Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

Published: January 6, 2014 doi: 10.3791/50823
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 3, 1,3
1Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology, MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital

Summary

الهجرة عبر الظهارية العدلات استجابة للعدوى البكتيرية المخاطية يساهم في الإصابة الظهارية والأمراض السريرية. وقد تم تطوير نموذج في المختبر يجمع بين مسببات الأمراض، والعدلات البشرية، وطبقات الخلايا الظهارية البشرية المستقطبة التي تزرع على مرشحات عبرويل لتسهيل التحقيقات نحو كشف الآليات الجزيئية التي تنسق هذه الظاهرة.

Abstract

الأسطح المخاطية بمثابة حواجز واقية ضد الكائنات المسببة للأمراض. يتم تنشيط الاستجابات المناعية الفطرية عند استشعار مسببات الأمراض مما يؤدي إلى تسلل الأنسجة مع الخلايا الالتهابية المهاجرة ، في المقام الأول العدلات. هذه العملية لديها القدرة على أن تكون مدمرة للأنسجة إذا كانت مفرطة أو عقدت في حالة لم تحل.  ويمكن استخدام النماذج المستنبطة في المختبر لدراسة الآليات الجزيئية الفريدة المشاركة في الهجرة العدلية الناجمة عن مسببات الأمراض عبر الظهارية. يوفر هذا النوع من النماذج براعة في التصميم التجريبي مع فرصة للتلاعب الخاضع للرقابة من مسببات الأمراض، حاجز الظهارية، أو العدلات. العدوى المسببة للأمراض من السطح apical من monolayers الظهارية المستقطبة نمت على مرشحات عبرويل نفاذية يحرض القاعدية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لهجرة apical عبر الظهارية من العدلات المطبقة على السطح القاعدي. يوضح النموذج المختبري الموصوف هنا الخطوات المتعددة اللازمة لإثبات هجرة العدلات عبر طبقة أحادية ظهارية رئوية مستقطبة أصيبت بمسببات الأمراض P. aeruginosa (PAO1). يوصف بذر وزراعة الحيوانات المتحولة التي يمكن اختراقها بخلايا ظهارية رئوية مشتقة من الإنسان ، إلى جانب عزل العدلات من الدم البشري الكامل وزراعة PAO1 وK12 E. coli غير المسببة للأمراض (MC1000).  وتظهر عملية الهجرة والتحليل الكمي للنيوتروفيل المهاجر بنجاح والتي تمت تعبئتها استجابة للعدوى المسببة للأمراض ببيانات تمثيلية، بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية. يمكن معالجة هذا النظام النموذجي في المختبر وتطبيقه على الأسطح المخاطية الأخرى. يمكن أن تكون الاستجابات الالتهابية التي تنطوي على تسلل العدلات المفرط مدمرة للأنسجة المضيفة ويمكن أن تحدث في غياب العدوى المسببة للأمراض. إن الفهم الأفضل للآليات الجزيئية التي تعزز الهجرة عبر الظهارية العدلية من خلال التلاعب التجريبي بنظام الفحص المشترك في المختبر الموصوف هنا لديه إمكانات كبيرة لتحديد أهداف علاجية جديدة لمجموعة من الأمراض المعدية المخاطية وكذلك الالتهابات.

Introduction

السطوح المخاطية بمثابة حواجز مادية ومناعية توفر الحماية من التهديدات الخارجية المنتشرة في البيئة1،2. يمكن اختراق هذا الحاجز الظهاري الواقي عندما تغزو الكائنات المسببة للأمراض2. في حالة الممرض البكتيري ، غالبا ما يحرض هذا اللقاء على عملية التهابية عن طريق تنشيط الجهاز المناعي الفطري مما يؤدي إلى تعبئة سريعة للخلايا الحبيبية المستجيبة الأولى المعروفة باسم العدلات2-4. يتم إنتاج عوامل العلاج الكيميائي التي تسهل تجنيد العدلات جزئيا من قبل الخلايا الظهارية المخاطية التي تسعى لتخليص المضيف من الممرض المخالف2-4. يمكن أن يسبب تسلل العدلات المفرط أو غير المحسوم للسطح الظهاري المخاطي أمراضا كبيرة1،5. هذا هو نتيجة لتلف الأنسجة غير محددة الناجمة عن ترسانة العدلات المضادة للبكتيريا5-7. في مثل هذه الحالات ، تطغى قدرة إزالة البكتيريا من العدلات من خلال تدمير الأنسجة المضيفة أثناء الإهانة المعدية.  يمكن أن يؤدي تعطيل وظيفة الحاجز الظهاري الواقي إلى تعزيز تعرض الأنسجة الأساسية للكائنات الحية الدقيقة و / أو السموم ، مما يزيد من تفاقم أمراض الأمراض8،9. ويمكن ملاحظة هذه العواقب في أجهزة متعددة بما في ذلك الرئة والجهاز الهضمي1,5. وعلاوة على ذلك ، تتميز الحالات الالتهابية غير المعدية مثل نوبات الربو الشديدة ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) ومرض التهاب الأمعاء (IBD) بالاختراق المرضي للحاجز الظهاري المخاطي من خلال استجابة العدلاتالمفرطة 4،5،10-12.

عملية معقدة من تجنيد العدلات بعد العدوى المخاطية ينطوي على عدة خطوات مجزأة1,5,13,14. أولا، العدلات يجب أن تخرج عن الدورة الدموية عن طريق سلسلة من التفاعلات بين الخلايا التي تسهل الهجرة عبر البطانية1،13. العدلات المقبل التنقل الفضاء الخلالي القائمة التي تحتوي على مصفوفة خارج الخلية1,14. للوصول إلى تجويف الغشاء المخاطي المصاب ، يجب أن تهاجر العدلات عبر الحاجز الظهاري1،4،5. وغالبا ما يتم التحقيق في هذه الظاهرة متعددة الخطوات المعقدة في المجموع باستخدام نماذج حيوانية في الجسم الحي للعدوى15. هذه النماذج مفيدة لتحديد ضرورة وجود عوامل محددة، مثل chemokines، جزيئات التصاق، أو مسارات الإشارات التي تشارك في العملية الشاملة ولكنها غير كافية إلى حد كبير لحل المساهمات الجزيئية الحاسمة لكل خطوة مجزأة متميزة16. وقد شارك في زراعة نظم المختبر النمذجة عبر البطانية، عبر مصفوفة، أو الهجرة عبر الظهارية من العدلات مفيدة بشكل خاص في هذا الصدد1،14،16،17.

وقد تم تطوير نظام قوي للثنايا المشتركة للتحقق من شفرة الآليات المسؤولة عن الهجرة عبر الظهارية العدلات استجابة للعدوى المسببة للأمراض18-22. هذا النموذج ينطوي على إصابة السطح apical من طبقات الخلايا الظهارية البشرية المستقطبة مع مسببات الأمراض البكتيرية تليها تطبيق العدلات البشرية المعزولة حديثا على سطح basolateral18-22. تهاجر العدلات عبر الحاجز الظهاري استجابة للمنتجات الكيميائية المشتقة من الظهارية التي تفرز بعد العدوى المسببة للأمراض18،21-23. وقد تم استخدام هذا النظام النموذجي باستخدام الثقافات الظهارية المعوية والرئة المعرضة لمسببات الأمراض البكتيرية المناسبة الأنسجة محددة وكشف النقاب عن آليات جزيئية جديدة من المرجح أن تكون مهمة لعملية تجنيد العدلات خلال العدوى المخاطية3,8,19,24-28. قوة هذا النموذج في المختبر الزراعة المشتركة هو أن النهج الاختزالي تمكن المحقق من التلاعب تجريبيا الممرض، حاجز الظهارية، و / أو العدلات في نظام تسيطر عليها بشكل جيد، استنساخ عالية، وغير مكلفة إلى حد ما. يمكن الاستفادة من البصيرة التي تم جمعها من هذا النهج بشكل فعال لإجراء تحليل مركز للأحداث المجزأة أثناء توظيف العدلات باستخدام نماذج عدوى الجسم الحي 22,29,30.

