^In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

Summary

Wir beschreiben eine allgemeine Protokoll für die in-vivo-Zellortung mittels MRT in einem Mausmodell mit Ex-vivo-markierten Zellen. Ein typisches Protokoll für die Zellmarkierung, Bildaufnahme und Verarbeitung Quantifizierung ist inbegriffen.

Abstract

^In-vivo-19 F-MRT ermöglicht quantitative Zell Tracking ohne Verwendung ionisierender Strahlung. Es ist eine nicht-invasive Technik, die auf den Menschen angewendet werden können. Hier beschreiben wir ein allgemeines Protokoll zur Zellmarkierung, Imaging und Bildbearbeitung. Die Technik ist anwendbar auf verschiedene Zelltypen und Tiermodellen, obwohl hier konzentrieren wir uns auf eine typische Mausmodell für die Verfolgung murine Immunzellen. Die wichtigsten Themen für die Markierung von Zellen beschrieben werden, da diese die für alle Modelle. Ähnlich sind Schlüsselabbildungsparameter aufgeführt, obwohl die Details werden in Abhängigkeit von dem MRI-System und den einzelnen Setup variieren. Schließlich sind wir ein Bildverarbeitungsprotokoll für die Quantifizierung. Variationen für diese und andere Teile des Protokolls sind in der Diskussion Abschnitt bewertet. Bezogen auf die hier beschriebenen Einzelheiten des Verfahrens, muss der Benutzer das Protokoll für jeden spezifischen Zelltyp, Zell Etikett Tiermodell und Bilddarstellungsaufbau anpassen. Beachten Sie, dass die protocol können auch für den menschlichen Gebrauch geeignet sein, solange die klinische Beschränkungen erfüllt sind.

Introduction

In-vivo-Zellverfolgung ist wesentlich für die Optimierung und Überwachung von Zelltherapeutika ^1. Aufgrund der nicht-invasiven Natur, bietet hervorragende Möglichkeiten, um Bild Zellen in vivo zu überwachen. Magnetic Resonance Imaging (MRI) ist unabhängig von ionisierender Strahlung und ermöglicht eine überlegene Bildauflösung und der intrinsischen Weichteilkontrast. MRT-basierte Tracking-Zelle bereits klinisch verwendet worden, um dendritischen Zellen bei Melanompatienten ² folgen. Herkömmlichen klinischen MRI auf dem ¹ H-Kern, in der Mobil Wasser, die in Geweben durchgeführt. Es ist auch möglich, auf andere aktive Kerne, wie ¹³ C, ¹⁹ F und ²³ Na zuführen MRI. Doch nur ¹⁹ F-MRT wurde erfolgreich in vivo Zell Tracking, wie es bietet die höchste Empfindlichkeit nach dem ^1. H. angewendet Das Fehlen von MRT nachweisbare endogene ¹⁹ F im Gewebe ermöglicht eine hohe Selektivität für die SignalNachweis von exogenem ¹⁹ F-Kontrastmittel und ermöglicht die Quantifizierung der Fluorkonzentration direkt aus den Bilddaten. Für eine ausführliche Diskussion über die ¹⁹ F-MRT, siehe ^5.3. Eine Schlüsselfrage mit ¹⁹ F-MRT ist die Notwendigkeit der Entwicklung und Optimierung geeigneter ¹⁹ F-Zellen Etiketten, obwohl mehrere Etiketten entwickelt, mit einem Trend zur multimodalen Mittel ^6.

Das Protokoll beschreiben wir hier auf unsere Studien von Gruppen ^7-9, die die ersten waren, die in vivo quantitativ ¹⁹ F MRI-basierte Zellverfolgungs ^10,11 beschrieben ist. Das allgemeine Verfahren von Zellortung mittels ¹⁹ F-MRI, ist in Fig. 1 zusammengefaßt. Wir beschreiben einen allgemeinen Protokoll zur Markierung und Bildgebung von dendritischen Zellen (DCs) mit einem maßgeschneiderten Perfluorkohlenstoffs Kontrastmittel ^8. Das Abbildungsprotokoll ist allgemein anwendbar auf verschiedene Zelltypen, Etiketten und Tiermodellen. Diehier beschriebenen Zelltyp und Tiermodell sind nur als ein Beispiel genommen werden, und somit bieten wir keine Angaben zum Zellisolierung, Kennzeichnung, sondern konzentrieren sich auf die Bildgebungsprotokoll. Änderungen werden für jedes Label, Zelltyp, Tiermodell, und Imaging-Setup notwendig sein, und diese können in der Literatur gefunden werden kann oder muss, die die Forscher optimiert werden. Einige häufige Änderungen werden in die Diskussion einbezogen.

