Summary
Vi har utviklet en mikrofluidisk plattform for rask antibiotika mottakelighet testing. Væske overføres ved høye hastigheter over bakterier immobilisert på bunnen av en mikrofluidisk kanal. I nærvær av stress og antibiotika dør mottakelige bakteriestammer raskt. Imidlertid kan resistente bakterier overleve disse stressende forholdene.
Abstract
Vi har utviklet en rask mikrofluidisk metode for antibiotika mottakelighetstesting i et stressbasert miljø. Væske overføres ved høye hastigheter over bakterier immobilisert på bunnen av en mikrofluidisk kanal. I nærvær av stress og antibiotika dør mottakelige bakteriestammer raskt. Imidlertid overlever resistente bakterier disse stressende forholdene. Hypotesen bak denne metoden er ny: stressaktivering av biokjemiske veier, som er mål for antibiotika, kan akselerere antibiotikafølsomhetstesting. Sammenlignet med standard antibiotika mottakelighet testmetoder, er det hastighetsbegrensende trinnet - bakterievekst - utelatt under antibiotikaapplikasjon. Den tekniske implementeringen av metoden er i en kombinasjon av standardteknikker og innovative tilnærminger. Standarddelene av metoden inkluderer bakteriekulturprotokoller, definering av mikrofluidiske kanaler i polydimetylsiloksan (PDMS), celle levedyktighetsovervåking med fluorescens og batchbildebehandling for bakterietelling. Innovative deler av metoden er i bruk av kulturmediestrøm for mekanisk stressapplikasjon, bruk av enzymer for å skade, men ikke drepe bakteriene, og bruk av mikroarray substrater for bakteriell vedlegg. Den utviklede plattformen kan brukes i antibiotika og ikke-antibiotisk relatert legemiddelutvikling og testing. Sammenlignet med standard bakterielle suspensjonseksperimenter, kan effekten av stoffet slås av og på gjentatte ganger over kontrollerte tidsperioder. Repeterende observasjon av samme bakteriepopulasjon er mulig i løpet av samme eksperiment.
Introduction
Økningen av bakteriell resistens intensiverer behovet for raske fenotypebaserte antibiotikafølsomhetstester for å beskytte våre legemidler fra siste utvei. Standard følsomhetstester er basert på bakteriell veksthemming i nærvær av antibiotika som tar flere (8-24) timer å fullføre. Vi har utviklet en ny antibiotisk følsomhetstest på en mikrofluidisk plattform som er avhengig av stressaktivering av biosyntetiske veier for å akselerere virkningen av antibiotika.
Antibiotiske følsomhetstester i mikrofluidisk skala har fordelen av effektiv prøvebruk, siden de krever et lite antall bakterier. I tillegg kan mikrofluidiske enheter multiplekses for å teste flere prøver under flere forhold1,2. Nylig har en rekke mikrofluidiske metoder for antibiotika mottakelighet testing blitt rapportert3-9. I disse metodene dyrkes bakterier inne i nano- og picoliterdråper3,7, i hele volumet av den mikrofluidiske kanalen4-6,8, eller som enkeltbakterier elektrisk lokalisert til bunnen av kanalen9. Selv om disse testene utføres i mikrofluidiske kanaler, overvåker de alle mikrobiell vekst i nærvær og fravær av antibiotika som ligner tradisjonelle metoder. Vekstmålinger tas via optisk tetthet, pH-sensitive fargestoffer eller lyse felt-/fasekontrast- eller fluorescensbilder. Selv om noen av disse testene er raskere enn tradisjonelle metoder, oppdager de hver passivt antibiotikaresistens. Med andre ord krever disse metodene fortsatt at brukeren venter på bakterievekst som den endelige avlesningen.
I motsetning har vi utviklet en metode som bruker en kombinasjon av skjær og enzymatisk stress for å aktivere antibiotikafølsomme biokjemiske veier10. Å utfordre de stressede bakteriene med disse antibiotika skaper en raskere følsomhetstest. Bakterier som er resistente mot antibiotika er i stand til å motstå de stressende forholdene. Mottakelige bakterier, derimot, blir raskt drept av de kombinerte påkjenningene. Prosentandelen av celledød etter en time, målt ved mikroskopi ved hjelp av en fluorescerende dødcelleflekk, definerer bakteriens fenotype (resistent vs. mottakelig).