توضح هذه المقالة الخطوات المتعددة اللازمة لنجاح إنشاء هذا النموذج القابل للاستنساخ لاستكشاف الهجرة العدلية الناجمة عن مسببات الأمراض عبر الظهارية. وترد الحواجز الظهارية الرئة المصابة بمسببات الأمراض Pseudomonas aeruginosa في هذه المقالة; ومع ذلك، يمكن استبدال الظهارة الأنسجة الأخرى ومسببات الأمراض مع تعديلات طفيفة. البذر وزراعة طبقات الخلايا الظهارية الرئة المستقطبة على الكولاجين المقلوب المغلفة مرشحات عبرويل نفاذية مفصلة هنا، كما هو نمو المسببة للأمراض P. aeruginosa وعزل العدلات من الدم كله. يتم تقديم كيفية دمج هذه المكونات لمراقبة الهجرة الناجمة عن مسببات الأمراض العدلات عبر الظهارية جنبا إلى جنب مع الضوابط الإيجابية والسلبية المناسبة لإنشاء المقايسة القابلة للاستنساخ. وتناقش براعة هذا النهج لدراسة مختلف جوانب الهجرة العدلية الناجمة عن مسببات الأمراض عبر الظهارية مع الإشارة إلى دراسات محددة في الأدبيات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يجب تنفيذ الخطوات (1-3) في بيئة معقمة تحت غطاء تدفق صفح.

1. كولاجين طلاء Transwells

  1. جعل محلول الكولاجين 30 ميكروغرام / مل. تمييع 3 ملغ / مل مخزون الكولاجين 1:100 في الإيثانول 60٪ التي تم تمريرها من خلال وحدة تصفية 0.2 ميكرومتر.
  2. دوامة المخفف 30 ميكروغرام / مل الحل. ملاحظة: ليس من الضروري دوامة محلول مخزون الكولاجين 3 ملغم / مل ، لأن هذا الحل لزج للغاية ويمكن إدخال فقاعات الهواء ، مما قد يقلل من الدقة عند الأنابيب.
  3. إزالة 0.33 سم2 transwells منطقة النمو مع حجم المسام من 3 ميكرومتر من التعبئة والتغليف خارج ووضع لوحة 24 جيدا تحتوي على 12 transwells رأسا على عقب داخل غطاء محرك السيارة.
  4. ارفعي الطبق السفلي وضعيه جانبا. ملاحظة: سوف Transwells الآن رأسا على عقب يستريح فوق غطاء لوحة 24 جيدا
  5. تشغيل الموقد بونسن. لهب hemostat للعقم والسماح لتبرد.
  6. مع الهموستات العقيمة، نقل transwells إلى طبق بيتري 150 ملم × 25 ملم، والاحتفاظ بها في موقف مقلوب. ملاحظة: تأكد من الحفاظ على عقم لوحة فارغة 24 جيدا بالإضافة إلى غطاء لاستخدامها لإيواء transwells مرة واحدة وقد تم بذرها مع الخلايا الظهارية.
  7. ماصة 70 ميكرولتر من محلول الكولاجين 30 ميكروغرام / مل على غشاء تصفية كل transwell مقلوب. ملاحظة: يجب أن يحمل التوتر السطحي هذا الحجم من الحل في مكانه حيث لا توجد جدران حول غشاء الفلتر عند الوصول إلى سطح الجانب السفلي. كن حذرا من أن محلول الكولاجين لا يقطر أسفل جانب ترانسويل وتجنب نقل transwells أثناء إجراء الطلاء.
  8. اترك غطاء طبق بيتري لمدة لا تقل عن 4 ساعات للسماح لمحلول الإيثانول بالتبخر. للحفاظ على العقم خلال هذه العملية الحفاظ على مروحة غطاء محرك السيارة والأشعة فوق البنفسجية على.
  9. بعد أن تجفف الأطباق، يمكن استخدامها على الفور أو تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع شريطة أن يكون غطاء طبق بيتري في مكانه ويتم الحفاظ على العقم.

2. قارورة مرور الخلايا الظهارية لزرع Transwells

(يصف هذا البروتوكول على وجه التحديد التعامل مع خط الخلية الظهارية الرئة H292 لتوليد الحواجز الظهارية نمت على transwells. يمكن استخدام خطوط الخلايا الظهارية الأخرى مع تعديلات طفيفة.)

  1. إعداد الثقافة المتوسطة بإضافة 10٪ الحرارة المعطل مصل البقر الجنيني (HI-FBS) و 1x البنسلين / ستريبتومايسين إلى RPMI 1640.
  2. وسائل الإعلام الدافئة، تريبسين-EDTA (T-EDTA)، وD-PBS في 37 حمام مائي درجة مئوية.
  3. إزالة قارورة T-75 التي تحتوي على خلايا من الحاضنة وتقييم التقاء بصريا مع المجهر مقلوب. ملاحظة: عند استخدام خلايا H292، يجب أن تكون القوارير قريبة من أو التقاء كامل.
  4. أسبيرات وسائل الإعلام من القارورة. تقليل طول الوقت الذي الخلايا الجافة عن طريق وجود الحل التالي في غطاء محرك السيارة مع غطاء خففت.
  5. إضافة 5 مل D-PBS إلى قارورة T-75 ودوامة. تجنب خلق فقاعات. إزالة برنامج تلفزيوني عن طريق الطموح.
  6. إضافة 3 مل T-EDTA إلى قارورة T-75 ودوامة لتغطية القاع.
  7. إزالة معظم T-EDTA، وترك ما يقرب من 0.3 مل في قارورة T-75.
  8. توزيع الحجم الصغير المتبقي من T-EDTA على مساحة سطح الخلايا ووضعها في حاضنة مرطبة في ظل ظروف الثقافة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2).
  9. بعد فترة من الزمن، قم بإزالة القارورة من الحاضنة. ملاحظة: يجب أن تنفصل الخلايا بسهولة عن سطح القارورة عن طريق النقر بلطف على القارورة على جانبها. يجب الآن تقريب الخلايا وتعويمها عند تصورها تحت المجهر. متوسط الوقت الذي سيستغرقه هذا لخلايا H292 هو 5-10 دقيقة.
  10. إضافة 10 مل وسائل الإعلام الثقافة إلى قارورة لتحييد T-EDTA والخلايا resuspend. وضع حل الخلية في طرف ماصة وإخراج على سطح قارورة تحتوي على خلايا ما يقرب من خمس مرات لإعادة إنفاق جميع الخلايا.
  11. نقل الخلايا التي أعيد إنفاقها إلى أنبوب 15 مل لزرع transwells. ملاحظة: تركيز خلايا H292 التي أعيد إنفاقها المعدة بهذه الطريقة يجب أن يتراوح بين 1 × 106- 1.8 × 106 خلايا / مل.