Protocol

Hinweis: Alle Experimente und Verfahren, die Tiere müssen in Übereinstimmung mit relevanten ethischen Richtlinien durchgeführt werden und mit den üblichen Tierpflege und humanen Anforderungen entsprechen.

1. Zellmarkierung (Standard-Protokoll mit Coinkubation)

1. In ¹⁹ F-Label ⁸ bis unreifen DCs in einer Konzentration von 4 mg/10 ⁶ Zellen (in 2 ml Medium). Vorsichtig schwenken zu mischen.
2. Inkubieren Sie die Zellen mit dem Label für 3 Tage vor Reifung und Ernte der DCs.
3. Sammeln Sie die DCs und entfernen Sie überschüssiges Etikett durch Waschen bei mindestens 3x in PBS. Zählen Sie die Zellen.
4. Resuspendieren in einem kleinen Volumen von PBS für die Injektion oder eine weitere Prüfung.

Hinweis: Dieses Protokoll ist für diese speziellen DCs und Label-relevant. Das Verfahren wurde in einer anderen Publikation ⁸ optimiert und die hier enthalten sind nur die Schritte, um eine Probe zu Bild vorbereiten, da der Schwerpunkt dieses Protokoll ist auf der Abbildung. HReferenz das Protokoll für die Isolierung und Kultur und Kennzeichnung eines bestimmten Zelltyps müssen entweder in der Literatur oder durch den Forscher optimiert werden. Eine Zusammenfassung aller anderen ¹⁹ F-Etiketten, die in der Literatur verwendet wurden anderswo ⁶ dargestellt.

2. Bestimmung von ¹⁹ F / Zell Mit ¹⁹ F-NMR-

1. Platzieren einer bekannten Anzahl markierter Zellen (typischerweise mehr als 0,5 x 10 ^6, oder eine Zahl, die in ausreichender Signal ergibt) in einem NMR-Röhrchen.
2. Werden 10 &mgr; l 5%-iger Trifluoressigsäure (TFA). Wenn die Resonanzfrequenz des TFA ungeeignet wegen mit dem Label überlappen ist, verwenden Sie eine alternative lösliche Verbindung, vorzugsweise mit einem einzigen ¹⁹ F Resonanz.
3. Legen Sie die Probe in einem NMR-Spektrometer und erhalten die ¹⁹ F-Spektrum. Sicherzustellen, dass die Bandbreite ausreichend für beide TFA (Referenz) und dem Agent.

Hinweis: Die TR sollte lang genug sein für fVoll Entspannung der Referenz und der Probe dreht (um 5 T _{1-Relaxationszeit} T ₁ der längsten Komponente in dem Rohr, typischerweise TR ~ 5-8 sec). Einige erfordern Spektrometer D ₂ O für eine Frequenz-Lock-Signal. Ein ^Standard-19 F-Spektrum ist ausreichend. Umfangreiche Mittelwertbildung oder höhere Zellzahlen wird erforderlich, wenn die Zellaufnahme des Etiketts schlecht ist oder wenn Zellzahlen sind niedrig. Das Spektrum sollte zwischen Referenz-und das entsprechende Etikett Peaks zentriert werden, es sei denn Korrekturen sind gemacht, um für Teilerregung Konto.

4. Berechnung der relativen Flächen unter den Peaks der Referenz und der Probe (oder der Hauptpeak der Probe), und dann die Berechnung der durchschnittlichen Anzahl von ¹⁹ der F / Zelle in der Probe.

Hinweis: Der gesamte Prozess muss wiederholt werden und gemittelt ausgiebig genug, um statistische Signifikanz zu erreichen. Dies kann auch mit Spektroskopie direkt an der MRT durchgeführt werden. However beachten, dass dieses Verfahren zeigt nur die durchschnittliche Belastung F ¹⁹ für eine große Anzahl von Zellen, nicht die Variabilität zwischen den Zellen. Überprüfen der Gleichförmigkeit Zellaufnahme erfordert die Anwesenheit einer fluoreszierenden Komponente mit der ¹⁹ F-Agent, so dass die Zellaufnahme kann mit Mikroskopie oder Durchflusszytometrie analysiert werden.

3. Überlegungen für Experimentelles Design - Handy-Injection

Durch die relativ geringe Empfindlichkeit der ¹⁹ F-MRI für Zellverfolgung, einem Tiermodell, bei dem die Zellen in großer Zahl zu lokalisieren ist in vivo-Bildgebung für erfolgreiche erforderlich. Typische Empfindlichkeitswerte reichen von 1.000-100.000 cells/voxel/1 Stunden Scanzeit ^6, mit einer Zellbelastung im Bereich von 10 ¹¹ -10 ¹³ Fluoratome.