For vellykket implementering av vår metode må bakterier immobiliseres på bunnen av den mikrofluidiske kanalen. På denne måten kan bakterier bli utsatt for ulike påkjenninger og samtidig avbildet under et mikroskop i et enkelt plan. En belagt mikroskop glass lysbilde brukes til bakterier immobilisering. Lysbildet er forhåndsbestrøket av produsenten med epoksidgrupper for ikke-spesifikk proteinbinding. Den ikke-spesifikke bindingen av disse epoksidene til bakterielle overflateproteiner fester bakteriene kovalent til glideoverflaten.
Stammer testes under identiske forhold (skjær + enzymatisk stress) i fravær (kontroll) og tilstedeværelse (eksperiment) av antibiotika. Fasekontrast- og fluorescensmikroskopbilder av hver kanal tas automatisk hvert annet minutt i en time. Resistensbetegnelser gjøres deretter ved å sammenligne prosentandelen av døde bakterier i den eksperimentelle kanalen med de som er tilstede i kontrollkanalen. Etter en time anses en prøve med en celledødsprosent større enn 1% som mottakelig, mens mindre enn 0,5% død indikerer motstand. Prosenter som faller mellom disse to avskjæringene anses som ubestemte, og prøven må testes på nytt.
Mikrofluidiske kanaler er definert i PDMS, som er et valgmateriale for mikrofluidiske enheter11. PDMS er optisk gjennomsiktig i et bredt spekter av bølgelengder, biokompatible, inert, gjennomtrengelige for gasser og har lav permeabilitet til væsker; Derfor er det godt egnet for disse eksperimentene.
Mekanisk/skjærspenning skapes av strømmen av romtemperaturmedier over de immobiliserte bakteriene. (Merk: Oppvarming av mediet til 37 °C har ingen signifikant effekt på analyseresultatet.) Automatiserte sprøytepumper tvinger medier (som inneholder dødcelleflekk +/- antibiotika, samt valgfrie enzymatiske stressorer) gjennom mikrofluidiske kanaler (200 μm x 400 μm) med en strømningshastighet på 1 ml/min for å gi 6,25 kPa skjærkraft eller en skjærhastighet på 6000 sek-1. Denne frekvensen er lik eller overstiger tidligere studerte skjærspenninger på Staphylococci.
Enzymet, lysostaphin, ble valgt for foreløpige eksperimenter fordi det forårsaker direkte skade på Staphylococcus cellevegg. Konsentrasjonen av lysostaphin (0,7 ng/ml) var tilstrekkelig til å forårsake bakteriell celleveggskade, men ikke tilstrekkelig til å forårsake bakteriell celledød uten antibiotika i forsøkets tidsramme. Lysostaphin er ikke nødvendig for riktig betegnelse av bakteriell følsomhet, men det øker utfallet, noe som fører til økt celledød i mottakelige stammer. Skjærstress er derimot avgjørende for analysefunksjonen. Når methicillin-sensitive Staphylococcus aureusstammer behandles med lysostaphin og oksacillin i fravær av strømning, registreres ingen celledød i løpet av eksperimentet.
Celle levedyktighet overvåkes med en fluorescerende død celleflekk 12. Valget av fargestoffet var basert på dets evne til selektivt å flekke bare skadede celler, dets ikke-toksisitet til levende celler, og dens lave bakgrunnsfluorescens, noe som tillot direkte tillegg til cellemediet uten ytterligere trinn. Valget av en fluorescerende fargekonsentrasjon på 0,25 μM var å oppnå akseptable signalnivåer i løpet av en 1,6 sek eksponeringstid for fluorescenseksitasjonslys.
Beta-laktam, oxacillin, ble brukt i våre foreløpige studier. Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) arter er resistente mot oxacillin og vil ikke vise noen merkbar celledød i tidsrammen for eksperimentet. Konsentrasjonen på 50 μg/ml ble bestemt i de foreløpige studiene. Lavere konsentrasjoner av antibiotika ga mindre separasjon mellom resistente og mottakelige stammer, mens høyere konsentrasjoner ikke forårsaket en merkbar forskjell i eksperimentelle utfall.
