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Immunology and Infection

In vitro Ensaio de cocultura para avaliar migração trans epitelial de neutrófilo induzida por patógenos

Published: January 06, 2014
doi:
10.3791/50823
, , ,
1Department of Pediatrics,Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology,MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center,Massachusetts General Hospital

Summary

A migração trans-epitelial de neutrófilos em resposta à infecção bacteriana mucosa contribui para lesão epitelial e doença clínica. Foi desenvolvido um modelo in vitro que combina patógenos, neutrófilos humanos e camadas de células epiteliais humanas polarizadas cultivadas em filtros transwell para facilitar investigações para desvendar os mecanismos moleculares que orquestram esse fenômeno.

Abstract

As superfícies mucosas servem como barreiras protetoras contra organismos patogênicos. As respostas imunes inatas são ativadas ao detectar patógenos que levam à infiltração de tecidos com células inflamatórias migratórias, principalmente neutrófilos. Esse processo tem o potencial de ser destrutivo para os tecidos se excessivo ou mantido em um estado não resolvido.  Modelos in vitro coculturizados podem ser utilizados para estudar os mecanismos moleculares únicos envolvidos na migração trans-epitelial induzida pelo patógeno. Este tipo de modelo fornece versatilidade no design experimental com oportunidade de manipulação controlada do patógeno, barreira epitelial ou neutrófilo. A infecção patogênica da superfície apical de monocamadas epiteliais polarizadas cultivadas em filtros transwell permeáveis instiga a migração basolateral fisiologicamente relevante para a migração trans-epitelial apical de neutrófilos aplicados à superfície basolateral. O modelo in vitro descrito aqui demonstra os múltiplos passos necessários para demonstrar a migração de neutrófilos através de uma monocamada epitelial pulmonar polarizada que foi infectada com P. aeruginosa patogênica (PAO1). A semeadura e a colheita de transwells permeáveis com células epiteliais pulmonares derivadas humanas é descrita, juntamente com o isolamento de neutrófilos de sangue humano inteiro e cultivo de PAO1 e não-patogênico K12 E. coli (MC1000).  O processo de emigração e a análise quantitativa de neutrófilos migrados com sucesso que foram mobilizados em resposta à infecção patogênica são mostrados com dados representativos, incluindo controles positivos e negativos. Este sistema de modelo in vitro pode ser manipulado e aplicado a outras superfícies mucosas. Respostas inflamatórias que envolvem infiltração excessiva de neutrófilos podem ser destrutivas para os tecidos hospedeiros e podem ocorrer na ausência de infecções patogênicas. Uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares que promovem a migração trans-epitelial de neutrófilos através da manipulação experimental do sistema de ensaio de cocultura in vitro descrito aqui tem um potencial significativo para identificar novos alvos terapêuticos para uma gama de doenças infecciosas mucosas, bem como inflamatórias.

Introduction

As superfícies mucosas servem como barreiras físicas e imunológicas que proporcionam proteção contra ameaças externas generalizadas no meio ambiente1,2. Esta barreira epitelial protetora pode ser comprometida quando organismos patogênicos invadem2. No caso de um patógeno bacteriano, esse encontro muitas vezes instiga um processo inflamatório ativando o sistema imunológico inato e desencadeando uma rápida mobilização de granulócitos de primeiros socorros conhecidos como neutrófilos2-4. Agentes chemotactic facilitando o recrutamento de neutrófilos são produzidos em parte pelas células epiteliais mucosas que buscam livrar o hospedeiro do patógenoofensivo 2-4. Infiltração de neutrófilo excessivo ou não resolvida da superfície epitelial mucosa pode causar patologia significativa1,5. Isso é consequência de danos teciduais não específicos causados pelo arsenal antibacteriano de neutrófilo5-7. Nesses casos, a capacidade de liberação bacteriana de neutrófilos é ofuscada pela destruição do tecido hospedeiro durante um insulto infeccioso.  A interrupção da função de barreira epitelial protetora pode levar a uma maior exposição do tecido subjacente a microrganismos e/ou toxinas, exacerbando ainda mais a patologia da doença8,9. Essas consequências podem ser observadas em múltiplos sistemas de órgãos, incluindo o pulmão e o trato digestivo1,5. Além disso, condições inflamatórias não infecciosas, como crises graves de asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) e doença inflamatória intestinal (DII) são marcadas pela ruptura patológica da barreira epitelial mucosa por uma resposta neutrófila excessiva4,5,10-12.

