Summary
Vi har utvecklat en mikrofluidisk plattform för snabb antibiotikakänslighetstestning. Vätska passeras i höga hastigheter över bakterier immobiliserade på botten av en mikrofluidisk kanal. I närvaro av stress och antibiotika dör mottagliga bakteriestammar snabbt. Resistenta bakterier kan dock överleva dessa stressiga förhållanden.
Abstract
Vi har utvecklat en snabb mikrofluidisk metod för antibiotikakänslighetstestning i en stressbaserad miljö. Vätska passeras i höga hastigheter över bakterier immobiliserade på botten av en mikrofluidisk kanal. I närvaro av stress och antibiotika dör mottagliga bakteriestammar snabbt. Resistenta bakterier överlever dock dessa stressiga förhållanden. Hypotesen bakom denna metod är ny: stressaktivering av biokemiska vägar, som är mål för antibiotika, kan påskynda testning av antibiotikakänslighet. Jämfört med vanliga metoder för testning av antibiotikakänslighet utelämnas det hastighetsbegränsande steget - bakterietillväxt - under antibiotikaapplikationen. Det tekniska genomförandet av metoden är i en kombination av standardtekniker och innovativa tillvägagångssätt. Standarddelarna i metoden inkluderar bakteriekulturprotokoll, definition av mikrofluidkanaler i polydietylsiloxan (PDMS), celllivskraftsövervakning med fluorescens och batchbildbehandling för bakterieräkning. Innovativa delar av metoden används i odlingsmedieflödet för mekanisk stressapplikation, användning av enzymer för att skada men inte döda bakterierna och användning av mikroarraysubstrat för bakteriell fastsättning. Den utvecklade plattformen kan användas i antibiotika och icke-antibiotisk relaterad läkemedelsutveckling och testning. Jämfört med de vanliga bakteriella suspensionsexperimenten kan effekten av läkemedlet aktiveras och inaktiveras upprepade gånger under kontrollerade tidsperioder. Repetitiv observation av samma bakteriepopulation är möjlig under samma experiment.
Introduction
Ökningen av bakteriell resistens ökar behovet av snabba fenotypbaserade antibiotikakänslighetstester för att skydda våra läkemedel i sista utväg. Standardkänslighetstester baseras på bakteriell tillväxthämning i närvaro av antibiotika som tar flera (8-24) timmar att slutföra. Vi har utvecklat ett nytt antibiotikakänslighetstest på en mikrofluidisk plattform som förlitar sig på stressaktivering av biosyntetiska vägar för att påskynda antibiotikans verkan.
Antibiotikakänslighetstester på mikrofluidisk skala har fördelen av effektiv provanvändning, eftersom de kräver ett litet antal bakterier. Dessutom kan mikrofluidiska enheter multiplexeras för att testa flera prover under flera förhållanden1,2. Nyligen har ett antal mikrofluidiska metoder för antibiotikakänslighetstestning rapporterats3-9. I dessa metoder odlas bakterier inuti nano- och picoliterdroppar3,7, i hela volymen av den mikrofluidiska kanalen4-6,8, eller som enstaka bakterier elektriskt lokaliserade till kanal9: s bottenyta. Även om dessa tester utförs i mikrofluidiska kanaler, övervakar de alla mikrobiell tillväxt i närvaro och frånvaro av antibiotika som liknar traditionella metoder. Tillväxtmätningar görs via optisk densitet, pH-känsliga färgämnen eller ljusa fält-/faskontrast- eller fluorescensbilder. Även om vissa av dessa tester är snabbare än traditionella metoder, upptäcker de var och en passivt antibiotikaresistens. Med andra ord kräver dessa metoder fortfarande att användaren väntar på bakterietillväxt som den slutliga avläsningen.
Däremot har vi utvecklat en metod som använder en kombination av sav och enzymatisk stress för att aktivera antibiotikakänsliga biokemiska vägar10. Att utmana de stressade bakterierna med dessa antibiotika skapar ett snabbare känslighetstest. Bakterier som är resistenta mot antibiotikumet kan motstå de stressiga förhållandena. Mottagliga bakterier dödas å andra sidan snabbt av de kombinerade påfrestningarna. Andelen celldöd efter en timme, mätt med mikroskopi med hjälp av en fluorescerande död cellfläck, definierar bakterietypen fenotyp (resistent kontra mottaglig).