Vi har tidligere rapportert om vellykket utvikling av en test som kombinerer mekaniske og enzymatiske påkjenninger som direkte påvirker bakteriecelleveggen13 med et antibiotika som hemmer celleveggbiosyntese14,15. Disse prinsippbevis-eksperimentene ble utført på et panel av MRSA og methicillin-sensitive S. aureus (MSSA). Men med valg av riktige eksperimentelle parametere, bør vår metode gjelde for flere arter av bakterier og flere klasser av antibiotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lag PDMS-laget (figur 1)
- Bland PDMS og herdemiddel kraftig i et 10:1-forhold. For å fjerne bobler, avfett den viskøse blandingen i et vakuumkammer i 1 time ved romtemperatur.
- På en skala, hell PDMS sakte over aluminiumsformen. Hell fra midten og hold formen nivellert. Sørg for å la pinnene være avdekket. Slutt å helle når målvekten er oppnådd.
Vår form krever 4 g PDMS og 0,4 g herdende reagens. - Jevn formen inne i en ovn, og herd ved 37 °C over natten.
Alternative herdetider er 2 timer ved 60 °C eller 1 time ved 90 °C. - Disseker det herdede PDMS-laget langs kanten av formen og skrell det forsiktig av muggoverflaten med et par tang. Rengjør muggoverflaten med 70% etanol og en Q-tip.
2. Monter strømningscellen i henhold til figur 2
Standard montering av PDMS med glasssklier gjøres gjennom oksygenplasmabehandling av begge overflater, noe som sikrer lekkasjefri binding mellom PDMS og mikroskopglasssklie. I den presenterte protokollen ville plasmabehandlingen ødelegge det kjemiske belegget på glasssklie. Derfor er lysbildet trykkforseglet i stedet for plasmabehandlet.
- Plasser glassvinduet i strømningscellelommen.
- Legg en belagt glasssklie over glassvinduet inne i lommen på strømningscellen med den aktive siden opp, og plasser PDMS-laget med kanaler som vender ned på toppen av den. Plasser PDMS-lysbildet slik at kanalinngangene stemmer overens med gjennomhullene i metallplaten. Skyv luften forsiktig ut mellom lagene.
- Vend SKYVEENHETEN FOR PDMS/glass slik at PDMS vender mot glassvinduet. Overlapp PDMS-kanalinngangene med gjennomhullene i metallplaten.
- Plasser trykkplaten på toppen og stram skruene.
- Plasser den monterte strømningscellen under mikroskopet. Sett mikroskopforstørrelsen til 60X og forhåndsjuster kanalposisjonene.
3. Forbered loggfasebakterier
- Dagen før eksperimentet: Inokuler 50 ml Mueller Hinton buljong som inneholder 2% NaCl (MH2) med en bakteriell koloni. Rist ved 250 o/min over natten ved 37 °C.
En eller to bakteriestammer kan studeres i ett eksperiment for det beskrevne oppsettet. - Før eksperiment: Bland 50 μl av nattbakteriekulturen i 50 ml MH2-medier. Rist ved 250 o/min i 3 timer ved 37 °C for å sikre at bakteriene er i loggfasen.
4. Varm opp de eksperimentelle løsningskomponentene minst 10 minutter før de trengs
- Tine fluorescerende fargestoff (5 mM lager) og lysostaphin (10 μg/ml lager) ved romtemperatur.
- Varm oksacillinpulveret til romtemperatur.
5. Forbered og last bakteriell suspensjon
- Etter slutten av 3 timers subkultur: Ta 10 ml bakteriekultur og sentrifuge ved 1650 x g i 2 min.
- Fjern de supernatante og resuspendbakteriene i 1 ml friske MH2-medier.
- Fest en kort lengde på slangen til en 1 ml Luer-låsesprøyte. Skyll sprøyteslangen med 1 ml medier. La det være litt medier i slangen for å unngå luftbobler når du tegner i bakteriell suspensjon.
- Last 0,7 ml bakterier type 1 inn i sprøyten. Fyll to kanaler i strømningscellen med bakterier type 1. Se etter væsken som skal vises på den andre siden av kanalen etter ca. 150 μl.