3. بذر الكولاجين المغلفة Transwells مع الخلايا الظهارية

  1. إضافة 70 ميكرولتر من محلول الخلية resuspended من أنبوب 15 مل إلى كل ترانزويل المغلفة الكولاجين مقلوب. ملاحظة: سوف حلول الخلية H292 مع نطاق تركيز بين 1 × 106-1.8 × 106 خلايا / مل تسفر عن ما يقرب من 70،000-120،000 الخلايا / transwell.
  2. اخلط تعليق الخلية عن طريق قلب الأنبوب برفق بشكل دوري لمنع الخلايا من الاستقرار إلى أسفل الأنبوب 15 مل أثناء بذر الأنابيب. ملاحظة: لا دوامة الخلايا وتوخي الحذر من أن تلميح ماصة لا يأتي في اتصال مباشر مع الكولاجين المغلفة مرشح الغشاء.
  3. مرة واحدة وقد تم بذر جميع transwells مقلوب مع الخلايا الظهارية، واستبدال غطاء طبق بيتري ووضع بعناية في حاضنة ثقافة الأنسجة، رطب، 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. الحرص على تجنب إزعاج تعليق الخلية التي تمت إضافتها إلى غشاء فلتر الكولاجين المغلفة.
  4. الحفاظ على transwells مقلوب في حاضنة زراعة الأنسجة، رطب، 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها. ملاحظة: يجب أن تظل فقاعة السائل المحتوي على خلايا مرتبطة بغشاء الفلتر النفاذ للمتحول طوال فترة الحضانة بين عشية وضحاها. إذا أصبح غشاء الفلتر جافا بسبب تبخر السائل أو لأن السائل يقطر أسفل جانب الزوال ، فقد لا تنمو الطبقات الظهارية بشكل صحيح.
  5. في اليوم التالي، إضافة 1 مل وسائل الإعلام في لوحة 24-جيدا العقيمة الأصلي والوجه كل transwell مقلوب باستخدام hemostat معقمة في كل بئر تحتوي على 1 مل من وسائل الإعلام.
  6. إضافة 0.2 مل وسائل الإعلام في الغرفة العليا من كل transwell والعودة إلى حاضنة زراعة الأنسجة، رطب، 37   درجة مئوية، 5٪ CO2.
  7. يمكن استخدام إعادة الزرع المقلوب H292 من 8 أيام إلى شهر واحد بعد البذر. ملاحظة: نقترح الانتظار لمدة لا تقل عن 8 أيام بعد بذر النبتة لضمان أن الطبقات الأحادية الظهارية قد تشكلت بالكامل وتظهر حاجزا وظيفيا. يمكن للمرء اختبار الحاجز الظهاري H292 عن طريق تحديد ما إذا كان أحادي الطبقة قادر على تقييد التدفق عبر الظهارية من بيروكسيديز الفجل الحصان البروتين (HRP) بعد إضافة إلى سطح البازلتريا18.

4. إعداد البكتيريا للعدوى من الطبقات الظهارية على Transwells

  1. قبل يوم واحد من التجربة، استخراج مستعمرة واحدة من P. aeruginosa PAO1 من لوحة العزلة Pseudomonas أجار ومستعمرة واحدة من K12 E. القولونية MC1000 من لوحة لوريا-بيرتاني (LB) أغار ووضعها في أنابيب منفصلة تحتوي على 3 مل من مرق LB. تنبيه: P. aeruginosa هو ممرض بشري ، يجب اعتماد تدابير السلامة القياسية BSL2 عند التعامل مع هذا الكائن الحي.
  2. هز بين عشية وضحاها في 225 دورة في الدقيقة في بيئة 37 درجة مئوية.
  3. في اليوم التالي، إزالة 1 مل من الثقافات البكتيرية الكثيفة ووضعها في أنابيب Eppendorf 1.5 مل.
  4. تدور في microfuge في 15800 × غرام لمدة 5 دقائق ثم إزالة supernatant.
  5. إعداد هانكس 'متوازن محلول الملح مع الكالسيوم والمغنيسيوم (HBSS +) مقدما. أضف 23.8 غرام HEPES و97.5 غ من مسحوق HBSS+ إلى 9.5 لتر من الماء المقطر. إضافة كميات صغيرة من 10 M NaOH إلى الحل، في حين رصد pH حتى يتم التوصل إلى رقم س مستقر من 7.4. رفع مستوى الصوت إلى 10 لتر وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  6. Resuspend كل بيليه البكتيرية مع 1 مل HBSS +. دوامة للتأكد من تحقيق تعليق البكتيرية حتى.
  7. تدور مرة أخرى في 15800 × ز لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant.
  8. Resuspend بيليه PAO1 مع 0.6 مل HBSS + وMC1000 بيليه مع 0.5 مل HBSS +. دوامة تعليق البكتيرية.
  9. مزيد من التخفيف من PAO1 وMC1000 الكريات التي أعيد إنفاقها 1:100 في HBSS +. على سبيل المثال، إضافة 50 ميكرولتر من بيليه PAO1 0.6 مل إعادة إنفاق إلى 5 مل HBSS +. ملاحظة: باستخدام قياسات الكثافة البصرية (OD) لتحديد كثافة الثقافة وكذلك منهجية طلاء تخفيف وحدة تشكيل المستعمرة القياسية (CFU) ، فإن حلول PAO1 و MC1000 التي تم إعدادها بهذه الطريقة تسفر باستمرار بين 3 × 107-6 × 107 CFU / مل. ترتبط كثافة الثقافة البكتيرية بشكل إيجابي مع قياس OD للثقافة عند 600 نانومتر ويمكن استخدام هذا الارتباط لتقدير تركيز الخلايا البكتيرية. لتأكيد تركيز الخلية البكتيرية ، يمكن تخفيف الثقافة إلى تركيز مقدر منخفض للغاية ومطلي على طبق أجار بحيث يتوقع المرء وجود ما بين 30-200 خلية بكتيرية على اللوحة. تنتشر الخلايا عبر اللوحة وتحتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية بحيث تشكل كل خلية مستعمرة فردية من الخلايا الكبيرة بما يكفي لتكون مرئية ويمكن بعد ذلك عد المستعمرات.