För en framgångsrik implementering av vår metod måste bakterier immobiliseras på den mikrofluidiska kanalens bottenyta. På så sätt kan bakterier utsättas för olika påfrestningar och samtidigt avbildas under ett mikroskop i ett enda plan. En belagd mikroskopglasrutschbana används för bakterie immobilisering. Bilden är förbelagd av tillverkaren med epoxidgrupper för ospecificerad proteinbindning. Den ospecificerade bindningen av dessa epoxider till bakteriella ytproteiner binder kovalently bakterierna till glidytan.
Stammar testas under identiska förhållanden (sav + enzymatisk stress) i frånvaro (kontroll) och förekomst (experiment) av antibiotika. Faskontrast och fluorescensmikroskopbilder av varje kanal tas automatiskt varannan minut i en timme. Resistensbeteckningar görs sedan genom att jämföra procenten av döda bakterier i den experimentella kanalen med de som finns i kontrollkanalen. Efter en timme anses ett prov med en celldödsprocent som är större än 1% vara mottagligt, medan mindre än 0,5% död tyder på resistens. Procentandelar som faller mellan dessa två brytningar anses vara obestämda och provet måste testas igen.
Mikrofluidiska kanaler definieras i PDMS, som är ett material som är val för mikrofluidiska enheter11. PDMS är optiskt transparent i ett brett spektrum av våglängder, biokompatibla, inerta, genomträngliga för gaser och har låg permeabilitet för vätskor. därför är det väl lämpat för dessa experiment.
Mekanisk/savspänning skapas av flödet av rumstemperaturmedier över de immobiliserade bakterierna. (Obs: Uppvärmning av mediet till 37 °C har ingen signifikant effekt på analysresultatet.) Automatiserade sprutpumpar tvingar media (som innehåller dödcellsfläck +/- antibiotikum, liksom valfria enzymatiska stressfaktorer) genom mikrofluidkanalerna (200 μm x 400 μm) med en flödeshastighet på 1 ml/min för att ge 6,25 kPa skjuvkraft eller en skjuvhastighet på 6 000 sek-1. Denna hastighet är lika med eller överstiger tidigare studerade savspänningar på Staphylococci.
Enzymet, lysostaphin, valdes ut för preliminära experiment eftersom det orsakar direkt skada på Staphylococcus cellvägg. Koncentrationen av lysostaphin (0,7 ng/ml) var tillräcklig för att orsaka bakteriell cellväggsskada, men inte tillräcklig för att orsaka bakteriecellsdöd utan antibiotika inom experimentet. Lysostaphin krävs inte för korrekt beteckning av bakteriell känslighet men det ökar resultatet, vilket leder till ökad celldöd hos mottagliga stammar. Däremot är savstress avgörande för analysfunktionen. När methicillinkänsliga Staphylococcus aureus-stammar behandlas med lysostaphin och oxacillin i avsaknad av flöde registreras ingen celldöd under experimentet.
Cellens livskraft övervakas med en fluorescerande död cellfläck12. Valet av färgämnet baserades på dess förmåga att selektivt färga endast skadade celler, dess icke-toxicitet till levande celler och dess låga bakgrund fluorescens, vilket tillät dess direkta tillägg till cellmediet utan ytterligare steg. Valet av en fluorescerande färgkoncentration på 0, 25 μM var att uppnå acceptabla signalnivåer under en exponeringstid på 1, 6 sekunder för fluorescens excitationsljus.
Beta-laktaam, oxacillin, användes i våra preliminära studier. Methicillinresistenta S. aureus (MRSA) arter är resistenta mot oxacillin och kommer inte att visa någon märkbar celldöd inom tidsramen för experimentet. Koncentrationen på 50 μg/ml fastställdes i förstudierna. Lägre koncentrationer av antibiotika gav mindre separation mellan resistenta och mottagliga stammar, medan högre koncentrationer inte orsakade någon märkbar skillnad i experimentella resultat.