O complexo processo de recrutamento de neutrófilos após infecção mucosa envolve várias etapas compartimentadas1,5,13,14. Primeiro, os neutrófilos devem sair de circulação através de uma série de interações célula-celular que facilitam a migração trans-endotelial1,13. Os neutrófilos navegam em seguida no espaço intersticial existente contendo matriz extracelular1,14. Para alcançar o lúmen da mucosa infectada, os neutrófilos devem migrar através da barreira epitelial1,4,5. Este intrincado fenômeno multistep é frequentemente investigado em agregado usando modelos in vivo animais de infecção15. Tais modelos são úteis para estabelecer a necessidade de fatores específicos, como quimiocinas, moléculas de adesão ou caminhos de sinalização que participam do processo global, mas são em grande parte inadequados para a resolução de contribuições moleculares críticas para cada etapa compartimentalizada distinta16. Sistemas in vitro coculturados modelando migração trans-endotelial, trans matricial ou trans-epitelial de neutrófilos têm sido particularmente úteis a este respeito1,14,16,17.

Um robusto sistema de ensaio de cocultura foi desenvolvido com o objetivo de decifrar mecanismos responsáveis pela migração trans-epitelial de neutrófilos em resposta à infecção patogênica18-22. Este modelo envolve infectar a superfície apical de camadas de células epiteliais humanas polarizadas com um patógeno bacteriano seguido pela aplicação de neutrófilos humanos recém-isolados na superfície basolateral18-22. Os neutrófilos migram através da barreira epitelial em resposta a produtos quimiolíticos derivados da epitelial secretados após infecção patogênica18,21-23. Este sistema modelo tem sido empregado usando culturas epiteliais intestinais e pulmonares expostas a patógenos bacterianos específicos do tecido apropriado e revelou novos mecanismos moleculares provavelmente importantes para o processo de recrutamento de neutrófilos durante a infecção mucosa3,8,19,24-28. A força deste modelo de cocultura in vitro é que uma abordagem reducionista permite ao pesquisador manipular experimentalmente o patógeno, a barreira epitelial e/ou o neutrófilo em um sistema bem controlado, altamente reprodutível e bastante barato. Os insights obtidos a partir dessa abordagem podem ser efetivamente aproveitados para realizar análises focadas de eventos compartimentados durante o recrutamento de neutrófilos usando modelos de infecção in vivo 22,29,30.

Este artigo demonstra os múltiplos passos necessários para o estabelecimento bem-sucedido deste modelo reprodutível para explorar a migração trans-epitelial induzida pelo patógeno. As barreiras epiteliais pulmonares infectadas com o patógeno Pseudomonas aeruginosa são destaque neste artigo; no entanto, outras epitélios teciduais e patógenos podem ser substituídos por pequenas modificações. A semeadura e a colheita de camadas de células epiteliais pulmonares polarizadas em filtros transwell permeáveis revestidos de colágeno invertidos são detalhados aqui, assim como o crescimento da P. aeruginosa patogênica e o isolamento de neutrófilos de sangue inteiro. Como esses componentes são combinados para observar a migração trans-epitelial induzida pelo patógeno é apresentada juntamente com controles positivos e negativos apropriados para estabelecer um ensaio reprodutível. A versatilidade dessa abordagem para examinar vários aspectos da migração trans-epitelial induzida pelo patógeno é discutida com referência a estudos específicos na literatura.