5. عزل العدلات من الدم الكامل

  1. حمض سيترات dextrose الحل (ACD) يستخدم كمضاد للتخثر وأعدت بإضافة 6.9 غرام حمض الستريك، 12.5 غرام سيترات الصوديوم، و 10 غرام dextrose إلى 500 مل الماء المقطر. بمجرد حل جميع المكونات ، يتم تعقيم محلول ACD عن طريق المرور عبر وحدة تصفية 0.2 ميكرومتر. تخزين حل ACD في 4 درجة مئوية.
  2. قبل سحب الدم، إضافة 5 مل ACD إلى 50 مل حقنة وإرفاق 21 × 3/4 إبرة فراشة G مع 12 في الأنابيب.
  3. تطبيق tourniquet، مسح الوريد مع الكحول، وإدراج إبرة. ملاحظة: يجب أن تتم الموافقة على أي بروتوكول بحثي يشمل الأشخاص من قبل مجلس مراجعة مؤسسي ويجب تقديم موافقة خطية مستنيرة من كل متبرع بالدم. على سبيل المثال، تمت الموافقة على التجارب التي أجريت باستخدام هذا البروتوكول من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للمستشفى العام في ماساتشوستس وتم تعيين بروتوكول #1999-P-007782.
  4. رسم ببطء 45 مل من الدم ضمان أن يختلط الدم مع ACD مرة واحدة في الحقنة.
  5. عندما تم رسمها 45 مل (50 مل الحجم الإجمالي), فك التورنيكيت قبل إزالة الإبرة. تطبيق الضغط على الفور على الجرح بالشاش العقيم عند إزالة إبرة.
  6. نقل الدم ببطء إلى أسفل الجانب من أنبوب 50 مل على مدى ما يقرب من 5-10 ثانية.
  7. تدور في الطرد المركزي في 1000 × ز مع تعطيل الفرامل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: خطوة إضافية تنطوي على تخفيف الدم كله في برنامج تلفزيوني- وتراكب دقيق من الدم المخفف على فيكول-باك قبل الطرد المركزي يمكن استخدامها لتحقيق مستوى أعلى قليلا من نقاء العدلات عن طريق فصل أكثر كفاءة معطف بافي من المحببات8. حذف هذه الخطوة يعمل على توفير الوقت دون التأثير بشكل كبير على العائد أو النقاء لأغراض هذا المقايسة، وبالتالي نحن نفضل عدم إدراج تراكب الدم على خطوة فيكول باك.
  8. بينما الدم يدور، ببطء شديد إضافة 1 غرام الجيلاتين في 50 مل ساخنة هانكس 'محلول الملح المتوازن دون الكالسيوم والمغنيسيوم (HBSS(-)) لإعداد محلول الجيلاتين 2٪. حافظ على الحل عند 37 درجة مئوية.
  9. أسبيرات والتخلص من البلازما من أنبوب 50 مل من الدم باستخدام طرف ماصة الزجاج الذي تم علاجه مع Sigmacote.
  10. استمر في التجسس بعناية فائقة لإزالة معطف بافي ، الذي يحتوي على خلايا الدم البيضاء ، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية.
  11. كما يتم إزالة معطف برتقالي ببطء، فإن المواد الملبدة بالغيوم الصفراء بيضاء فوق خلية الدم الحمراء (RBC) طبقة تختفي. وقف الطموح مرة واحدة تتم إزالة معطف برتقالي وطبقة RBC يمكن تصورها بوضوح عند عرض من فوق الأنبوب.
  12. حاول عدم إزعاج طبقة RBC حيث أن الخلايا الحبيبية ، ومعظمها العدلات ، بالقرب من سطح طبقة RBC ، ولكنها غير مرئية.
  13. إلى حجم 15 مل طبقة RBC، إضافة 30 مل الحارة 2٪ حل الجيلاتين (2x حجم طبقة RBC).
  14. عكس أنبوب بلطف لخلط، مع الحرص على تقليل تشكيل فقاعات.
  15. احتضان في 37   درجة مئوية لمدة 25 دقيقة ملاحظة: يجب أن تجمع RBCs وتستقر في القاع. كبديل للجيلاتين، يمكن استخدام dextrans الوزن الجزيئي كبيرة لرواسب RBCs8.
  16. بعد الحضانة، نقل الطبقة العليا حل المحمر الخفيفة التي تحتوي على الحبيبات في أنبوب 50 مل جديدة مع ماصة، مع الحرص على عدم تعكير صفو طبقة RBC الظلام استقر أثناء النقل. بمجرد فصلها، تجاهل طبقة RBC الداكنة.
  17. تدور نقل محلول المحمر الخفيفة التي تحتوي على الحبيبيات وبعض RBCs في الطرد المركزي في 1000 × ز مع الفرامل تنشيط لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من أجل بيليه الخلايا.
  18. صب قبالة أو يستنشق supernatant بعناية، كما بيليه الخلية المحمر التي سوف تشكل بعد الطرد المركزي فضفاضة عموما.
  19. إعداد RBC تحلل العازلة مقدما وتخزينها في 4 درجة مئوية بإضافة 8.29 غرام كلوريد الأمونيوم (NH4Cl), 1 غرام بيكربونات الصوديوم (NaHCO3),و 0.038 ز EDTA إلى 1 L الماء المقطر في كوب. تخزين مخزن تحلل RBC في 4 درجة مئوية.
  20. Resuspend وتفتيت بيليه الخلية المحمر مع حجم صغير من الباردة تحلل RBC العازلة. مرة واحدة بيليه الخلية في الحل، وملء أنبوب إلى 50 مل مع تحلل RBC العازلة. ملاحظة: عند هذه النقطة والمضي قدما، والحفاظ على الخلايا على الجليد أو في 4 درجة مئوية.
  21. تدور في أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في   4 درجة مئوية ومن ثم صب قبالة أو يستنشق supernatant. ملاحظة: سوف يكون supernatant المحمر إلى حد ما تحتوي على RBCs lysed. يجب أن تكون الكريات بيضاء مصفرة في هذه المرحلة. إذا ظلت المركبات المفلورة المفلورة كبيرة في الكريات كما هو مبين في بيليه المحمر، يمكن تكرار الخطوة 5.20-5.21. تبقى الخلايا التكرارية الكبيرة في بيليه الخلية إذا لم يتم تقسيم بيليه المحمر من الخطوة 5.20 بما فيه الكفاية.
  22. Resuspend وتفتيت بيليه بيضاء مع حجم صغير من HBSS(-) ومن ثم ملء أنبوب إلى 50 مل مع HBSS (-). ملاحظة: يجب استخدام HBSS(-) وليس HBSS+ لإعادة إنفاق بيليه الخلية البياضية. HBSS (-) يفتقر إلى الكالسيوم والمغنيسيوم.
  23. تدور مرة أخرى في الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 4   درجة مئوية.
  24. صب قبالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه إلى حجم نهائي من 1 مل HBSS (-).
  25. إضافة 5 ميكرولتر من تعليق الخلية 1 مل إلى 250 ميكرولتر HBSS(-) في أنبوب Eppendorf 1.5 مل وتخلط بلطف صعودا وهبوطا عن طريق ماصة.
  26. إضافة 25 ميكرولتر تعليق الخلية المخفف إلى 25 ميكرولتر 0.4٪ تريبان الأزرق.
  27. أضف 12 ميكرولتر من الخليط إلى كل جانب من مقياس الدم القياسي.
  28. عد عدد الخلايا الحية التي استبعدت صبغة تريبان الزرقاء ومتواجدة في المربع الأوسط من كلا الجانبين من مقياس الدم.
  29. لحساب تركيز الخلية، اضرب متوسط المربعين بمقدار 100 (عامل تخفيفي) ثم اضرب ب 104 لإعطاء عدد الخلايا/مل.
  30. ضبط التركيز النهائي إلى 5 × 107 خلايا / مل. إذا كان أكبر من 5 × 107 خلايا / مل، ضبط عن طريق إضافة HBSS (-). إذا كان أقل، بيليه الخلايا وإعادة الإنفاق على حجم مناسب.
  31. إبقاء الخلايا على الجليد حتى جاهزة للقيص الهجرة. ملاحظة: تمثل هذه الخلايا السكان المحببة من خلايا الدم البيضاء. غالبية الحبيبات المعزولة عن الدم البشري كله هي العدلات. يتم الاحتفاظ بالخلايا على الجليد المعلقة في HBSS(-) حتى إضافة إلى المقايسة الهجرة من أجل الحفاظ على الخلايا في حالة هادئة.

6. إعداد طبقات الخلايا الظهارية لمقاايسة الهجرة

(هذهالخطوات لا تحتاج إلى أن يتم تنفيذها داخل غطاء محرك السيارة العقيم.)