Die Anzahl und die Häufigkeit der Bilderzeugungseinheiten müssen sorgfältig geplant werden, wie dies beeinflusst die Wahl des Anästhetikums. Beachten Sie, dass Isofluran nicht suitabl seine für ¹⁹ F-MRT, wenn die ¹⁹ F-Resonanzfrequenz von Isofluran ist nah an der des Label-Verbindung verwendet. Isofluran kann noch geeignet sein, wenn die Abbildungs ​​Sitzungen sind kurz genug, um signifikante Stau zu vermeiden. Mehrere alternative Anästhetika sind in der Literatur ^10,11 verwendet, ein Beispiel ist in der Bildgebungsprotokoll enthalten. Anästhetika eventuell auf verschiedenen Mausstämmen und Krankheitsmodelle optimiert werden.

4. Entwurf eines externen Referenz ¹⁹ F

1. Verwenden Sie eine externe Referenz die eine bekannte Menge von ¹⁹ F-Signal für die Quantifizierung ^12. Wählen Sie die Signalintensität des Referenz etwa vergleichbar mit vom Gegenstand erwartet.

Hinweis: Im allgemeinen ist es am einfachsten, wenn die Referenz-Verbindung die gleiche wie die Zelle Etikett, um die Entspannung Parametern entsprechen ist. Wenn spektroskopische Sequenzen oder Sequenzen ohne räumliche Lokalisierung verwendet werden, dann acompound mit einer unterschiedlichen chemischen Verschiebung erforderlich sein.

2. Ändern der Anordnung, Größe und Form des Referenz wie nötig, abhängig von der Region von Interesse (ROI). Anmerkung: Es ist im allgemeinen am einfachsten, Rohre mit einem gleichförmigen Querschnitt für die Referenz.

5. Imaging-und Maus-Vorbereitung

1. Verdünnen kommerziell verfügbaren Ketamin und Xylazin 1.10 v / v mit physiologischer Kochsalzlösung auf Stammlösungen von 10 mg / ml Ketamin und 2 mg / ml Xylazin ergeben.
2. Schalten Sie die Heizung im Scanner (typischerweise warme Luft), um sicherzustellen, die Bohrung wird warm sein, bevor die Maus abgebildet.
3. Inject 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin intraperitoneale Anästhesie zu initiieren. Hinweis: Diese Dosen sind für CD1 (ICR) und NU-Foxn1 ^nu 8 Wochen alten männlichen Mäusen getestet. Andere Stämme können leicht verschiedene Dosen benötigen, die in einem separaten Experiment optimiert werden sollten. Diese Dosis wird die Maus zu halten für eine narkotisiertKampf 45 min. Hinweis: Die Tiefe der Anästhesie ist normalerweise ausreichend, wenn das Tier zeigt keine Reaktion an einem Fuß Klemme.
4. Sobald betäubt, platzieren Sie das Tier in einem Tierschale und immobilisieren Bewegung während MRI verhindern. Wenn erforderlich, stellen Sie den externen Referenz neben dem Tier. Sowohl die Referenz-und die ROI (erwarteten Position der injizierten Zellen) ist in der Mitte der Spule sein. Das Tier sollte auf die Temperatur-und Atemkontrolle für physiologische Überwachung während der Abtastung angeschlossen werden.
5. Decken Sie die Augen der Maus mit sterilen Augensalbe Austrocknen während der langen Imaging-Sitzungen zu verhindern.
6. Wenn die Aufnahmezeit 40 Minuten übersteigt, bereiten zusätzliche Katheter zur Injektion von zusätzlichen Ketamin / Xylazin, bevor das Tier wecken. Position zwei getrennte subkutane Katheter mit den Arbeitslösungen von Ketamin und Xylazin. Verwenden Sie diese Katheter an die Maus geben einen zusätzlichen 2,5 mg Ketamin alle 20 Minuten nach der ersten 40 min. Falls erforderlich, weiter zu verlängern Anästhesie durch Injektion von weiteren 0,5 mg Xylazin durch den Katheter 100 Minuten nach der ersten Injektion. In allen Fällen sollten die Versuchszeit von 3 Stunden, außer vielleicht unter Terminal Narkose nicht überschreiten.
7. Sicherzustellen, dass die Maus direkt nach der ersten Injektion und erwärmt auf 37 ° C Körpertemperatur gehalten. Mit diesem Protokoll <80% Blutoxygenierung wurde unter Atemluft Atmosphäre nachgewiesen. Um Nebenwirkungen von der abgesenkten Blutsauerstoffzufuhr zu verhindern, verwenden Sie 100% Sauerstoff (0,3 l / min). Körpertemperatur und Atmung sollte während des gesamten Experiments und bis zur vollständigen Genesung des Tieres gesteuert werden. Beachten Sie, dass die spontane Atemfrequenz unter Ketamin / Xylazin ist sehr hoch (200-250/min). Unregelmäßigkeiten in der Atmung, anstatt die Atemfrequenz, können anzeigen, dass eine höhere Dosis notwendig, einen geeigneten Zustand der Anästhesie aufrechtzuerhalten. Die Maus wird spontan innerhalb von 20-30 min afte weckenr die letzte Dosis des Narkosemittels.