Vi har tidigare rapporterat om framgångsrik utveckling av ett test som kombinerar mekaniska och enzymatiska påfrestningar som direkt påverkar bakteriecellväggen13 med ett antibiotikum som hämmar cellväggens biosyntes14,15. Dessa principiella experiment utfördes i en panel av MRSA och methicillin-känsliga S. aureus (MSSA). Men med valet av lämpliga experimentella parametrar bör vår metod tillämpas på flera arter av bakterier och flera klasser av antibiotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gör PDMS-skiktet (bild 1)
- Blanda PDMS och härdningsmedel kraftigt i ett 10:1-förhållande. För att ta bort bubblor avgasar viskösblandningen i en vakuumkammare i 1 timme vid rumstemperatur.
- På en skala häll PDMS långsamt över aluminiumformen. Häll från mitten och håll formen utjämnad. Se till att lämna stiften oskyddade. Sluta hälla när målvikten har uppnåtts.
Vår form kräver 4 g PDMS och 0,4 g härdningsreagens. - Jämna ut formen i en ugn och härda vid 37 °C över natten.
Alternativa härdningstider är 2 timmar vid 60 °C eller 1 timme vid 90 °C. - Dissekera det härdade PDMS-skiktet längs formens kant och skala försiktigt av det från mögelytan med ett par tång. Rengör mögelytan med 70% etanol och en Q-tip.
2. Montera flödescellen enligt figur 2
Standardmontering av PDMS med glasrutschbanor sker genom syreplasmabehandling av båda ytorna, vilket säkerställer läckagefri bindning mellan PDMS och mikroskopglasrutschbanan. I det presenterade protokollet skulle plasmabehandlingen förstöra den kemiska beläggningen på glasrutschbanan. Därför är glidningen trycktätad snarare än plasmabehandlad.
- Placera glasfönstret i flödescellsfickan.
- Lägg en belagd glasrutschbana över glasfönstret inuti fickan på flödescellen med den aktiva sidan uppåt och placera PDMS-skiktet med kanalerna vända nedåt ovanpå. Placera PDMS-bilden på ett sådant sätt att kanalingångarna överensstämmer med genomgående hål i metallplattan. Tryck försiktigt ut luften mellan lagren.
- Vänd PDMS/glasbildsenheten så att PDMS är vänd mot glasfönstret. Överlappa PDMS-kanalingångarna med genomgående hål i metallplattan.
- Placera tryckplattan ovanpå och dra åt skruvarna.
- Placera den monterade flödescellen under mikroskopet. Ställ in mikroskopförstoringen på 60X och föraligna kanalpositionerna.
3. Förbered logfasbakterier
- Dagen före experimentet: Inokulera 50 ml Mueller Hinton-buljong som innehåller 2% NaCl (MH2) med en bakteriekoloni. Skaka vid 250 varv/min över natten vid 37 °C.
En eller två bakteriestammar kan studeras i ett experiment för den beskrivna uppsättningen. - Före experimentet: Blanda 50 μl över nattens bakteriekultur i 50 ml MH2-media. Skaka vid 250 varv/min i 3 timmar vid 37 °C för att säkerställa att bakterierna är i timmerfas.
4. Värm de experimentella lösningskomponenterna minst 10 minuter innan de behövs
- Tina fluorescerande färgämne (5 mM lager) och lysostaphin (10 μg/ml lager) vid rumstemperatur.
- Värm oxacillinpulvret till rumstemperatur.
5. Förbered och ladda bakterieupphängningen
- Efter slutet av 3 timmars subkultur: Ta 10 ml bakteriekultur och centrifugera vid 1 650 x g i 2 minuter.
- Ta bort supernatanten och återanvända bakterierna i 1 ml färska MH2-medier.
- Fäst en kort slanglängd på en 1 ml Luer låsspruta. Spola sprutslangen med 1 ml media. Lämna lite media i slangen för att undvika luftbubblor när du drar in bakteriesuspensionen.