  1. إزالة من الحاضنة 24 جيدا لوحة دعم الطبقات الظهارية التي تم استزراعها على الجانب السفلي من أغشية مرشح transwell لمدة ثمانية أيام على الأقل.
  2. فهم حافة كل transwell مع hemostat، ورفع من لوحة 24 جيدا وعكس transwell على دلو النفايات لتجاهل وسائل الإعلام الثقافية من الغرفة الداخلية للtranswell. تراجع كل transwell في كوب غسيل يحتوي على HBSS + لملء الغرفة الداخلية من transwell مع HBSS +. تجاهل السوائل من الغرفة الداخلية في دلو النفايات.
  3. كرر الخطوة 6.2 لغسل ثانية في HBSS +. بعد غسل اثنين، ضع transwells في لوحة جديدة من 24 بئرا تحتوي على 1 مل HBSS + في كل بئر. ملاحظة: يجب إجراء جميع الغسيلات باستخدام HBSS+ التي يتم تسخينها إلى 37 درجة مئوية.
  4. مراقبة الغرفة العليا من كل transwell لتقييم سلامة طبقة الخلية الظهارية. ملاحظة: HBSS + لا ينبغي أن تسرب إلى وملء الغرفة العليا من transwell عند وضعها في بئر لوحة 24 جيدا تحتوي على 1 مل من HBSS +.
  5. بعد مراقبة بعناية كل transwell، إضافة 0.2 مل من HBSS + في الغرفة العليا.
  6. ضعه في الحاضنة عند درجة   الحرارة 37 درجة مئوية، و5٪ من ثاني أكسيد الكربون في غرفة رطبة لمدة 30-60 دقيقة لتوازن طبقات الخلايا الظهارية.

7. م المقايسة الهجرة عبر الظهارية العدلات

  1. إزالة من الحاضنة 24-جيدا لوحة من transwells غسلها equilibrating في HBSS +.
  2. فهم كل transwell مع hemostat وتجاهل السوائل في أعلى جيدا في دلو النفايات.
  3. ضع كل ترانسويل رأسا على عقب في طبق بيتري مقاس 150 مم × 25 ملم.
  4. إلى ستة من Transwells مقلوب، إضافة 25 ميكروغرام من HBSS +. إلى ثلاثة من transwells مقلوب، تصيب مع 25 ميكرولتر P. aeruginosa (PAO1) المخفف في HBSS + أعدت على النحو المبين في الخطوة 4. إلى النهائي ثلاثة transwells مقلوب، مع إصابة 25 ميكرولتر E. القولونية K12 (MC1000) المخفف في HBSS + أعدت على النحو المبين في الخطوة 4. هذا هو ما يقرب من 0.8 × 106-1.5 × 106 CFUs / طبقة الظهارية لكل نوع من الأنواع البكتيرية منذ تركيز المحاليل البكتيرية المعدة في الخطوة 4 هو ما يقرب من 3 × 107-6 × 107 CFU / مل.
  5. حضانة في 37   درجة مئوية، 5٪ CO2 في غرفة رطبة لمدة 60 دقيقة.
  6. إعداد fMLP كتحكم إيجابي للهجرة العدلات بإضافة 5 ميكرولتر من المخزون fMLP 10 mM إلى 5 مل HBSS + إعطاء حل 10 ميكرومتر.
  7. غسل transwells عن طريق استيعاب مع hemostat والتقليب مرة أخرى إلى لوحة غسل 24 جيدا التي تحتوي على 1 مل HBSS + في الغرف السفلية. أضف 0.2 مل من HBSS+ إلى الغرف العلوية.
  8. فهم transwell مع hemostat وإزالة من لوحة الغسيل الأولى. قبل وضع transwells في لوحة غسل ثانية 24 جيدا تحتوي على 1 مل HBSS +، تجاهل السوائل من الغرفة العليا في دلو النفايات. إضافة 0.2 مل من HBSS + إلى الغرفة العلوية.
  9. كرر الخطوات 7.8 مرة أخرى لما مجموعه 3 يغسل. ملاحظة: يجب أن تخضع جميع المتحولين جنسيا لنفس نظام المناولة والغسيل ، سواء كانوا مصابين بالبكتيريا أم لا ، لضمان أن جميع المتحولين جنسيا الذين يتم فحصهم قد تم التلاعب بهم بنفس الطريقة. عدوى 60 دقيقة مع إما PAO1 أو MC1000 لا يقلل من الجدوى أو تغيير خصائص الحاجز من أحادي الطبقة H292 كما تم تقييمها من قبل اختبار السموم القائم على اللاكتات ديهيدروجيناز ومقصات تدفق HRP، على التوالي18،22.
  10. إعداد لوحة الهجرة 24 جيدا عن طريق إضافة 1 مل HBSS + في 12 بئرا من لوحة 24 جيدا. ملاحظة: يمكن إعداد هذه اللوحة مسبقا.
  11. بعد الغسيل الثالث ، تجاهل السوائل من الغرف العليا من transwells في دلو النفايات باستخدام hemostat ووضع ثلاثة من transwells غير المصابة في ثلاثة آبار من لوحة الهجرة 24 بئرا تحتوي على 1 مل HBSS + ، والذي يمثل السيطرة السلبية.
  12. ماصة 10 ميكرولتر من محلول 10 ميكرومتر من fMLP في كل بئر من الآبار الثلاثة من لوحة الهجرة 24 بئرا تحتوي على 1 مل HBSS + (100 nM).
  13. ضع ثلاثة من الآبار المتحولة غير المصابة في ثلاثة آبار من لوحة الهجرة ذات 24 بئرا التي تحتوي على 100 nM fMLP ، مما يمثل تحكما إيجابيا في قدرة العدلات المعزولة على الهجرة.
  14. ضع ثلاثة الآبار المتحولة المصابة PAO1 وثلاثة transwells المصابة MC1000 في ثلاثة آبار لكل منها على التوالي من لوحة الهجرة 24 بئرا تحتوي على 1 مل HBSS +. إضافة 0.1 مل من HBSS + إلى الغرفة العليا من كل transwell.
  15. على رأس 0.1 مل HBSS + في كل transwell، إضافة بعناية 20 ميكرولتر من تعليق العدلات (5 × 107 خلايا / مل) أعدت على النحو المبين في الخطوة 5. ملاحظة: هذا يمثل ما يقرب من 1 × 106 العدلات / transwell.
  16. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 في غرفة رطبة لمدة 2 ساعة للسماح الهجرة عبر الظهارية من العدلات.
  17. إعداد منحنى قياسي لتحديد عدد العدلات التي هاجرت بعد 2 ساعة. إضافة 40 ميكرولتر من تعليق العدلات (5 × 107 خلايا / مل) إلى 2 مل من HBSS(+) ونقل 1 مل إلى 1 مل HBSS(+) وإجراء المخففات التسلسلية 2 أضعاف ثماني مرات إضافية لما مجموعه 10 معايير تتراوح بين حوالي 2000 خلية / مل إلى 1 × 106 خلايا / مل. تضمين 1 مل HBSS(+) للفراغ.
  18. بعد 2 ساعة من الهجرة، ارفع الآبار العابرة عن طريق الإمساك بالهموستات واضغط بلطف على الجدران الداخلية للوحة الهجرة ذات ال 24 بئرا. تجاهل المتحولين جنسيا.
  19. تقييم هجرة العدلات بشكل كبير في الآبار من خلال عرض آبار لوحة الهجرة 24 بئرا تحت مجهر مقلوب باستخدام الهدف 10X (انظر الشكل 1 لصور العدلات المهاجرة في كل حالة).
  20. أضف 50 ميكرولتر من 10٪ تريتون X-100 إلى كل بئر مستخدم في لوحة الهجرة ذات 24 بئرا، وكل معيار، والفارغ.
  21. تدوير لوحة الهجرة 24 جيدا، والمعايير، وفارغة بسرعة منخفضة لمدة 20 دقيقة في 4   درجة مئوية.
  22. إعداد المخزن المؤقت سيترات 1 M مقدما. أضف 52.5 غ من حمض الستريك و73.5 غرام من سيترات الصوديوم إلى 400 مل من الماء المقطر في كوب. جلب pH إلى 4.2. إضافة الماء المقطر للحل النهائي من 500 مل. تخزين الحل في 4 درجة مئوية.
  23. إعداد ABTS حل الركيزة الطازجة في ذلك اليوم. إضافة 3 أقراص ABTS (10 ملغ لكل منهما) و 5 مل من 1 متر سيترات عازلة إلى 45 مل من الماء المقطر. السماح للأقراص تذوب تماما في الحل. حجب إضافة 50 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين 30٪ حتى هناك حاجة إلى حل الركيزة ABTS (انظر الخطوة 7.27).
  24. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للسيترات إلى كل بئر مستخدم في لوحة الترحيل ذات 24 بئرا، وكل معيار، والفراغ.
  25. نقل 100 ميكرولتر من كل عينة بشكل جيد في تكرار إلى لوحة 96 جيدا. ملاحظة: من المهم جدا خلط المحتويات بدقة في كل عينة قبل الانتقال إلى لوحة 96 بئرا. Pipette الحل صعودا وهبوطا على الأقل خمس مرات قبل نقل.
  26. نقل 100 ميكرولتر من كل معيار وفارغة إلى لوحة 96 جيدا بعد خلط (فارغة في مكررة).
  27. أضف 50 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 30٪ إلى محلول ودوامة ABTS.
  28. أضف 100 ميكرولتر من محلول ركيزة ABTS إلى كل عينة على لوحة 96 بئرا.
  29. السماح لوحة لتطوير لمدة 5-10 دقيقة في الظلام. ملاحظة: يجب أن يتطور اللون الأخضر في آبار معينة ، مع الارتباط بعدد العدلات الموجودة في كل بئر.
  30. قراءة في الطول الموجي من 405 نانومتر باستخدام قارئ microplate.
  31. حساب عدد العدلات التي هاجرت عبر الطبقة الظهارية باستخدام المعايير حيث يوجد ارتباط خطي إيجابي بين الأعداد المعروفة من العدلات المعدة كمقاييس وكمية نشاط البيروكسيداز كما تقاس بالكثافة البصرية عند 405 نانومتر (انظر الشكلين 2 و 3 للحصول على بيانات تمثيلية). ملاحظة: هذه الطريقة في القياس الكمي العدلي تستفيد من كمية كبيرة من نشاط البيروكسيداز التي تظهرها العدلات بسبب تعبير myeloperoxidase. ويمكن النظر في اتباع نهج بديلة لقياس العدلات كميا، مثل الطرق التي تنطوي على تسمية العدلات قبل الحمل ذات النشاط الإشعاعي أو مركبات الفلورسينس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد أظهرت العديد من الدراسات أن الطبقات الظهارية المصابة بمسببات الأمراض تسهل الهجرة عبر الظهارية العدلية3,8,19,24-28,31,32. يحدث هذا عن طريق تحريض ممرض محدد لتدرج كيموتاتاتيك مشتق من الخلايا الظهارية3,23. على سبيل المثال، المسببة للأمراض P. aeruginosa التفاعل مع السطح apical من خلايا الظهارية الرئة يسبب عددا كبيرا من العدلات للهجرة عبر الطبقة الظهارية18،22،25،26،33،34. يمكن التلاعب بنظام الفحص هذا ذي الصلة سريريا بطرق عديدة للكشف عن مسببات الأمراض الرئيسية واستضافة المساهمين الجزيئيين عند إقرانه بضوابط مناسبة.

