nota: Questa regolazionevariare con il tipo di bobina RF ed è essenziale per ¹⁹ F MRI poiché il segnale sulla frequenza ¹⁹ F è generalmente troppo basso per rettifiche dirette. Di conseguenza, una stima del RG deve essere effettuato da misure sul segnale ¹ H. Per la trasmissione RF con una bobina di superficie, il ¹ H RG deve essere regolata ad un piano parallelo alla bobina attraverso la parte di interesse, per una bobina volume con omogenea B ₁ profilo, le impostazioni esatte della regolazione sono meno importanti.

4. Il seguente protocollo del ¹⁹ F riferimento impulsi di regolazione del guadagno funziona solo se viene effettuata sia ¹ H e ¹⁹ F trasmissione RF con la stessa bobina RF (singolo o doppio-tuned). Per una tale configurazione di imaging, il profilo della bobina (B ₁ campo di trasmissione) il ¹ ° H dovrebbe essere proporzionale al profilo della bobina ¹⁹ F, quando viene applicato un RG fisso, vale a dire B _{1,1 H} = C * B _{1,19 F} con un puntelloortionality costante C.
   1. Per confermare che i profili elicoidali sono proporzionali per una configurazione specifica, acquisire un ¹ H e F vibrazione angolo di mappa ¹⁹ (vedere la seguente sezione B ₁ correzione) su un tubo con altamente concentrato ¹⁹ F, ad esempio TFA in acqua (01:01 v / v) con identiche campi di vista (FOV), preventivamente (Figura 3).
   2. Utilizzando la stessa RG, verificare che entrambe le mappe sono identiche ad eccezione del fattore C. globale
   3. Una volta che il ¹ H RG è determinato, annotare questo numero.
5. Effettuare una tradizionale ¹ H risonanza magnetica come riferimento anatomico per l'imaging ¹⁹ F. Punto il sistema per il ¹⁹ frequenza F del marcatore cella ed eseguire una scansione ¹⁹ F MR. Idealmente la scansione ¹⁹ F MRI avrà lo stesso campo di vista e selezione della fetta come ¹ H MRI, ma solitamente con risoluzione inferiore. L'animale può essere ripreso non appena l'immaginariong è completa. Elaborazione di immagini può essere effettuata offline.
6. Determinare il ¹⁹ F RG tramite la relazione dB _19F = -20 dB _1H * log ₁₀ (C). Stimare la frequenza agente ¹⁹ F in un esperimento separato in vitro.

Nota: In vivo, l'esatta frequenza può variare leggermente da esperimento per sperimentare a causa delle diverse condizioni di spessoramento. Per evitare artefatti chemical shift l'esatta frequenza dovrebbe quindi essere determinato in ogni esperimento da ¹⁹ F MRS, se possibile. Una scansione tipica di segnale molto basso ¹⁹ F sarebbe globale (pulse-acquire) spettroscopia (TR = 200 msec, NEX = 3.000, TA = 10 min, BW = 50 kHz). NEX, quindi TA, può essere notevolmente ridotto per il segnale alto ¹⁹ F. La frequenza F agente ¹⁹ è determinata dallo spettro dopo trasformazione di Fourier e correzione di fase. NEX si riferisce al numero di eccitazioni, TA è il tempo di acquisizione e BW rappresenta l'larghezza di banda.

Nota: i parametri di imaging tipiche ⁹ su un 11.7T/16 cm scanner animali sono dedicati: un anatomica scansione ¹ H di imaging utilizzando un turbo di spin echo (TSE) di sequenza con TR / effettivo tempo di eco (TE _eff) = 2.200 msec/42.8 msec, 8 echi per eccitazione, NEX = 2, 10 consecutivi 1 mm fette spesse, FOV = 1.92 x 1,92 centimetri ^2, 128 x 128 matrice, cioè una risoluzione di 150 x 150 x 1.000 micron ^3, TA = 1 min, BW = 50 kHz e uno schema di codifica di fase lineare. F ¹⁹ immagini sono state acquisite con la stessa sequenza e geometria corrispondenza, ma a bassa risoluzione in piano e inferiore BW (NEX = 256, 48 x 48 matrice, cioè una risoluzione di 400 x 400 x 1.000 ³ micron, TA = 57 min, BW = 10 kHz).