Protocol

As etapas (1-3) devem ser realizadas em um ambiente estéril sob um capô de fluxo laminar. 1. Transwells de revestimento de colágeno Faça uma solução de colágeno de 30 μg/ml. Diluir 3 mg/ml de colágeno 1:100 em 60% de etanol que foi passado por uma unidade de filtro de 0,2 μm. Vortex diluído solução de 30 μg/ml. Nota: Não é necessário vórtice a solução de estoque de colágeno de 3 mg/ml, pois esta solução é bastante viscosa e bolhas de ar pod…

Representative Results

Vários estudos demonstraram que as camadas epiteliais infectadas por patógenos facilitam a migração trans-epitelial de neutrófilos3,8,19,24-28,31,32. Isso ocorre por meio de uma indução específica de patógeno de um gradiente químico quimiofilo quimiofilo derivado de células epiteliais3,23. Por exemplo, p. aeruginosa patogênica interagindo com a superfície apical das células epiteliais pulmonares faz com que um número substancial de neutrófilos migrem através da camada epite…

Discussion

A migração de neutrófilos através das superfícies epiteliais mucosas é uma característica comum na patologia da doença após a infecção com patógenos bacterianos3. A metodologia descrita aqui oferece uma abordagem rápida e direta para isolar experimentalmente este evento discreto usando um sistema de ensaio de cocultura in vitro derivado de células humanas que modela uma característica do processo inflamatório desencadeado por infecções bacterianas. Este sistema foi originalmente dese…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo NIH (1 R01 AI095338-01A1).

Materials

NCl-H292 cells ATCC CRL-1848
RPMI-1640 medium ATCC 30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1 ATCC #47085
Escherichia coli MC1000 ATCC #39531
D-PBS (1x) liquid Invitrogen 14190-144 without calcium and magnesium
Heat Inactivated Fetal bovine serum Invitrogen 10082-147 10% added to culture medium
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml.
Trypsin-EDTA (0.05%) Invitrogen 25300-062 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC.  Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term.  
Hank's Balanced Salt Solution – HBSS(-) Invitrogen 14175-079 Sterile, without calcium and magnesium
Trypan Blue Solution Invitrogen 15250-061. Stock = 0.4%
Collagen, Rat Tail Invitrogen A10483-01 Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols
Citric acid Sigma-Aldrich  C1909-500G Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution
Sodium Citrate Sigma-Aldrich  S4641-500G Component of 1 M citrate buffer
Dextrose anhydrous Sigma-Aldrich  D8066-250G Component of acid citrate dextrose (ACD) solution
Ammonium Chloride Sigma-Aldrich  213330-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich  S6014-500G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
EDTA Sigma-Aldrich  ED-100G Component of red blood cell (RBC) lysis buffer
HBSS(+) powder Sigma-Aldrich  H1387-10L Key component of HBSS+
HEPES Sigma-Aldrich  H3375-500G Component of HBSS+
Sigmacote Sigma-Aldrich  SL2-25ML Follow vendor instructions to coat glass pipette tips
Triton X-100 Sigma-Aldrich  T-9284
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) Sigma-Aldrich  A9941-50TAB Key component of ABTS substrate solution
30% Hydrogen Peroxide Solution Sigma-Aldrich  H1009-100ML Component of ABTS substrate solution
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) Sigma-Aldrich  F-3506 A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC.
Gelatin Type B Fisher Scientific M-12026
Pseudomonas isolation agar  Fisher Scientific DF0927-17-1 Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates
Ficoll-Paque PLUS  Fisher Scientific 45-001-749 Optional, can improve neutrophil purity
Name of Material / Equipment Company Catalog Number Comments
24-well migration plate Corning Incorporated #3524
24-well wash plate Falcon 35-1147 Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse
96-well plate Fisher Scientific #12565501
Transwell Permeable Supports  Corning Incorporated #3415 Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm
Petri dish Falcon 35-1013 Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells.  
500 ml 0.2 μm filter / flask Fisher Scientific 09-740-25A To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution
5-3/4 in glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20A Coat tips with Sigmacote prior to use
Hemostat Fisher Scientific 13-812-14 Curved, Serrated
Invertoskop Inverted Microscope Zeiss #342222
Versa-Max Microplate Reader Molecular Devices #432789
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References

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In Vitro CocultureNeutrophil Trans-epithelial MigrationMucosal ImmunityPathogenic InfectionPolarized Epithelial MonolayerNeutrophil InfiltrationInflammatory ResponseTherapeutic Targets

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Kusek, M. E., Pazos, M. A., Pirzai, W., Hurley, B. P. In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration. J. Vis. Exp. (83), e50823, doi:10.3791/50823 (2014).
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