Gjennomsiktigheten til kanalen endres når den er fylt med bakterier. - Hvis du eksperimenterer med flere bakterietyper, gjentar du lasteprosedyren for bakterier type 2 i de to gjenværende kanalene i strømningscellen.
- Plasser strømningscellen inne i inkubatoren ved 37 °C i 45 minutter for å tillate bakteriell sedimentering og festing til glideflaten.
6. Forbered og last inn eksperimentelle løsninger
- Forbered 140 μl 0,5 mM fluorescerende fargestoffløsning ved å blande 14 μl fluorescerende fargestoff (5 mM) og 126 μl MH2-medier.
- Fortynn 10 mg oksacillin i 40 ml MH2-medier for å oppnå en endelig konsentrasjon på 250 μg/ml oksacillin.
- Forbered 130 ml kontrollløsning med endelige konsentrasjoner på 0,25 μM fluorescerende fargestoff og 0,7 ng/ml lysostaphin. For å gjøre dette, bland 65 μl fluorescerende fargestoff (0,5 mM), 9,12 μl lysostaphin lager (10 μg/ml) og 130 ml MH2-medier.
- Forbered 130 ml antibiotikaoppløsning med endelige konsentrasjoner på 0,25 μM fluorescerende fargestoff, 0,7 ng/ml lysostaphin og 50 μg/ml oksacillin. For å gjøre dette, bland 65 μl fluorescerende fargestoff (0,5 mM), 9,12 μl lysostaphin lager (10 μg/ml), 26 ml oxacillin (250 μg/ml) og 104 ml MH2-medier.
- Fyll to 60 ml sprøyter med kontrollløsning og to 60 ml sprøyter med antibiotikaoppløsning. Hold løsninger pakket inn i aluminiumsfolie for å unngå lysindusert nedbrytning av reagensene.
Overfyll sprøytene for å ta høyde for tap på grunn av spyling av slangen. - Fjern luftbobler fra sprøytene ved å flikke. Fest og fyll inngangsslangen til spissen med den eksperimentelle løsningen.
- Monter sprøyter på pumpen. Plasser sprøyten med det minste volumet først, og lås deretter stempelposisjonen. Monter resten av sprøytene på pumpen, klem stempelet etter behov.
- Sett pumpehastigheten til 1 ml/min og pumpevolumet til 60 ml. Skyll med pumpen til en jevn strøm av væske er sett fra alle sprøyter.
7. Sett opp strømningscellen under mikroskopet
- Fjern strømningscellen fra sentrifugen og monter den på mikroskopstadiet (figur 3).
- Koble inngangs-/utgangsslangen til hver av strømningscellekanalene (én inngang/én utgang per kanal).
Innsamling av utgang i fire forskjellige beholdere gjør det mulig å måle individuelle kanalutgangsvolumer.
8. Kjør det 60 minutters eksperimentet
- Kontroller de forhåndsjusterte posisjonene fra trinn 2.5. Hvis mikroskopets synsfelt ikke er sentrert på kanalen og/eller er ute av fokus, justerer du innstillingene og lagrer de nye posisjonene.
Presis fokusering er kanskje ikke mulig før strømningsstart på grunn av den høye tettheten av lastede bakterier. - Sett oppkjøpstiden for fasekontrast til 10 ms og fluorescensanskaffelsestiden til 1600 msek.
- Få fasekontrast- og fluorescensbilder for hver posisjon før du starter flyten.
Dette gir et kvalitativt estimat av den lastede bakterielle tettheten. - Start væskestrømmen og kontroller umiddelbart at mikroskopet er fokusert på bunnen av kanalene.
- Ta fasekontrast- og fluorescensbilder av målområdene i løpet av det første minuttet av flyten.
- Hent bilder hvert 2. Fokuser på nytt etter behov.
9. Desinfiser strømningscellen
- Lag en 10% blekemiddeloppløsning i et beger (100 ml). Fyll 4 x 20 ml sprøyter med 10 ml av blandingen. Debubble sprøytene og fest dem til strømningscellen.
Det vil ta ~ 1-2 min for kanalene å være fri for bakterier. - Sett pumpehastigheten til 1 ml/min og pumpevolumet til 3 ml. Løp i 3 min.