العدلات المضافة إلى طبقات الخلايا الظهارية المستقطبة التي لم يتم الإصابة بها تفشل في الهجرة عبر بأعداد كبيرة. ومع ذلك ، فإن تطبيق تدرج مثبط للعلاج الكيميائي عبر طبقة ظهارية غير مصابة سيدفع أعدادا كبيرة من العدلات عبرها. من المهم إدراج كل من هذه الضوابط السلبية والإيجابية على التوالي داخل كل مقايسة عند التحقيق في هجرة العدلات عبر الطبقات الظهارية المصابة بمسببات الأمراض. يحدد التحكم السلبي عدد الخلفية من العدلات التي تعبر الطبقة الظهارية في غياب الإشارة. يجب أن يكون هذا العدد منخفضا جدا عندما تكون الخلايا الظهارية المستزرعة قد أنشأت حاجزا وظيفيا. الهجرة الخلفية العالية تعقد تفسير النتائج التي تحققت مع الظهارة المصابة بمسببات الأمراض. تتضمن السيطرة الإيجابية تطبيق تدرج من الجاذب الكيميائي العدلي مثل fMLP عبر الطبقة الظهارية وتعمل على تأكيد أن العدلات المعزولة وظيفية. وعلاوة على ذلك، في حالة معالجة الطبقات الظهارية مسبقا بكواشف معينة لتقييم آثارها على الهجرة عبر الظهارية الناجمة عن مسببات الأمراض، يعمل تدرج fMLP على التحكم في أي آثار قد يكون للكواشف على قدرة العدلات على التنقل في الطبقة الظهارية بغض النظر عن الآثار الوسيطة المسببة للأمراض. تتضمن الرقابة الإضافية المستخدمة في كثير من الأحيان داخل نظام الفحص هذا عدوى الطبقات الظهارية بالبكتيريا غير المسببة للأمراض بالتوازي مع مسببات الأمراض. ويمكن استغلال هذه السيطرة للتمييز بين الاستجابات الظهارية ذات الصلة بعد التفاعل مع البكتيريا وكذلك المساعدة في تحديد العوامل المسببة للأمراض اللازمة لتحفيز الهجرة عبر الظهارية العدلية.

ويمكن تقييم الهجرة عبر الظهارية العدلية نوعيا وكميا. عند الانتهاء من حضانة 2 ساعة بعد إضافة العدلات إلى سطح البازلت، تتم إزالة transwells ويمكن النظر إلى العدلات التي هاجرت بشكل كامل عبر الطبقة الظهارية إلى غرفة apical في البئر السفلي من لوحة الهجرة 24 جيدا. يتم عرض صورة تمثيلية لكل حالة في الشكل 1، تصور باستخدام المجهر الخفيف المقلوب. لوحظ عدد قليل جدا من العدلات للهجرة عبر طبقة الظهارية غير المصابة دون التدرج الكيميائي المفروض (HBSS +) وتمثل مستويات الخلفية في المقايسة(الشكل 1A). وعلى النقيض من ذلك، كانت وفرة من العدلات المتحولة واضحة عند توفير تدرج fMLP(الشكل 1B). أدت عدوى الظهارة مع غير باعث E. coli MC1000 في عدد قليل من العدلات المتحولة مرئية، في حين أن العديد من العدلات المتحولة جنسيا كانت ملحوظة عندما أصيبت الطبقات الظهارية مع الرئة المسببة للأمراض P. aeruginosa (PAO1) (الشكلين 1C و 1D).