Anmerkung: Für Zellverfolgung, ist es notwendig, das Bild desselben Tieres mehr als einmal. In diesem Fall sollten die Imaging-Sitzungen unter Berücksichtigung der für die Freigabe der Narkose von den System-und Tier Richtlinien des Instituts Nutzung erforderliche Zeit eingeplant werden.

6. Imaging

¹ H-und Imaging-Anpassungen

1. Positionieren Sie das Tier im Inneren des Scanners, so dass der ROI ist im Isozentrum mit einer niedrigen Auflösung, anatomische Scan mit unterschiedlichen Schichtorientierungen (a Localizer).
2. Benutzen Sie die normalen Shim-Protokoll auf ^ein H, zB einer globalen Shim auf das gesamte Volumen im Inneren der Spule.
3. Stellen Sie die Referenzimpulsverstärkung (RG), dh die Sendeleistung gemessen in dB für eine 1 ms Hermite 90 °-HF-Puls, mit der Einstellung Scan vom Anbieter zur Verfügung gestellt.

Hinweis: Diese Einstellung wirdvariieren mit der Art der RF-Spule und ist für ¹⁹ F-MRI, da das Signal auf der Frequenz F ¹⁹ ist in der Regel zu gering für eine direkte Anpassung. Als Folge muss eine Schätzung der RG von Messungen an der ¹ H-Signal erfolgen. Für HF-Übertragung mit einer Oberflächenspule sollte die ¹ H RG zu einer Ebene parallel zu der Spule durch das Teil von Interesse angepasst werden, eine Volumenspule mit homogenen B ₁ Profil sind die genauen Einstellungen des Stell weniger wichtig.

4. Das folgende Protokoll ^19F Referenzimpulsverstärkungseinstellung funktioniert nur, wenn sowohl ¹ H-und ¹⁹ F-HF-Übertragung ist mit der gleichen (einzeln oder doppelt abgestimmten) HF-Spule ausgeführt. Für eine solche bildgebenden Einrichtung sollten die Spule Profil (B ₁ Sendefeld) auf ¹ H proportional zu der Spule ¹⁹ F-Profil, wenn eine feste RG angewendet wird, dh B _{1,1 H} = C * B _{1,19 F} mit Stützeortionality Konstante C.
   1. Um zu bestätigen, dass die Spule proportional Profile sind für einen bestimmten Aufbau, erwerben ein ¹ H-und ¹⁹ F-Flip-Winkel Karte (siehe folgenden Abschnitt auf der B _1-Korrektur) auf ein Rohr mit hochkonzentrierten ¹⁹ F, zB TFA in Wasser (1:1 v / v) unter Verwendung identischer Felder des Sicht (FOVs), vorher (Fig. 3).
   2. Mit der gleichen RG, überprüfen Sie, dass beide Karten sind identisch, außer für den globalen Faktor C
   3. Sobald der ¹ H-RG bestimmt ist, beachten Sie diese Nummer.
5. Führen Sie eine herkömmliche ¹ H-MRT-Untersuchung als anatomische Referenz für die ¹⁹ F-Bildgebung. Tune des Systems auf die ¹⁹ F-Frequenz des Zellmarker und führen ein ¹⁹ F MR scannen. Idealerweise ist die ¹⁹ F-MRT-Scan wird das gleiche Feld-of-view und Scheibe Auswahl als ¹ H-MRI, obwohl in der Regel mit geringerer Auflösung. Das Tier kann, sobald die Phantasie belebt werdenng ist abgeschlossen. Bildverarbeitung kann dann offline durchgeführt werden.
6. Bestimmen Sie die ¹⁹ F RG über die Beziehung _19F dB = -20 dB _1H * log ₁₀ (C). Schätzen Sie die ¹⁹ F-Agent in einer separaten Frequenz in-vitro-Experiment.