- Fyll 4 x 60 ml sprøyter med 60 ml DI-vann. Debubble sprøytene og fest dem til strømningscellen.
- Sett pumpehastigheten til 1 ml/min og pumpevolumet til 30 ml. Løp i 30 min.
- Overvåk kanalrengjøringen under mikroskopet.
- Demonter strømningscellen. Kast den brukte epoksysklie. Bløtlegg strømningscellekomponentene i DI-vann i 20 min. Lufttørk.
10. Analyser bilder og generer data
- Tell antall bakterier i hvert bilde.
Open Access-programvaren CellProfiler brukes til å utføre batchbildebehandling16. En disposisjon på høyt nivå av CellProfiler -rutinen summeres i Tabell 1. Antall bakterier som finnes i fasekontrastbildet (Np) gir det totale bakterietallet. Antall bakterier som er synlige i fluorescensbildet (Nf) gir antall døde bakterier. - Beregn den normaliserte bakteriecelledødsprosenten som en funksjon av tid.
- Importer Nf og Np for individuelle bilder til dataanalyseprogramvaren.
- Beregn brøkdelen av døde bakterier i hver kanal på et bestemt tidspunkt gitt av fraksjonen (Nf / Np) ved t = T.
- Trekk fra brøkdelen av døde bakterier som er tilstede i begynnelsen av eksperimentet (t = 1 min) for både kontrollen og de eksperimentelle kanalene.
- Trekk fra brøkdelen av døde bakterier som finnes i kontrollkanalen fra den som finnes i den eksperimentelle kanalen på hvert tidspunkt med følgende ligning:
- Graf DPnorm vs. t for løpet av eksperimentet.
Legg merke til at en prøve med en celledødsprosent større enn 1% anses som utsatt, mens mindre enn 0,5% død indikerer resistens. Prosenter som faller mellom disse to avskjæringene anses som ubestemte, og prøven må testes på nytt. - Bruk et regneark til å summere og analysere resultater fra forskjellige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dataene som presenteres i figur 4 viser responsen av en mottakelig Staphylococcus aureusstamme over tid i en antibiotikaholdig mikrofluidisk kanal. Fasekontrastbilder oppnådd ved 1 min og på slutten av 1 time-eksperimentet vises i figur 4A og B. De analyserte 1 time-dataene er vist i figur 4C med bakteriene uthevet i rødt (totalt 5828). Tilsvarende fluorescensbilder vises i figur 4D og E. De analyserte 1 time-dataene er vist i figur 4F med fluorescerende bakterier uthevet i rødt (174 døde).
Dette settet med bilder illustrerer flere punkter. Viktigst av alt, en betydelig økning i antall fluorescerende bakterier observeres ved slutten av eksperimentet (sammenlign antall lyse fluorescerende flekker ved 1 min og 60 min i figur 4D og E), noe som indikerer celledød inne i kanalen. Disse resultatene indikerer en utsatt belastning.
Et annet viktig poeng å merke seg er nødvendigheten av normaliseringene som brukes i ligningen ovenfor. På grunn av den stokastiske avviket til individuelle epoksyskliebelegg, kan det være bakteriell celletap gjennom hele eksperimentet under vedvarende skjærtrykk (sammenlign figur 4A og B). For å ta høyde for denne variasjonen normaliseres hvert fluorescensbilde av en død cellepopulasjon med det koacquired fasekontrastbildet som gir den totale cellepopulasjonen samtidig (innen 1 sek).
En normalisering til gjøres ved å trekke fra normalisert fluorescens ved starten av eksperimentet (t = 1 min) fra alle andre tidspunkter (t = T). Den døde cellen fluorescens på 1 min tilsvarer celledød før begynnelsen av eksperimentet. Høy fluorescens observert i begynnelsen av eksperimentet for enten MSSA eller MRSA indikerer vanligvis en dårlig tilstand av bakteriekulturen. I sjeldne tilfeller representerer det forurensning av PDMS-lysbildet.
Rammemartene i de nederste hjørnene av bildene er forstørrede versjoner av de innrammede bildeområdene fra både rå og analyserte bilder. Disse utvidelsene viser at tellealgoritmen vår er mer vellykket til å telle individuelle bakterier nøyaktig i fluorescensbilder enn i tett befolkede fasekontrastbilder.