يتم قياس العدلات التي هاجرت في التجربة من خلال قياس نشاطها myeloperoxidase. ويستخدم منحنى قياسي لتمكين تقدير عدد العدلات المتحولة جنسيا. يرتبط عدد العدلات بشكل إيجابي مع كمية نشاط البيروكسيداز التي تقاس بعد تحلل العدلات مع القيم التي تظهر علاقة خطية في نطاق أرقام العدلات المختارة للمنحنى القياسي (2 × 103-1 × 106 خلايا / مل) (الشكل 2). يهاجر عدد كبير من العدلات عبر الطبقات الظهارية استجابة لتدرج fMLP المقدم أو استجابة لطبقة ظهارية مصابة ب PAO1 (الشكل 3). عدد العدلات التي تهاجر في غياب المحفزات (HBSS +) أو بعد العدوى الظهارية apical مع غير باعث على الحيوانات E. القولونية MC1000 هو أقل من الحد الأقصى للكشف عن المقايسة (الشكل 3). تمثل البيانات المعروضة في الشكل 3 متوسط عدد العدلات المتحولة مع قضبان الخطأ التي تمثل الانحراف المعياري لثلاث آبار / حالة مستقلة. البيانات الكمية المبينة في الشكل 3 تتفق مع صور الآبار التمثيلية المعروضة في الشكل 1.

Figure 1
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 صورة العدلات بعد الهجرة عبر الظهارية. تم عرض الصور بمجهر خفيف مقلوب عند تكبير 10X للخ بئر القاع (غرفة apical) من لوحة الهجرة ذات 24 بئرا بعد فترة حضانة ساعتين مع إضافة العدلات إلى البئر العلوي (غرفة البازلتات). (أ) التحكم السلبي HBSS +. (ب) فرض رقابة إيجابية fMLP التدرج الكيميائي. (ج) طبقات الخلايا الظهارية المصابة غير باعتلال E. القولونية K12 (MC1000). (د) طبقات الخلايا الظهارية المصابة المسببة للأمراض P. aeruginosa (PAO1). انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Figure 2
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم تعرضت العدلات بتركيز يبدأ من 1 × 106 لتسعة تمييعات 2 أضعاف. بعد التحلل، تم تحديد كمية نشاط البيروكسيداز ورسم عدد العدلات على المحور x مع نشاط البيروكسيداز على المحور ص. يمكن استخدام المعادلة المصورة لتحديد عدد العدلات الموجودة في كل بئر بعد الهجرة على أساس كمية نشاط البيروكسيداز التي تقاس في كل بئر. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Figure 3
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن القياس الكمي للنيوتروفيليا المتحولة. يتم قياس عدد العدلات المتحولة كميا من خلال نشاط الميالوبيروكسيداز النسبي إلى منحنى قياسي خطي للأعداد المعروفة من العدلات. لوحظت أعداد كبيرة من العدلات المتحولة جنسيا بعد عدوى الخلايا الظهارية مع P. aeruginosa المسببة للأمراض (PAO1) أو إنشاء تدرج apical إلى basolateral من fMLP الجذاب الكيميائي العدلي. لوحظت أعداد لا يمكن اكتشافها من العدلات المتحولة بعد عدوى الخلايا الظهارية مع العلاج غير المرضي E. coli K12 (MC1000) أو حاجز التحكم السلبي فقط (HBSS+). انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هجرة العدلات عبر الأسطح الظهارية المخاطية هي سمة شائعة في أمراض الأمراض بعد العدوى بمسببات الأمراض البكتيرية3. تقدم المنهجية الموصوفة هنا نهجا سريعا ومباشرا لعزل هذا الحدث المنفصل تجريبيا باستخدام خلية بشرية مشتقة من نظام الفحص المشترك في المختبر الذي يقدم نماذج لميزة العملية الالتهابية الناجمة عن العدوى البكتيرية. وقد وضعت هذا النظام أصلا باستخدام الخلايا الظهارية المعوية المستقطبة المصابة بمسببات الأمراض المعوية بما في ذلك السالمونيلا تيفيموريوم, شيغيلا flexneri, ومختلف المسببة للأمراض كولاي8,19,24,27,28. كل من هذه الكائنات المسببة للأمراض قادرة على قيادة العدلات عبر الطبقات الأحادية الظهارية المعوية المستقطبة التي تزرع على مرشحات ترانسويل المغلفة بالكولاجين المقلوب. وقد تم تكييف هذا النظام التجريبي مع تعديلات لاستكشاف الحواجز الظهارية الرئة ومسببات الأمراض الناجمة عن العدلات الهجرة عبر الظهارية18,26. وقد استخدمت عدة خطوط الخلايا الظهارية مجرى الهواء وبصرف النظر عن H292 لهذه الدراسات بما في ذلك استشهد عادة A549, BEAS-2B, وكالو-3 خطوط الخلايا الظهارية الرئة22,26. P. aeruginosa يحرض التهاب في الرئة مما تسبب في أضرار كبيرة تميز أمراض مثل الالتهاب الرئوي الحاد والتليف الكيسي35,36. كما هو موضح ، فإن مسببات الأمراض الرئوية P. aeruginosa تحفز بسهولة الهجرة عبر الظهارية العدلية عند عدوى الخلايا الظهارية الرئوية ، وهي سمة بارزة من سمات العملية الالتهابية التي لوحظت في الالتهاب الرئوي والتليف الكيسي. وعلاوة على ذلك، تم التحقق من صحة عدة سلالات إضافية من P. aeruginosa بما في ذلك العزل السريري من مرضى التليف الكيسي كحافزين في هذا الفحص25. المكورات العقدية الالتهاب الرئوي والالتهاب الرئوي Klebsiella, مسببات الأمراض البكتيرية إيجابية الغرام وغرام سلبية, على التوالي, ترتبط عادة مع الالتهاب الرئوي، وقد ثبت أن تكون قادرة على إحداث هجرة العدلات عبر الظهارية باستخدام نموذج الزراعة المشتركة في المختبر 26,32. وهكذا، يقدم هذا النظام النموذجي نهجا قويا في المختبر باستخدام الخلايا المشتقة من الإنسان لاستكشاف العمليات الالتهابية بتحريض من مسببات الأمراض المخاطية.

نماذج قياسية تستند إلى زراعة الأنسجة تستخدم في كثير من الأحيان لاستكشاف التفاعلات الممرض المضيف تستخدم عموما الخلايا الظهارية نمت على الأسطح البلاستيكية المسطحة16. في المختبر اختبار الزراعة المشتركة يقدم درجة أكبر من التعقيد توفير براعة في التصميم التجريبي16,37,38. الخلايا الظهارية المستقطبة التي تزرع على الجانب السفلي من مرشحات ترانسويل نفاذية يخلق مقصورة apical التي تواجه الغرفة السفلية عندما وضعت في لوحة 24 جيدا ومقصورة basolateral التي تواجه البئر العلوي داخل transwell14,17. هذا التقسيم المنفصل والتوجه الاتجاهي يسمح لتحليل القاعدي الفسيولوجي إلى الهجرة apical من العدلات استجابة للخلايا المفروضة أو الظهارية ولدت التدرجات الكيميائية14,17,23. يتيح نظام الزراعة المشتركة في المختبر التحقيق في آليات جزيئية محددة تعزى إلى الهجرة عبر الظهارية ، والتي يمكن أن يكون من الصعب حلها في الوسط المعقد لنموذج في الجسم الحي للعدوى الرئوية1،15. ويمكن التحقق من صحة أي استنتاج بشأن تحديد العوامل الرئيسية المشاركة في الهجرة عبر الظهارية العدلات باستخدام نموذج الزراعة المشتركة في المختبر في وقت لاحق لأهميتها باستخدام نماذج في الجسم الحي من الالتهاب الرئوي الحاد15،22.