Hinweis: In vivo kann die genaue Frequenz leicht von Experiment zu variieren, um zu experimentieren aufgrund unterschiedlicher Bedingungen Shim. Die chemische Verschiebung der Artefakte exakte Frequenz ist daher in jedem Experiment durch ¹⁹ F MRS bestimmt werden, wenn möglich zu verhindern. Eine typische Scan für sehr niedrige ¹⁹ F-Signal würden die globalen (Puls-acquire)-Spektroskopie (TR = 200 ms, NEX = 3000, TA = 10 min, BW = 50 kHz) sein. NEX, so TA, kann dramatisch hohen und ¹⁹ F-Signal reduziert werden. Das ¹⁹ F Mittel Frequenz aus dem Spektrum nach der Fourier-Transformation und Phasenkorrektur bestimmt. NEX bezieht sich auf die Zahl der Anregungen, ist die Akquisitionszeit TA und BW dieBandbreite.

Hinweis: Typische Abbildungsparameter ⁹ auf einer 11.7T/16 cm engagierten Tierscanner sind: Eine anatomische ¹ H-Bildgebung Scan mit einem Turbo-Spin-Echo (TSE)-Sequenz mit TR / effektive Echozeit (TE _eff) = 2.200 msec/42.8 ms 8 Echos pro Anregung, NEX = 2, 10 aufeinanderfolgende, 1 mm dicke Scheiben schneiden, FOV = 1,92 x 1,92 cm ^2, 128 x 128-Matrix, also eine Auflösung von 150 x 150 x 1000 um ^3, TA = 1 min, BW = 50 kHz und eine lineare Phasenkodierungsschema. F ¹⁹ Bilder wurden mit der gleichen Reihenfolge und passenden Geometrie erworben, aber bei niedrigeren Auflösung in der Ebene und unteren BW (NEX = 256, 48 x 48-Matrix, also eine Auflösung von 400 x 400 x 1000 um ^3, TA = 57 min, BW = 10 kHz).

7. B ₁ Korrektur
   Mit einer HF-Spule mit inhomogenen B ₁ Profil, zB eine Oberflächenspule kann Quantifizierung von ¹⁹ F-Daten behindern, da das Signal hängtnicht nur auf ¹⁹ F-Konzentration, sondern auch von dem Abstand von der Spule. Erwerben Sie eine B ₁ Karte auf den ¹ H-Kanal, um rückwirkend korrigieren ¹⁹ F-Daten. Dies erfordert, dass ¹ H-und ¹⁹ F-Spule Profile sind identisch, mit Ausnahme der Proportionalitätsfaktor C sowie eine ausreichende ^1H Hintergrundsignal in Regionen ¹⁹ vorgesehen F. Ein Beispiel Protokoll zur Korrektur eines ¹⁹ F-Spin-Echo-Sequenz präsentiert wird, mit einem einfach abgestimmten Tx / Rx-Oberflächenspule abstimmbaren sowohl ¹ H und ¹⁹ F und B ₁ proportional Profile ^13.
   1. Erwerben Sie eine ¹ H-Flip-Winkel Karte mit den beiden Flip-Winkel ¹⁴ Verfahren. Erwerben Sie eine Gradienten-Echo-Scan mit sehr langen TR (> 3 mal ¹ HT ₁₎ mit einem geschätzten Flip-Winkel von knapp 90 °. Schließen Sie an die Spule. Erwerben Sie eine zweite Gradienten-Echo-Scan mit einem RG = -6 dB _1H, dh zweimal die KehrWinkel der ersten Abtastung.
   2. Das ¹ H-Flip-Winkel zu berechnen, α, bei Voxel (x, y, z) über die Signalintensität (SI) der ersten und zweiten Gradientenecho Scans: α (x, y, z) = arcos (SI _{GE, 1} ( x, y, z) / 2SI _{GE, 2} (x, y, z)) ^14. Das ¹⁹ F Flipwinkel identisch (mit Ausnahme des Faktors 1 / C) durch proportionale B ₁ Profile. Nach dem Faradayschen Prinzip der Gegenseitigkeit ^15, die Dämpfung von ¹⁹ F-Signalintensität von einer Spin-Echo-Sequenz (Anregungsflipwinkel α, Refokussierungsflipwinkel 2α) während der Signalempfang att _Rx (x, y, z) ~ α (x, y , z). Die Dämpfung aufgrund der unvollständigen Anregung att _Tx (x, y, z) ~ ³ sin (α (x, y, z)) ^16. Die Gesamtdämpfung als att = attRx attTx * = α * sin ³ (α) / 90 ° geschrieben. Beachten Sie, dass es auf 1 normiert ist bei perfekte 90 ° / 180 °-Anregung / Refokussierungsflipwinkel. Die _B-1 behoben19 F Bildsignalintensitäten SI _{19F, korr} über SI _{19F, corr} (x, y, z) = SI _19F (x, y, z) / att (x, y, z) berechnet wird.
   3. Um die Signalintensitäten von verschiedenen Experimenten vergleichen, legen Sie einen Verweis Rohr mit definierten ¹⁹ F-Konzentration im Blickfeld, und normalisieren die _{SI-19F, korr} zur mittleren Signal in der Referenz.