Dødcelleflekken gir en høy fluorescenskontrast for individuelle døde bakterier. Siden antall fluorescerende bakterier sjelden overstiger 5% av det totale antallet, er hver bakterie veldig lys sammenlignet med bakgrunnen. Av denne grunn kan fluorescerende bakterier lett telles med høy grad av nøyaktighet. På den annen side er bakterier tett pakket på fasekontrastbildet. Videre er fasekontrasten i en bakterie ikke alltid jevn. Disse to faktorene utgjør en utfordring for en tellealgoritme, da den er avhengig av tersklering av forskjellige områder basert på deres omtrentlige størrelsesområder og intensiteter.
Derfor, for å sammenligne eksperimentelle resultater, er det nødvendig å bruke samme tellealgoritme med de samme parametrene gjennom forskjellige eksperimenter. Det er verdt å merke seg at på grunn av det lave antallet fluorescenstall, er det en høyere følsomhet for fluorescens miscounts; Derfor er det viktigere å telle fluorescensbildene nøyaktig enn fasekontrastbildene.
Til slutt er MSSA- og MRSA-data normalisert i henhold til ligningen ovenfor vist i figur 5 for tre forskjellige eksperimenter. Som forventet for resistente stammer er den normaliserte celledøden lav i størrelsesorden (<0,5%) og endres ikke i løpet av eksperimentet. Mottakelige stammer viser en jevn økning i celledød og en høyere verdi ved slutten av eksperimentet (>1%). Initieringen av celledød for mottakelige stammer varierer litt mellom eksperimenter, men forblir vanligvis mellom 10-30 min.
Figur 1. Et fotografi som viser geometriene og størrelsene på de mikrofluidiske kanalene i PDMS-laget. De smale delene av kanalene er 3,7 cm lange, 200 μm høye og 400 μm brede.
Figur 2. En CAD-modell som illustrerer hver av strømningscellekomponentene og deres relative posisjoner.
Figur 3. Et fotografi som viser det eksperimentelle oppsettet av mikroskopet og sprøytepumpen.
Figur 4. Fasekontrastbilder (A–C) og fluorescensbilder (D–F) for en representativ MSSA-stamme i en antibiotikaholdig kanal. Innfelt viser forstørrede bilder av de innfelte områdene. Mikroskopbilder ble anskaffet ved 60X forstørrelse. Klikk her for å vise større bilde.
Figur 5. Et diagram som viser normaliserte celledødsprosenter kontra tid. Hver av MSSA- og MRSA-stammene ble testet i tre separate eksperimenter.
Tabell 1. CellProfiler rutinemessige komponenter for automatisert bakterietelling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte protokollen ble validert og optimalisert i et sett med eksperimenter med methicillin-sensitive og methicillinresistente Staphylococcus aureusstammer 10. Derfor bør denne protokollen uten modifikasjon være direkte anvendelig for andre stammer av S. aureus og andre antibiotika med virkningsmekanismer som påvirker bakteriell celleveggbiosyntese. Andre bakterietyper enn S. aureus kan kreve variasjon i stressparametrene: løselige (enzymatiske) og mekaniske påkjenninger. Hvis løselige stressfaktorer er ønsket i testing av andre bakteriearter enn Staphylococcus, vil det være nødvendig med et annet stressmiddel, siden lysostaphin er et stafylokokker-spesifikt enzym.
Mengden skjærspenning er proporsjonal med væskens strømningshastighet og omvendt proporsjonal med kanalens størrelse, derfor kan den i prinsippet varieres innenfor et stort verdiområde. De oppnådde verdiene av stress er begrenset av følgende eksperimentelle faktorer: immobiliseringssubstratets evne til å holde bakterier på plass under høyere strømningshastigheter, den mikrofluidiske samlingen som opprettholder høyt trykk uten å lekke, væskestrømmotstanden inne i systemet, noe som kan gjøre strømningshastigheten ustabil eller til og med stoppe den ved lavere strømningshastigheter. Bindingens styrke var tilstrekkelig for S. aureus-forsøkene, men en økning i strømningshastigheten eller endringen av bakteriearter kan kreve en annen beleggtype. De epoksybelagte lysbildene brukes konvensjonelt til proteinmikroarrayanalyse og er ikke spesielt designet for å inneholde store cellulære gjenstander. Siden beleggets formulering og tetthet er proprietær, er utvikling av alternative formuleringer med kontrollert overflatebeleggavsetning svært ønskelig.