- Ladda 0,7 ml bakterier typ 1 i sprutan. Fyll två kanaler i flödescellen med bakterier typ 1. Titta efter att vätskan visas på andra sidan kanalen efter ca. 150 μl.
Kanalens transparens förändras när den är fylld med bakterier. - Om du experimenterar med flera bakterietyper, upprepa belastningsproceduren för bakterier typ 2 i flödescellens två återstående kanaler.
- Placera flödescellen inuti inkubatorn vid 37 °C i 45 minuter för att möjliggöra bakteriell sedimentering och fastsättning på glidytan.
6. Förbered och ladda de experimentella lösningarna
- Bered 140 μl 0,5 mM fluorescerande färglösning genom att blanda 14 μl fluorescerande färglager (5 mM) och 126 μl MH2-media.
- Späd 10 mg oxacillin i 40 ml MH2-media för att erhålla en slutlig koncentration på 250 μg/ml oxacillin.
- Bered 130 ml styrlösning med slutliga koncentrationer på 0,25 μM fluorescerande färgämne och 0,7 ng/ml lysostaphin. För att göra det, blanda 65 μl fluorescerande färgämne (0,5 mM), 9,12 μl lysostaphinlager (10 μg/ml) och 130 ml MH2-media.
- Bered 130 ml antibiotikalösning med slutliga koncentrationer på 0,25 μM fluorescerande färgämne, 0,7 ng/ml lysostaphin och 50 μg/ml oxacillin. För att göra det, blanda 65 μl fluorescerande färgämne (0,5 mM), 9,12 μl lysostaphinlager (10 μg/ml), 26 ml oxacillin (250 μg/ml) och 104 ml MH2-media.
- Fyll två 60 ml sprutor med kontrolllösning och två 60 ml sprutor med antibiotikalösning. Förvara lösningar inlindade i aluminiumfolie för att undvika ljusinducerad nedbrytning av reagenserna.
Överfyll sprutorna för att ta hänsyn till förlust på grund av spolning av slangen. - Ta bort luftbubblorna från sprutorna genom att snärta. Fäst och fyll inmatningsslangen på spetsen med den experimentella lösningen.
- Montera sprutor på pumpen. Placera sprutan med den minsta volymen först och lås sedan kolvens läge. Montera resten av sprutorna på pumpen och kläm kolven efter behov.
- Ställ in pumphastigheten på 1 ml/min och pumpvolymen till 60 ml. Spola med pumpen tills en jämn ström av vätska ses från alla sprutor.
7. Ställ in flödescellen under mikroskopet
- Ta bort flödescellen från centrifugen och montera den på mikroskopstadiet (bild 3).
- Anslut ingångs-/utgångsrör till var och en av flödescellkanalerna (en ingång/en utgång per kanal).
Genom att samla in utdata i fyra olika behållare kan du mäta enskilda kanalutgångsvolymer.
8. Kör 60-minutersexperimentet
- Kontrollera de förjusterade positionerna från steg 2.5. Om mikroskopets synfält inte är centrerat på kanalen och/eller är ur fokus justerar du inställningarna och sparar de nya positionerna.
Exakt fokusering kanske inte är möjlig innan flödet startar på grund av den höga densiteten hos laddade bakterier. - Ställ in faskontrastförvärvstiden till 10 msek och fluorescensförvärvstiden till 1 600 msek.
- Få faskontrast- och fluorescensbilder för varje position innan du initierar flödet.
Detta ger en kvalitativ uppskattning av den laddade bakterietätheten. - Starta vätskeflödet och kontrollera omedelbart att mikroskopet är fokuserat på botten av kanalerna.
- Ta faskontrast- och fluorescensbilder av målområdena inom den första minuten av flödet.
- Hämta bilder varannan minut efter att den första uppsättningen bilder tills 60 minuters flöde har inträffat. Fokusera om vid behov.
9. Desinficera flödescellen
- Gör en 10% blekmedelslösning i en bägare (100 ml). Fyll 4 x 20 ml sprutor med 10 ml av blandningen. Debubble sprutorna och fäst dem på flödescellen.