Hinweis: Andere HB ¹ ₁ / Flip-Winkel Mapping-Methoden verwendet werden können und verschiedene F ¹⁹ Pulssequenzen erfordern Änderungen att _{Tx, 19F.} Jede Art von B1 Korrekturverfahren werden zusätzliche Fehler in der Zelle Quantifizierung Verfahren einzuführen. Wenn genaue Quantifizierung Zelle ist der Haupt Prämisse, kann eine HF-Spule mit homogenem B1-Profil verwendet, um diesen Teil des Protokolls zu umgehen.

7. Bildverarbeitung

1. Erstellen Sie ^ein H-und ¹⁹ F Overlay-Bilder
   1. Exportieren Sie die Bilddatenfür die letzte ¹ H-und ¹⁹ F-Grße Bilder vom Scanner.
   2. Öffnen Sie die Dateien in einem Bildbearbeitungsprogramm wie ImageJ (Freeware, NIH).
   3. Führen Sie die Bildeinstellungen wie nötig (Beschneiden, Helligkeit, Kontrast) Halten Sie die Einstellungen für alle Bilder. Die ¹⁹ F-Bilder werden in der Regel brauchen, um auf eine höhere Auflösung, um die entsprechenden ¹ H-Bilder entsprechen hochskaliert werden.
   4. Render die F ¹⁹ Bilder in Falschfarben (wählen Sie einen anderen Look-up-Tabelle, unter dem Menü "Bild" im Bild J) und dann überlagern, auf die entsprechenden Bilder in ¹ H, um das Signal zu lokalisieren.
2. ¹⁹ F Quantifizierung
   1. Wählen Sie ein ¹⁹ F-Bild (Bild Größe) mit den relevanten Zellen und dem Referenz sichtbar.
   2. In einem Programm wie Bild J, ziehen ROIs über die relevanten Zellen, Referenz-und einem Bereich außerhalb des Subjekts (Lärm).
   3. Verwenden Sie den Befehl Analysierenund dann messen (oder einfach Strg + M), die mittlere Pixelintensität in diesen Regionen zu berechnen und ihre Umgebung. Sei S (Zellen) beziehen sich auf die Durchschnittspixelintensität des ROI über die Zellen. Multiplizieren Sie das mit dem Volumen (= Fläche x Schichtdicke), um die Gesamtsignal berechnen.
   4. Berechnung des SNR, beispielsweise mit Hilfe der Formel SNR = 0.65 x S (Zellen) / σ, σ ist, wo die Standardabweichung der Pixelintensität in einem ROI außerhalb der Probe, die frei von chemischen Verschiebungsartefakt (typischerweise im Hintergrund Luft) ^17. Wenn das SNR unter 5, kann eine Korrektur für das Signal aufgrund des Rauschens erforderlich sein und kann, wie an anderer Stelle ^{11 10} beschrieben durchgeführt werden.
   5. Ansonsten Berechnung der Gesamtmenge von ¹⁹ F durch Multiplizieren der Fläche der Referenz in der schichtDicke (um das Volumen zu berechnen) durch die Konzentration der ¹⁹ F in der Referenz für das Signal in der ROI über die Referenz verantwortlichdie bekannt ist und homogen angenommen.
   6. Multiplizieren diesen Wert durch die Gesamtsignal in der ROI über die Zellen, auf die Bezug auf die Menge an ¹⁹ F in den Zellen zu berechnen, dividiert durch das Gesamtsignal.
   7. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen durch Teilung diese Zahl mit dem Wert für ¹⁹ F / Zelle, die in Abschnitt 2 berechnet.