7. B ₁ correzione
   Utilizzando una bobina RF con disomogenea B ₁ profilo, ad esempio una bobina di superficie, può ostacolare quantificazione dei dati ¹⁹ F dal segnale dipendenon solo ^{il 19} concentrazione F ma anche dalla distanza dalla bobina. Acquisire un B ₁ mappa sul canale ¹ H, al fine di correggere in modo retrospettivo i dati ^{di 19} F. Ciò richiede che ¹ H e ¹⁹ F profili elicoidali sono identici, tranne per il fattore di proporzionalità C, e che sufficiente segnale di fondo ¹ H è fornita in regioni ¹⁹ F. Un esempio di protocollo di correzione di una sequenza echo ¹⁹ F centrifuga viene presentata, utilizzando un singolo sintonizzato Tx / Rx bobina di superficie sintonizzabile sia ¹ H e ¹⁹ C e con B proporzionale ₁ profili ^13.
   1. Acquisire un ¹ H vibrazione mappa angolo con il metodo a due flip angle ^14. Acquisire un gradiente echo scansione con molto lunghi TR (> 3 volte ¹ HT ₁₎ con un angolo di vibrazione stimato di poco inferiore a 90 °. Chiudere alla bobina. Acquisire un secondo gradiente di scansione echo con un RG = dB _1H -6, cioè il doppio il flipangolo della prima scansione.
   2. Calcolare l'angolo di nutazione ¹ H, α, al voxel (x, y, z) tramite le intensità di segnale (SI) della prima e seconda scansione GRE: α (x, y, z) = arcos (SI _{GE, 1} ( x, y, z) / 2SI _{GE, 2} (x, y, z)) ^14. Il flip angle ¹⁹ F è identico (eccetto per il fattore 1 / C) a causa B proporzionale ₁ profili. Secondo il principio di Faraday di reciprocità ^15, l'attenuazione di ¹⁹ F intensità del segnale da uno spin echo (α angolo di eccitazione di vibrazione, di riorientamento capovolgere angolo 2α) durante la ricezione del segnale è att _Rx (x, y, z) ~ α (x, y , z). L'attenuazione dovuta all'eccitazione imperfetta è att _Tx (x, y, z) ~ ³ sin (α (x, y, z)) ^16. L'attenuazione complessiva è scritto come att = attRx * attTx = α * sin ³ (α) / 90 °. Si noti che è normalizzata a 1 nel caso di perfetto angolo di 90 ° / 180 ° eccitazione / rifocalizzazione flip. Il B ₁ corretto19 F immagine intensità di segnale SI _{19F, corr} sono calcolati tramite SI _{19F, corr} (x, y, z) = SI _19F (x, y, z) / att (x, y, z).
   3. Al fine di confrontare le intensità di segnale dai diversi esperimenti, inserire un tubo di riferimento definito con concentrazione ¹⁹ F nel campo visivo, e normalizzare il SI _{19F, corr} al segnale medio nel riferimento.

Nota: Altri ¹ HB metodi ₁ / mappatura flip angle possono essere usate e diverse sequenze di impulsi ¹⁹ F richiedono modifiche di att _{Tx, 19F.} Qualsiasi tipo di schema di correzione B1 introdurrà ulteriori errori nella procedura di quantificazione delle cellule. Se la quantificazione delle cellule accurata è la premessa principale, una bobina RF con profilo B1 omogeneo può essere utilizzata per aggirare questa parte del protocollo.

7. Image Processing

1. Fare ¹ H e ¹⁹ immagini sovrapposte F
   1. Esportare i dati di immagineper la finale ¹ H e ¹⁹ F immagini magnitudo dallo scanner.
   2. Aprire i file in un programma di elaborazione delle immagini, come ad esempio ImageJ (freeware, NIH).
   3. Eseguire le regolazioni dell'immagine come necessario (ritaglio, luminosità, contrasto) mantenendo le regolazioni lo stesso per tutte le immagini. Le ¹⁹ immagini F in genere bisogno di essere upscaling ad una risoluzione più alta per soddisfare le corrispondenti immagini H ^1.
   4. Render le ¹⁹ immagini F in falso colore (selezionare una diversa tabella di look-up, sotto il menu "immagine" in J Image) e poi sovrapporre le corrispondenti immagini ¹ H, al fine di localizzare il segnale.
2. ¹⁹ F Quantificazione
   1. Selezionare un F image ¹⁹ (image grandezza) con le cellule interessate e il riferimento visibile.
   2. In un programma come immagine J, disegnare ROI sulle celle pertinenti, il riferimento ed una regione esterna al soggetto (rumore).
   3. Utilizzare il comando Analyzee quindi misurare (o semplicemente Ctrl + M) per calcolare l'intensità media dei pixel all'interno di queste regioni, e la loro area. Sia S (celle) si riferiscono alla intensità media dei pixel nella ROI sulle celle. Moltiplicare per il volume (= area x spessore della fetta) per calcolare il segnale totale.
   4. Calcolare il SNR, ad esempio utilizzando la formula SNR = 0,65 x S (celle) / σ, dove σ è la deviazione standard di intensità dei pixel in una ROI fuori del campione che è privo di qualsiasi manufatto chemical shift (tipicamente in aria background) ^17. Se il SNR è sotto 5, una correzione per il segnale a causa del rumore può essere necessario e può essere effettuata come descritto altrove ^{11 10.}
   5. Altrimenti, calcolare la quantità totale di ¹⁹ F responsabili del segnale nella ROI rispetto al riferimento moltiplicando l'area del riferimento nella fetta da spessore della fetta (per calcolare il volume) e la concentrazione di ¹⁹ F nel riferimento,che è noto e ritenuto omogeneo.
   6. Moltiplicare tale valore per il segnale totale nella ROI sulle celle, diviso per il segnale totale sul riferimento per calcolare la quantità di ¹⁹ F nelle cellule.
   7. Calcolare il numero di cellule dividendo questo numero per il valore di ¹⁹ F / cella, calcolato nella sezione 2.