Det tar ~1-2 min för kanalerna att vara fria från bakterier. - Ställ in pumphastigheten på 1 ml/min och pumpvolymen till 3 ml. Spring i 3 minuter.
- Fyll 4 x 60 ml sprutor med 60 ml DI-vatten. Debubble sprutorna och fäst dem på flödescellen.
- Ställ in pumphastigheten på 1 ml/min och pumpvolymen till 30 ml. Spring i 30 minuter.
- Övervaka kanalrengöringen under mikroskopet.
- Demontera flödescellen. Kassera den använda epoxibilden. Blötlägg flödescellkomponenterna i DI-vatten i 20 min. Lufttorka.
10. Analysera bilder och generera data
- Räkna antalet bakterier i varje bild.
CellProfiler är öppen åtkomst och används för att utföra batchavbildningsbearbetning16. En disposition på hög nivå av cellprofiler-rutinen sammanfattas i tabell 1. Antalet bakterier som finns i faskontrastbilden (Np)ger det totala bakterieantalet. Antalet bakterier som syns i fluorescensbilden (Nf)ger antalet döda bakterier. - Beräkna den normaliserade bakteriecellsdödsprocenten som en tidsfunktion.
- Importera Nf och Np för enskilda bilder till dataanalysprogramvaran.
- Beräkna fraktionen av döda bakterier i varje kanal vid en viss tidpunkt som ges av fraktionen (Nf / Np) vid t = T.
- Subtrahera den fraktion av döda bakterier som fanns i början av försöket (t = 1 min) för både kontrollen och de experimentella kanalerna.
- Subtrahera den del av döda bakterier som finns i kontrollkanalen från den som finns i den experimentella kanalen vid varje tidpunkt med följande ekvation:
- GrafDP-norm vs. t för experimentet.
Observera att ett prov med en celldödsprocent som är större än 1% anses vara mottagligt, medan mindre än 0,5% död tyder på resistens. Procentandelar som faller mellan dessa två brytningar anses vara obestämda och provet måste testas igen. - Använd ett kalkylblad för att sammanfatta och analysera resultat från olika experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De data som presenteras i figur 4 visar svaret från en mottaglig Staphylococcus aureus stam över tid i en antibiotikainnehållande mikrofluidisk kanal. Faskontrastbilder som förvärvats vid 1 min och i slutet av 1 timmes experiment visas i figurerna 4A och B. De analyserade 1 timdata visas i figur 4C med bakterierna markerade i rött (5 828 totalt). Motsvarande fluorescensbilder visas i figurerna 4D och E. De analyserade 1 timdata visas i figur 4F med fluorescerande bakterier markerade i rött (174 döda).
Den här uppsättningen bilder illustrerar flera punkter. Viktigast av allt är att en signifikant ökning av antalet fluorescerande bakterier observeras i slutet av experimentet (jämför antalet ljusa fluorescerande fläckar vid 1 min och 60 min i figurerna 4D och E), vilket indikerar celldöd inuti kanalen. Dessa resultat tyder på en mottaglig stam.
En annan viktig punkt att notera är nödvändigheten av de normaliseringar som används i ekvationen ovan. På grund av den stokastiska nonuniformiteten hos enskilda epoxirutschbanor kan det finnas bakteriell cellförlust under hela experimentet under ihållande saxtryck (jämför figurerna 4A och B). För att ta hänsyn till denna variation normaliseras varje fluorescensbild av en död cellpopulation med den coacquired faskontrastbilden som ger den totala cellpopulationen samtidigt (inom 1 sek).
Ytterligare en normalisering görs genom att subtrahera den normaliserade fluorescensen i början av försöket (t = 1 min) från alla andra tidpunkter (t = T). Den döda cellen fluorescens vid 1 min motsvarar celldöd före början av experimentet. Hög fluorescens observeras i början av experimentet för antingen MSSA eller MRSA indikerar vanligtvis ett dåligt tillstånd i bakteriekulturen. I sällsynta fall representerar det förorening av PDMS-bilden.