Representative Results

Hier zeigen wir die Ergebnisse für ein typisches Protokoll die die Übertragung des ¹⁹ F-markierten Zellen zu einer Homing-Lymphknoten. Fig. 2 zeigt ein ¹⁹ F-NMR-Spektrum von 10 ⁶ Zellen markiert mit einem TFA Referenz. Der Bilddarstellungsaufbau wurde wie in dem Protokoll (Fig. 3) beschrieben durchgeführt. Für die in vivo-Bildgebung verwendeten wir einen Referenz bestehend aus einem abgedichteten Zylinder des gleichen Etiketts für die Zellen zwischen den Füßen der Maus platziert verwendet. Eine repräsentative verarbeitete Bild wird in Fig. 4 gezeigt. Durch die Anwendung der in Abschnitt 7.2 beschriebenen Protokoll berechneten wir eine Zellzahl von ca.. 1,2 x 10 ⁶ bezogen auf das Ausgangsbild ¹⁹ F Größenordnung.

Fig. 1 ist. Die wichtigsten Schritte für ¹⁹ F-MRT-basierte Tracking-Zelle. in-vivo-Daten zu bestätigen. Wiedergabe mit Erlaubnis ^6. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

2. Vertreter ¹⁹ F-NMR-Spektrum. Das Spektrum zeigt das erhaltene ¹⁹ F-Signalaufgrund der bekannten Menge von Referenz, in diesem Fall TFA und der bekannten Anzahl von Zellen, "Probe" bezeichnet. Dies kann verwendet werden, um die Menge an Fluor pro Zelle, die zur in vivo-Quantifizierung von MR-Bilddaten erforderlich ist, berechnet werden.

3. Flip Winkel Karten von Rohren mit TFA in Wasser bei ¹ H-und ¹⁹ F-Kanal erworben. Der Faktor berechnet, um 1,03 ± 0,08 für diese Einrichtung sein. FA: Flip Winkel.

Abbildung 4. ^In-vivo-1 H / ¹⁹ F-Bild von dendritischen Zellen die Referenzfahrt auf Lymphknoten. Die Abbildung zeigt ein repräsentatives Bild einer Maus, mit ¹⁹ F-Signal sichtbar,in Falschfarben, in der Referenz (R) und der markierten Zellen. Nur die Schenkel der Maus wurden hier abgebildet. In diesem Beispiel migriert die markierte Zellen injiziert, um den drainierenden Lymphknoten. Die Abbildungsparameter werden im Text zusammengefaßt. Die Figur ist nur zur Illustration.

Discussion

Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt die allgemeine Vorgehensweise für die ^in-vivo-19 F-MRT Zellverfolgung. Trotz der beschriebenen Co-Inkubation Verfahren gibt es mehrere verschiedene Protokolle für die Markierung von Zellen mit einem ¹⁹ F enthält. Jedoch ist die Co-Inkubation häufig verwendet und kann durch Zugabe von Transfektionsmittel ⁶ optimiert werden zB. Die tatsächliche Zellmarkierungsprotokoll wird vom Zelltyp abhängig. Nur Tastenbeschriftung Schritte werden in dem Protokoll hier beschrieben. Im allgemeinen wird das Etikett erstellt und für einen ausgewählten Zeitraum im Bereich von einigen Stunden bis zu einigen Tagen bis zu den Zellen gegeben. Schließlich müssen die Zellen sorgfältig gewaschen werden, um überschüssiges Etiketten entfernen, insbesondere wenn die Quantifizierung der Bilddaten aus ³ durchgeführt werden. Wenn der ¹⁹ F Mittel ein Fluoreszenz-Tag, das Vorhandensein des Etiketts außerhalb (oder nicht gebundenen) die Zellen unter Verwendung von Mikroskopie nachgewiesen werden. Nach der Etikettierung ist es notwendig, die Zellen zu studierenLebensfähigkeit und Funktionalität in Bezug auf unmarkierten Zellen (z. B. durch Trypanblau-Ausschluss-Assay). Zell-spezifische Funktionstests, wie die Fähigkeit, T-Zellen im Fall von DCs aktivieren, muss ebenfalls ausgeführt werden. Schließlich, da einige ^nicht-19F MRI Etiketten haben eine Wirkung auf die Zellmigration ^18, solche Tests auch für ¹⁹ F-Etiketten, insbesondere bei hohen Ladezelle enthalten sein.