Representative Results

Qui mostriamo i risultati tipici per un protocollo che comporta il trasferimento di ¹⁹ cellule F-etichettati homing ad un linfonodo drenante. Figura 2 mostra uno spettro ¹⁹ F NMR di 10 ⁶ cellule marcate utilizzando un riferimento TFA. La configurazione di imaging è stata effettuata come descritto nel protocollo (Figura 3). Per l'imaging in vivo, abbiamo utilizzato un riferimento costituito da un cilindro sigillato della stessa etichetta usato per le celle poste tra i piedi del mouse. Una immagine elaborata rappresentativo è mostrato in Figura 4. Applicando il protocollo descritto nella sezione 7.2, abbiamo calcolato un numero di cellulare di ca. 1,2 x 10 ⁶ basato sull'immagine grandezza ¹⁹ F crudo.

Figura 1. Passaggi chiave per il monitoraggio cellulare basato su risonanza magnetica ¹⁹ F. in vivo. Figura riprodotta con il permesso ^6. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Rappresentativa ¹⁹ F NMR. Lo spettro mostra il segnale ¹⁹ F ottenutoa causa della quantità nota di riferimento, in questo caso TFA, e il numero noto di cellule, marcato "campione". Questo può essere usato per calcolare la quantità di fluoro per cella, che è necessaria per la quantificazione in vivo dai dati delle immagini MR.

Figura 3. Mappe flip angle di tubi con TFA in acqua sono stati acquisiti al ¹ H e ¹⁹ canali F. La proporzione è stata calcolata in 1,03 ± 0,08 per questa configurazione. FA: capovolgere l'angolo.

Figura 4. In vivo ¹ H / F ¹⁹ immagine di cellule dendritiche homing di un linfonodo drenante. La figura mostra una immagine rappresentativa di un topo, con ¹⁹ F segnale visibile,in falsi colori, nel riferimento (R) e le cellule marcate. Solo le gambe del topo sono stati ripresi qui. In questo esempio, le cellule marcate iniettate migrati al linfonodo drenante. I parametri di imaging sono riassunti nel testo principale. La figura è solo a scopo illustrativo.

Discussion

Il protocollo qui delineato descrive la procedura generale per in vivo ¹⁹ tracciamento delle cellule F MRI. Nonostante il metodo di co-incubazione descritto, esistono diversi protocolli di etichettatura cellule con un agente F ^19. Tuttavia, la co-incubazione è più spesso utilizzato e può essere ulteriormente ottimizzata per esempio mediante aggiunta di agenti di trasfezione ^6. Il protocollo attuale marcatura delle cellule dipende dal tipo di cellula. A pochi passi di etichettatura chiave sono descritti nel protocollo qui. Generalmente, l'etichetta viene preparata e aggiunta alle cellule per un tempo selezionato vanno da poche ore a qualche giorno. Infine, le cellule devono essere lavati accuratamente per rimuovere qualsiasi eccesso di etichetta, soprattutto se quantificazione dai dati di immagine sarà effettuata ^3. Se l'agente F ¹⁹ include un tag fluorescenza, la presenza di un'etichetta esterna (o non vincolato a) le cellule possono essere rilevati utilizzando microscopia. Dopo marcatura, è necessario studiare la cellulavitalità e funzionalità, in relazione alle cellule nonlabeled (ad esempio mediante trypan blue exclusion assay). Test di funzionalità specifiche delle celle, come la capacità di attivare le cellule T nel caso di DC, devono essere eseguite. Infine, come alcuni non ¹⁹ etichette F MRI hanno un effetto sulla migrazione delle cellule ^18, tali test dovrebbero essere inclusi per ¹⁹ etichette F, specialmente con carico elevato cellulare.