Inseten i bildernas nedre hörn är förstorade versioner av de boxade bildområdena från både de råa och analyserade bilderna. Dessa utvidgningar visar att vår räknealgoritm är mer framgångsrik när det gäller att exakt räkna enskilda bakterier i fluorescensbilder än i tätbefolkade faskontrastbilder.
Den döda cellfläcken ger en hög fluorescenskontrast för enskilda döda bakterier. Eftersom antalet fluorescerande bakterier sällan överstiger 5% av det totala antalet, är varje bakterie mycket ljus jämfört med bakgrunden. Av denna anledning kan fluorescerande bakterier lätt räknas med en hög grad av noggrannhet. Å andra sidan packas bakterier tätt på faskontrastbilden. Dessutom är faskontrasten i en bakterie inte alltid enhetlig. Dessa två faktorer utgör en utmaning för en räknealgoritm eftersom den förlitar sig på tröskel för olika områden baserat på deras ungefärliga storleksintervall och intensiteter.
För att jämföra experimentella resultat är det därför nödvändigt att använda samma räknealgoritm med samma parametrar i olika experiment. Det är värt att notera att på grund av det låga antalet fluorescensräkningar finns det en högre känslighet för fluorescens miscounts; Därför är det viktigare att noggrant räkna fluorescensbilderna än faskontrastbilderna.
Slutligen visas MSSA- och MRSA-data som normaliserats enligt ekvationen ovan i figur 5 för tre olika experiment. Som förväntat för resistenta stammar är den normaliserade celldöden låg i magnitud (<0,5%) och förändras inte under experimentet. Mottagliga stammar visar en stadig ökning av celldöden och ett högre värde i slutet av experimentet (>1%). Initieringen av celldöd för mottagliga stammar varierar något mellan experimenten, men stannar vanligtvis mellan 10-30 min.
Figur 1. Ett fotografi som visar geometrierna och storlekarna på de mikrofluidiska kanalerna i PDMS-skiktet. Kanalerna är 3,7 cm långa, 200 μm höga och 400 μm breda.
Figur 2. En CAD-modell som illustrerar var och en av flödescellkomponenterna och deras relativa positioner.
Figur 3. Ett fotografi som visar mikroskopets och sprutpumpens experimentella uppstad.
Figur 4. Faskontrast (A–C) och fluorescensbilder (D–F) för en representativ MSSA-stam inom en antibiotikainnehållande kanal. Insets visar förstorade bilder av de boxade områdena. Mikroskop bilder förvärvades vid 60X förstoring. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 5. Ett diagram som visar normaliserade celldödsprocent jämfört med tid. Var och en av MSSA- och MRSA-stammarna testades i tre separata experiment.
Tabell 1. CellProfiler rutinkomponenter för automatiserad bakterieräkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det presenterade protokollet validerades och optimerades i en uppsättning experiment med meticillinkänsliga och meticillinresistenta Staphylococcus aureus stammar 10. Därför bör detta protokoll utan modifiering vara direkt tillämpligt på andra stammar av S. aureus och andra antibiotika med verkningsmekanismer som påverkar bakteriell cellväggsbiosyntes. Andra bakterietyper än S. aureus kan kräva variation i stressparametrarna: lösliga (enzymatiska) och mekaniska påfrestningar. Om lösliga stressfaktorer önskas vid testning av andra bakteriearter än Staphylococcus, kommer ett annat stressmedel att krävas, eftersom lysostaphin är ett stafylokockspecifikt enzym.
Mängden saxstress står i proportion till vätskans flödeshastighet och står omvänt i proportion till kanalens storlek, därför kan den i princip varieras inom ett stort antal värden. De uppnådda värdena för stress begränsas av följande experimentella faktorer: immobiliseringssubstratens förmåga att hålla bakterier på plats under högre flödeshastigheter, den mikrofluidiska enheten upprätthåller höga tryck utan att läcka, vätskeflödesbeständigheten inuti systemet, vilket kan göra flödeshastigheten instabil eller till och med stoppa den vid lägre flödeshastigheter. Bindningens styrka var tillräcklig för S. aureus-experimenten, men en ökning av flödeshastigheten eller förändringen av bakteriearter kan kräva en annan beläggningstyp. De epoxibelagda diabilderna används konventionellt för proteinmikroarrayanalys och är inte särskilt utformade för att rymma stora cellulära föremål. Eftersom beläggningens formulering och densitet är proprietär är utveckling av alternativa formuleringar med kontrollerad ytbeläggningsdeposition mycket önskvärd.