Das Protokoll für die Tiermodell ist auch abhängig von den Anforderungen des Benutzers. Es ist jedoch wichtig, um die strengen Empfindlichkeitsgrenzen von ¹⁹ F-MRT erinnern, bei der Planung von Experimenten. Veröffentlicht Empfindlichkeitswerte reichen von 1,000-00,000 cells/voxel/1 Stunden zeit ^6, mit einer Zellbelastung im Bereich von 10 ¹¹ -10 ^{13 19} F. Empfindlichkeit und erwartete Label-Konzentration in dem Bereich von Interesse auch Auswirkungen auf die Bildaufnahmeparameter. Beispielsweise kann die Schichtdicke für die ¹⁹ F-Bild-Anpassung verwendet werden usted zu der der ¹ H-Bilder entsprechen oder eine viel dickere Bereich (wie in der gesamten Lymphknoten oder Region von Interesse in einer einzigen Scheibe) zu decken. Typischerweise wird die ¹⁹ F-Bildgebung bei niedrigeren Auflösung durchgeführt, um die Signalerkennung zu maximieren, zumal hohe Auflösung ist in der Regel nicht notwendig, Strukturen wie Lymphknoten zu unterscheiden. Wenn das Signal ausreichend ist, kann eine größere Anzahl dünnerer Scheiben erfasst werden und das Gesamtsignal über dem interessierenden Volumen aus diesen berechnet. Allerdings werden die optimalen Parameter müssen für jede Anwendung einzeln abgeleitet werden.

Wir beschreiben eine Injektionsnarkose mit Ketamin-Protokoll / Xylazin Vermeidung von fluorierten Gasen wie Isofluran-Inhalation. Andere Protokolle sind in der Literatur ^10,11 verwendet. In allen Fällen werden diese Protokolle müssen für die Maus-Stamm, Alter, Geschlecht, Gesundheit und die Länge und Häufigkeit der Abbildungseinheiten eingestellt werden.

NHALT "> Mehrere ¹⁹ F-MRT-Bildgebungssequenzen sind für die Zellverfolgung verwendet wurde, für eine Übersicht siehe ^6. Unsere Bildgebungsprotokoll kann leicht geändert werden, um anderen bildgebenden Sequenzen umfassen werden. Doch die hier beschriebenen Quantifizierungsmethode berücksichtigt nicht jede Teilvolumen nehmen Effekte sind Unstimmigkeiten bei der Auswahl der ROIs, Veränderungen in der Entspannung Parameter des Etiketts in vivo oder Veränderungen der zellulären ¹⁹ F Belastung. Diese Probleme anderswo ³ beschrieben. Kurz gesagt, hat der Fehler gefunden worden, um in erträglichen Grenzen für Längs-Tracking-Zelle sein ^10. Im Vergleich zu diesen früheren Arbeiten, die wir vorschlagen, zusätzlich eine Bildkorrekturschema für die Nutzung der Fläche HF-Spulen durch die Abbildung des B1-Feldes. Abhängig von der spezifischen HF-Spulenaufbau ist es wichtig, sich bewusst Grenzen der B1-Mapping-Techniken, die gewesen sein gut untersucht im Rahmen der ^{1 H-MRI-16.} Beispielsweise für die hier vorge B1 DoppelwinkelverfahrenKarte ist am genauesten für Flip-Winkel-Paare knapp unter 90 ° -180 ° ¹⁴ und erhebliche Fehler kann in anderen Regionen eingeführt werden. Dennoch, nach entsprechender Validierung in vitro, wie rückwirkenden Korrektur weiter verbessern den Zell Quantifizierung. Im Allgemeinen empfehlen wir Bestätigung der Daten mit etablierten Techniken, zumindest anfänglich. Dies wird typischerweise in Kombination mit anderen in-vivo-Bildgebungstechniken, z. B. optische Bildgebung durchgeführt, um auszuschließen, große Fehler. In den meisten Fällen ist die histologische Beurteilung notwendig, ¹⁹ F-Label Lage genau beurteilen und Korrelation mit den Bilddaten zu ermöglichen. Dies erfordert die Zugabe eines fluoreszierenden Farbstoffs zu dem ¹⁹ F enthält.

Schließlich, obwohl ¹⁹ F MRI noch nicht zur klinischen Zellverfolgung angewendet wurden, wäre es möglich, dieses Protokoll für den menschlichen Gebrauch zu ändern. Die wichtigsten Änderungen notwendig wäre, durchzuführen, wie viel von der optimsierung und das Setup vorher wie möglich (um die Länge der Zeit, das Thema ist in den Scanner zu minimieren) und Abbildungsparameter anpassen, um im Rahmen von klinischen spezifische Absorptionsrate (SAR) Beschränkungen zu halten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PBS	Sigma-Aldrich	MFCD00131855
TFA	Sigma-Aldrich	76-05-1
Ketamine (Ketavet)	Pfizer	778-551
Xylazine (Rompun)	Bayer	QN05 cm92
Ophtosan	Produlab Pharma	2702	eye ointment
Material name
MRI scanner	Bruker Biospec
NMR spectrometer	Bruker Biospec