Il protocollo per il modello animale dipende anche esigenze dell'utente. Tuttavia, è importante ricordare i rigorosi limiti di sensibilità di ¹⁹ F MRI momento di pianificare esperimenti. Valori di sensibilità pubblicati vanno da 1,000-00,000 cells/voxel/1 tempo hr ^6, con un carico cella nell'intervallo di 10 ¹¹ -10 ^{13 19} F. La sensibilità e la concentrazione etichetta prevista nella regione di interesse influiscono anche i parametri di imaging. Ad esempio, lo spessore dello strato utilizzato per l'immagine ¹⁹ F può essere agg usted a corrispondere a quella del ¹ immagini H o per coprire un'area molto più spessa (come l'intero linfonodo o regione di interesse in una sola fetta). Tipicamente, il ¹⁹ F di imaging è condotta a bassa risoluzione per massimizzare rilevazione del segnale, tanto più alta risoluzione non è solitamente necessario distinguere strutture come linfonodi. Se il segnale è sufficiente, un maggior numero di fette sottili può essere acquisita e il segnale totale sul volume di interesse calcolata da questi. Tuttavia, dovranno essere derivato per ogni singola applicazione i parametri ottimali.

Descriviamo un protocollo di anestesia iniezione con ketamina / xylazina evitando gas fluorurati come inalazione isoflurano. Altri protocolli sono stati utilizzati nella letteratura ^10,11. Tuttavia, in ogni caso, dovranno essere regolati per il ceppo di topo, l'età, il sesso, la salute e la lunghezza e la frequenza delle sessioni di imaging questi protocolli.

ONTENUTO "> Diversi ¹⁹ sequenze di imaging RM F sono stati utilizzati per il monitoraggio delle cellule, per una rassegna vedi ^6. nostro protocollo di imaging può essere facilmente modificato per includere altre sequenze di imaging. Tuttavia, il metodo di quantificazione qui descritto non tiene conto di qualsiasi volume parziale effetti, le discrepanze nella selezione di ROI, cambiamenti nei parametri di rilassamento del marchio in vivo, o cambiamenti nel cellulare ¹⁹ F loading. Questi problemi sono descritti altrove ^3. In sintesi, l'errore è stato trovato per essere entro limiti tollerabili per il monitoraggio delle cellule longitudinale ^10. Rispetto a questi lavori precedenti abbiamo inoltre proposto uno schema di correzione dell'immagine per l'uso di bobine RF superficie mappando il campo B1. seconda della configurazione specifica bobina RF è importante essere consapevoli dei limiti delle tecniche di mappatura B1, che sono stati ben studiato nel contesto di ¹ H MRI ^16. Ad esempio, per il metodo a doppia inclinazione qui presentato il B1map è più preciso per le coppie flip angle appena sotto i 90 ° -180 ° ¹⁴ ed errore significativo può essere introdotto in altre regioni. Ancora, dopo adeguata validazione in vitro, tale correzione retroattiva può migliorare ulteriormente la quantificazione delle cellule. In generale, si consiglia di conferma dei dati con tecniche più consolidate, almeno inizialmente. Questo è in genere fatto in combinazione con altre tecniche di imaging in vivo, ad esempio imaging ottico, per aiutare a escludere errori di grandi dimensioni. Nella maggior parte dei casi, la valutazione istologica è necessario valutare ¹⁹ F posizione dell'etichetta proprio e per consentire correlazione con i dati di imaging. Ciò può richiedere l'aggiunta di un colorante fluorescente per l'agente F ^19.

Infine, sebbene ¹⁹ F MRI non è ancora stato applicato al tracking cella clinica, sarebbe possibile modificare questo protocollo per uso umano. Le principali modifiche necessarie sarebbero per svolgere il maggior numero di ottimzione e la configurazione prima possibile (per ridurre al minimo il periodo di tempo il soggetto è nello scanner), e per regolare i parametri di imaging per mantenere entro clinica tasso di assorbimento specifico (SAR) restrizioni.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	eye ointment
Material name
MRI scanner	Bruker Biospec
NMR spectrometer	Bruker Biospec