Vi har nyligen funnit att den tid som krävs för bakterieodling och fastsättning kan minskas kraftigt. Kolonier kan odlas för att logga fas direkt från en agarplatta i en liten mängd media inom tre timmar, vilket eliminerar kultursteget över natten. Dessutom kan fastsättningen påskyndas genom att bakterierna centrifugeras inuti flödescellen i en minut, vilket tar bort 45 minuters sedimenteringstid. Experiment i vårt laboratorium körs för närvarande med detta förkortade protokoll.
Även om protokollet har utformats speciellt för antibiotika som riktar sig mot bakteriell cellväggsbiosyntes, visar nyligen genomförda studier att antibiotika med olika primära mål i bakterieceller aktiverar samma nedströms bakteriella svarsvägar17,18. Därför kan vår metod vara tillämplig för snabb identifiering av mottaglighet för antibiotika som riktar sig till biosyntetiska vägar som inte är relaterade till cellväggens biosyntes, och inledande studier i vårt laboratorium ger trovärdighet till denna hypotes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den mikrofluidiska metoden är patentsökt: Sauer-Budge A, Sharon A, Kalashnikov M, Wirz H, uppfinnare; Metod och enhet för snabb detektion av bakteriell antibiotikaresistens/mottaglighet patent PCT/US10/33523.
Acknowledgments
Vi tackar ingenjörerna och studenterna på Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. För att ha hjälpt till med design, bearbetning och automatisering av det experimentella systemet tackar vi Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin och Dr. Sudong Shu. Vi tackar Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu och Katarzyna Kuliga för hjälp med att testa experimentella protokoll och datainsamling. Vi bekräftar Drs. Anne E. Carpenter och Mark-Anthony Bray från Imaging Platform vid Broad Institute of Harvard och MIT för hjälp med utvecklingen av bildanalysrutinen i CellProfiler. Projektet som beskrevs stöddes delvis av Utmärkelser R21AI079474 och 1R01AI101446 från National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institute of Allergy and Infectious Diseases eller National Institutes of Health. Projektet stöddes också av Fraunhofer USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | Dead cell fluorescence stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | Used for lysostaphin storage |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | Used for lysostaphin storage |
| Lysostaphin | Cell Sciences | CRL309A | Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml lysostaphin for storage |
| Oxacillin salt | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | Antibiotic |
| Mueller Hinton Broth | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving |
| 1 ml, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 309653 - 60 mL | Overfill to ~65 ml |
| Microscope | |||
| Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, Fluorescence/Phase contrast objective | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12-bit monochrome CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| Microscope automation | |||
| Shutters phase contrast/fluorescence | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| Focus motor | PRIOR Scientific | H122 | |
| Joystick for XYZ control | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscan Controller | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| Image Acquisition Software | Fraunhofer CMI | ||
| Flow Cell Assembly and PDMS | |||
| Flow Cell | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI |
| Glass window | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| Sealing plate | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| Epoxide glass slide | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS master | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine) |
| PDMS slide design | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| Tubing | |||
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green | IDEX Health Science | M-644-03 | Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule |
| Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black | IDEX Health Science | M-657 | |
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural | IDEX Health Science | P-255 | |
| Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow | IDEX Health Science | P-259 | Fits Luer-lock adapter |
| Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green | IDEX Health Science | 1520G | |
| Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red | IDEX Health Science | P-658 |
References
- Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Cao, J., et al. Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles. Lab Chip. 12, 474-484 (2012).
- Chen, C. H., et al. Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels. Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).
- Churski, K., et al. Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system. Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).
- Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).
- Kim, K. P., et al. In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device. Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).
- Peitz, I., van Leeuwen, R. Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis. Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).
- Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus. Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).
- Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin. J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).
- Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).
- Koch, A. L. Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research. Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell. 130, 797-810 (2007).