Vi har nylig funnet ut at tiden som kreves for bakteriell dyrking og vedlegg, kan reduseres sterkt. Kolonier kan dyrkes for å logge fase direkte fra en agarplate i et lite volum medier innen tre timer, og eliminerer nattkulturtrinnet. I tillegg kan vedlegg akselereres ved å sentrifugere bakteriene inne i strømningscellen i ett minutt, og fjerne 45 min bosettingstid. Eksperimenter i laboratoriet vårt kjøres for tiden med denne forkortede protokollen.
Selv om protokollen er spesielt designet for antibiotika rettet mot bakteriell celleveggbiosyntese, indikerer nyere studier at antibiotika med forskjellige primære mål i bakterieceller aktiverer de samme nedstrøms bakterieresponsveiene17,18. Derfor kan vår metode være anvendelig for rask identifisering av følsomhet for antibiotika som retter seg mot biosyntetiske veier som ikke er relatert til celleveggbiosyntese, og innledende studier i vårt laboratorium gir troverdighet til denne hypotesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den mikrofluidiske metoden er patentsøkt: Sauer-Budge A, Sharon A, Kalashnikov M, Wirz H, oppfinnere; Metode og enhet for rask påvisning av bakteriell antibiotikaresistens/følsomhetspatent PCT/US10/33523.
Acknowledgments
Vi takker ingeniørene og studentene ved Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. For å ha hjulpet til med design, maskinering og automatisering av det eksperimentelle systemet, takker vi Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin og Dr. Sudong Shu. Vi takker Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu og Katarzyna Kuliga for hjelp med testing av eksperimentelle protokoller og datainnsamling. Vi anerkjenner Dr. Anne E. Carpenter og Mark-Anthony Bray fra Imaging Platform ved Broad Institute of Harvard og MIT for å få hjelp til utvikling av bildeanalyserutinen i CellProfiler. Prosjektet som ble beskrevet ble delvis støttet av Awards R21AI079474 og 1R01AI101446 fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institute of Allergy and Infectious Diseases eller National Institutes of Health. Prosjektet ble også støttet av Fraunhofer USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | Dead cell fluorescence stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | Used for lysostaphin storage |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | Used for lysostaphin storage |
| Lysostaphin | Cell Sciences | CRL309A | Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml lysostaphin for storage |
| Oxacillin salt | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | Antibiotic |
| Mueller Hinton Broth | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving |
| 1 ml, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 309653 - 60 mL | Overfill to ~65 ml |
| Microscope | |||
| Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, Fluorescence/Phase contrast objective | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12-bit monochrome CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| Microscope automation | |||
| Shutters phase contrast/fluorescence | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| Focus motor | PRIOR Scientific | H122 | |
| Joystick for XYZ control | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscan Controller | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| Image Acquisition Software | Fraunhofer CMI | ||
| Flow Cell Assembly and PDMS | |||
| Flow Cell | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI |
| Glass window | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| Sealing plate | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| Epoxide glass slide | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS master | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine) |
| PDMS slide design | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| Tubing | |||
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green | IDEX Health Science | M-644-03 | Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule |
| Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black | IDEX Health Science | M-657 | |
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural | IDEX Health Science | P-255 | |
| Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow | IDEX Health Science | P-259 | Fits Luer-lock adapter |
| Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green | IDEX Health Science | 1520G | |
| Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red | IDEX Health Science | P-658 |
References
- Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Cao, J., et al. Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles. Lab Chip. 12, 474-484 (2012).
- Chen, C. H., et al. Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels. Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).
- Churski, K., et al. Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system. Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).
- Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).
- Kim, K. P., et al. In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device. Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).
- Peitz, I., van Leeuwen, R. Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis. Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).
- Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus. Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).
- Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin. J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).
- Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).
- Koch, A. L. Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research. Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell. 130, 797-810 (2007).