يمكن التلاعب في اختبار الزراعة المشتركة في المختبر بطرق عديدة لدراسة مجموعة من الظواهر. ويمكن إجراء الدراسات التي تركز على الجينات البكتيرية المساهمة في تجنيد العدلات عن طريق تقييم المكتبات المتحولة المتاحة لمسببات الأمراض المحددة ذات الأهمية25,39,40. وقد تمثل الجينات التي يكشف عنها هذا التحليل عوامل فحولة جديدة وأهدافا علاجية محتملة للعوامل المضادة للعدوى. يمكن أن يمثل العدلات أيضا محور التحليل. على سبيل المثال، تستخدم العدلات العديد من جزيئات التصاق سطح الخلية لتسهيل الهجرة عبر الظهارية5،14،34،41،42. يمكن أن تختلف التفاعلات الرئيسية من خلية إلى خلية اعتمادا على هجرة القيادة الجذابة للعلاج الكيميائي والأنسجة التي تتفاعل بها العدلات34. يمكن معالجة العدلات مسبقا بمثبطات أو أجسام مضادة أو مضادات قبل تقييم الهجرة عبر الظهارية الناجمة عن مسببات الأمراض من أجل تحديد جزيئات السطح أو مسارات الإشارات التي تعتبر حاسمة لهذه العملية22,34. الخلايا الظهارية تؤدي دورا حاسما أثناء العدوى والالتهاب عن طريق استشعار الإشارات والتواصل مع الخلايا المناعية من خلال الوسطاء القابلة للذوبان43. يمكن التحقيق في مسارات الإشارات، والإفراز المستقطب للمجذبات الكيميائية، وجزيئات الالتصاق السطحي الظهاري التي تتفاعل مع البكتيريا أو العدلات التي تؤثر على مسببات الأمراض الناجمة عن الهجرة عبر الظهارية باستخدام اختبار الزراعة المشتركة في المختبر. تطبيق هذا النموذج زراعة مشتركة كشفت عنأهميةeicosanoid الدهون التي لم تكن مقدرة من قبل الكيميائية الجذابة المعروفة باسم hepoxilin A3,18,21. يتم إنتاج Hepoxilin A3 من قبل كل من الرئة والخلايا الظهارية المعوية استجابة للعدوى بمسببات أمراض محددة وهي مسؤولة عن قيادة العدلات عبر الطبقة الأحادية الظهارية المستقطبة من القاعدي إلى الجانب apical المصاب3. وبالتالي فإن الفحص في المختبر المشترك هو بمثابة أداة استكشافية قوية مع إمكانية تحديد الآليات الحرجة التي تتوسط التفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض وتدبير الالتهاب. علاوة على ذلك ، فإن هذا النظام النموذجي لديه القدرة على التكيف مع نهج فحص عالي الإنتاجية لتقييم فعالية العلاجات الانتقائية المضادة للعدوى أو المضادة للالتهابات.

في الخلاصة ، نقدم بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة للتحقيق في هجرة العدلات عبر طبقة أحادية من طبقات خلايا الرئة الظهارية المصابة بمسببات الأمراض التي تزرع على مرشحات ترانسويل نفاذية. يمكن تعديل التقنيات الموصوفة هنا لدراسة هجرة العدلات عبر الأسطح المخاطية الأخرى حيث تتسلل العدلات في حالات المرض مثل الجهاز الهضمي أو الجهاز البولي التناسلي. بالإضافة إلى ذلك ، من المرجح أن تكون الرؤى المكتسبة باستخدام نظام الفحص المشترك في المختبر ذات صلة بمجموعة واسعة من الأمراض الالتهابية التي لا تحركها عوامل معدية محددة. وتشمل الأمراض الالتهابية للأسطح المخاطية التي تتميز العدلات عبور الحاجز الظهاري واقية إلى درجة المرضية مرض الانسداد الرئوي المزمن، ARDS، الربو، وIBD5،10-12. ومن المرجح أن يؤدي الفهم الأعمق للآليات الجزيئية التي تحكم الهجرة عبر الظهارية العدلية إلى إثراء الاستراتيجيات العلاجية الموجهة نحو تخفيف العمليات الالتهابية المدمرة المرتبطة بهذه الأمراض الشائعة، مما يوفر سبلا جديدة لتحسين صحة الإنسان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المعاهد القومية للصحة (1 R01 AI095338-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NCl-H292 cells ATCC CRL-1848
RPMI-1640 medium ATCC 30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1 ATCC #47085
Escherichia coli MC1000 ATCC #39531
D-PBS (1x) liquid Invitrogen 14190-144 without calcium and magnesium
Heat Inactivated Fetal bovine serum Invitrogen 10082-147 10% added to culture medium
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml.
Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300-062 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC.  Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term.  
Hank's Balanced Salt Solution - HBSS(-) Invitrogen 14175-079 Sterile, without calcium and magnesium
Trypan Blue Solution Invitrogen 15250-061. Stock = 0.4%
Collagen, Rat Tail Invitrogen A10483-01 Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols
Citric acid Sigma-Aldrich C1909-500G Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution
Sodium Citrate Sigma-Aldrich S4641-500G Component of 1 M citrate buffer
Dextrose anhydrous Sigma-Aldrich D8066-250G Component of acid citrate dextrose (ACD) solution
Ammonium Chloride Sigma-Aldrich 213330-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich ED-100G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
HBSS(+) powder Sigma-Aldrich H1387-10L Key component of HBSS+
HEPES Sigma-Aldrich H3375-500G Component of HBSS+
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2-25ML Follow vendor instructions to coat glass pipette tips
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) Sigma-Aldrich A9941-50TAB Key component of ABTS substrate solution
30% Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich H1009-100ML Component of ABTS substrate solution
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) Sigma-Aldrich F-3506 A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC.
Gelatin Type B Fisher Scientific M-12026
Pseudomonas isolation agar  Fisher Scientific DF0927-17-1 Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates
Ficoll-Paque PLUS  Fisher Scientific 45-001-749 Optional, can improve neutrophil purity
24-well migration plate Corning Incorporated #3524
24-well wash plate Falcon 35-1147 Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse
96-well plate Fisher Scientific #12565501
Transwell Permeable Supports  Corning Incorporated #3415 Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm
Petri dish Falcon 35-1013 Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.  
500 ml 0.2 μm filter / flask Fisher Scientific 09-740-25A To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution
5-3/4 in glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20A Coat tips with Sigmacote prior to use
Hemostat Fisher Scientific 13-812-14 Curved, Serrated
Invertoskop Inverted Microscope Zeiss #342222
Versa-Max Microplate Reader Molecular Devices #432789

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
  2. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
  3. McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
  4. Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
  6. Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil's role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
  7. Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
  8. Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
  9. Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
  10. Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
  11. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
  12. Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
  13. Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
  14. Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
  15. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
  16. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
  17. Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
  18. Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
  19. McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
  20. McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
  21. Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
  22. Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
  23. McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
  24. Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
  25. Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
  26. Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
  27. McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
  28. Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
  29. Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
  30. Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
  31. Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
  32. Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
  33. Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
  34. Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
  35. Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
  36. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
  37. Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
  38. Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
  39. Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
  40. Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
  41. Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
  42. Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
  43. Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).

Tags

العدوى، العدد 83، البيولوجيا الخلوية، الظهارة، العدلات، Pseudomonas aeruginosa، أمراض الجهاز التنفسي، العدلات، الحواجز الظهارية، مسببات الأمراض، الهجرة
<em>في المختبر</em> المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai,… More

Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai, W., Hurley, B. P. In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration. J. Vis. Exp. (83), e50823, doi:10.3791/50823 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter