Summary
Vi har udviklet en mikrofluidic platform for hurtig antibiotika modtagelighed test. Væske overføres ved høje hastigheder over bakterier immobiliseret på bunden af en mikrofluidic kanal. I nærværelse af stress og antibiotika dør modtagelige bakteriestammer hurtigt. Men, resistente bakterier kan overleve disse stressende forhold.
Abstract
Vi har udviklet en hurtig mikrofluidic metode til antibiotika modtagelighed test i et stress-baseret miljø. Væske overføres ved høje hastigheder over bakterier immobiliseret på bunden af en mikrofluidic kanal. I nærværelse af stress og antibiotika dør modtagelige bakteriestammer hurtigt. Men resistente bakterier overleve disse stressende forhold. Hypotesen bag denne metode er ny: stressaktivering af biokemiske veje, som er mål for antibiotika, kan fremskynde antibiotikafølsomhedstest. Sammenlignet med standard antibiotika modtagelighed testmetoder, den sats-begrænsende trin - bakteriel vækst - er udeladt under antibiotika ansøgning. Den tekniske gennemførelse af metoden er i en kombination af standardteknikker og innovative tilgange. Standarddelene af metoden omfatter bakteriekulturprotokoller, definition af mikrofluidiske kanaler i polydimethylsiloxan (PDMS), cellelevedygtighedsovervågning med fluorescens og batchbilledbehandling til bakterietælling. Innovative dele af metoden er i brugen af kultur medier flow til mekanisk stress anvendelse, brug af enzymer til at beskadige, men ikke dræbe bakterier, og brug af microarray substrater til bakteriel fastgørelse. Den udviklede platform kan bruges i antibiotika og nonantibiotiske relaterede lægemidler udvikling og test. Sammenlignet med standard bakterielle suspension eksperimenter, effekten af lægemidlet kan tændes og slukkes gentagne gange over kontrollerede tidsperioder. Gentagen observation af den samme bakteriepopulation er mulig i løbet af det samme eksperiment.
Introduction
Stigningen i bakteriel resistens intensiverer behovet for hurtige fænotypebaserede antibiotikafølsomhedstest for at beskytte vores lægemidler i sidste instans. Standard susceptibilitetstest er baseret på bakteriel væksthæmning i nærværelse af antibiotika, der tager flere (8-24) timer at gennemføre. Vi har udviklet en ny antibiotika modtagelighed test på en mikrofluidic platform, der er afhængig af stress-aktivering af biosyntetiske veje til at fremskynde virkningen af antibiotika.
Antibiotikafølsomhedstest på mikrofluidisk skala har den fordel, at de anvendes effektivt, da de kræver et lille antal bakterier. Derudover kan mikrofluidiske enheder multixeres for at teste flere prøver under flere forhold1,2. For nylig er en række mikrofluidiske metoder til antibiotikafølsomhedstest blevet rapporteret3-9. I disse metoder dyrkes bakterier inde i nano- og picoliterdråber3,7, i det fulde volumen af den mikrofluidiske kanal4-6,8, eller som enkelte bakterier elektrisk lokaliseret til bunden af kanalen9. Selvom disse test udføres i mikrofluidiske kanaler, overvåger de alle mikrobiel vækst i tilstedeværelsen og fraværet af antibiotika svarende til traditionelle metoder. Vækstmålinger foretages via optisk tæthed, pH-følsomme farvestoffer eller lyse felt-/fasekontrast- eller fluorescensbilleder. Selvom nogle af disse tests er hurtigere end traditionelle metoder, detekterer de hver især passivt antibiotikaresistens. Med andre ord kræver disse metoder stadig, at brugeren venter på bakterievækst som den endelige udlæsning.
I modsætning hertil har vi udviklet en metode, der bruger en kombination af forskydning og enzymatisk stress til at aktivere antibiotikafølsomme biokemiske veje10. Udfordrende stressede bakterier med disse antibiotika skaber en hurtigere modtagelighed test. Bakterier, der er resistente over for antibiotika er i stand til at modstå de stressende forhold. Modtagelige bakterier dræbes på den anden side hurtigt af de kombinerede belastninger. Procentdelen af celledød efter en time, målt ved mikroskopi ved hjælp af en fluorescerende død celleplet, definerer bakteriernes fænotype (resistent vs. modtagelig).
For en vellykket implementering af vores metode skal bakterier immobiliseres på bundoverfladen af den mikrofluidiske kanal. På denne måde kan bakterier udsættes for forskellige belastninger og samtidig afbildes under et mikroskop i et enkelt plan. En belagt mikroskop glas dias bruges til bakterier immobilisering. Rutsjebanen er forlakeret af producenten med epoxidgrupper til uspecifik proteinbinding. Den uspecifikke binding af disse epoxider til bakterielle overfladeproteiner fastgøre kovalent bakterierne til diasoverfladen.
Stammer testes under identiske forhold (forskydning + enzymatisk stress) i fravær (kontrol) og tilstedeværelse (eksperiment) af antibiotika. Fasekontrast og fluorescensmikroskopbilleder af hver kanal tages automatisk hvert andet minut i en time. Resistensbetegnelser foretages derefter ved at sammenligne procentdelen af døde bakterier i den eksperimentelle kanal med dem, der er til stede i kontrolkanalen. Efter en time anses en prøve med en celledødsprocent på over 1% for at være modtagelig, mens mindre end 0,5% død er tegn på resistens. Procenter, der falder mellem disse to afskæringer, betragtes som ubestemte, og prøven skal testes igen.
Mikrofluidiske kanaler defineres i PDMS, som er et materiale efter eget valg for mikrofluidiske enheder11. PDMS er optisk gennemsigtigt i en lang række bølgelængder, biokompatible, inerte, gennemtrængelige for gasser og har lav permeabilitet over for væsker. derfor er det velegnet til disse eksperimenter.
Mekanisk /forskydningsstress skabes af strømmen af rumtemperaturmedier over de immobiliserede bakterier. (Bemærk: Opvarmning af mediet til 37 °C har ingen væsentlig indvirkning på analysens resultat.) Automatiserede sprøjtepumper tvinger medier (indeholdende død celleplet +/- antibiotikum samt valgfrie enzymatiske stressorer) gennem de mikrofluidiske kanaler (200 μm x 400 μm) med en strømningshastighed på 1 ml/min for at give 6,25 kPa for forskydningskraft eller en forskydningshastighed på 6.000 sek.-1. Denne sats er lig med eller overstiger tidligere studerede forskydningsspændinger på Staphylococci.
Enzymet lysostaphin blev udvalgt til indledende eksperimenter, fordi det forårsager direkte skade på Staphylococcus cellevæggen. Koncentrationen af lysostaphin (0,7 ng/ml) var tilstrækkelig til at forårsage bakteriel cellevægsskade, men ikke tilstrækkelig til at forårsage bakteriecelledød uden antibiotika inden for forsøgets tidsramme. Lysostaphin er ikke nødvendig for den korrekte betegnelse af bakteriel modtagelighed, men det øger resultatet, hvilket fører til øget celledød i modtagelige stammer. I modsætning hertil er forskydningsstress afgørende for analysens funktion. Når methicillinfølsomme Staphylococcus aureus-stammer behandles med lysostaphin og oxacillin uden flow, registreres der ingen celledød i løbet af forsøget.
Celle levedygtighed overvåges med en fluorescerende død celle plet12. Udvælgelsen af farvestoffet var baseret på dets evne til selektivt at plette kun beskadigede celler, dets manglendetoksicitet for levende celler og dets lave baggrundsfluorescens, som gjorde det muligt for dets direkte tilføjelse til cellemediet uden yderligere trin. Valget af en fluorescerende farvestofkoncentration på 0,25 μM var at opnå acceptable signalniveauer i løbet af en 1,6 sek eksponeringstid for fluorescens excitationslys.
Beta-lactam, oxacillin, blev brugt i vores indledende undersøgelser. Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) arter er resistente over for oxacillin og vil ikke vise nogen mærkbar celledød i tidsrammen for forsøget. Koncentrationen på 50 μg/ml blev bestemt i de indledende undersøgelser. Lavere koncentrationer af antibiotika gav mindre adskillelse mellem resistente og modtagelige stammer, mens højere koncentrationer ikke forårsagede en mærkbar forskel i eksperimentelle resultater.
Vi har tidligere rapporteret om den vellykkede udvikling af en test, der kombinerer mekaniske og enzymatiske belastninger, der direkte påvirker bakteriecellevæggen13 med et antibiotikum, der hæmmer cellevægbiosyntese14,15. Disse principielle forsøg blev udført i et panel af MRSA og mødtes med en sikkerhedsfølsom S. aureus (MSSA). Men med udvælgelsen af ordentlige eksperimentelle parametre, bør vores metode gælder for flere arter af bakterier og flere klasser af antibiotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lav PDMS-laget (figur 1)
- Bland kraftigt PDMS og hærdningsmiddel i et 10:1-forhold. For at fjerne bobler afgases den tyktflydende blanding i et vakuumkammer i 1 time ved stuetemperatur.
- På en skala hældes PDMS langsomt over aluminiumsformen. Hæld fra midten og holde formen jævnet med jorden. Sørg for at lade stifterne være afdækket. Stop med at hælde, når målvægten er nået.
Vores form kræver 4 g PDMS og 0,4 g hærdningsreagens. - Niveau formen inde i en ovn, og helbrede ved 37 °C natten over.
Alternative hærdningstider er 2 timer ved 60 °C eller 1 time ved 90 °C. - Disseker det hærdede PDMS-lag langs kanten af formen og skræl det forsigtigt af formens overflade med et par pincet. Rengør formen overflade med 70% ethanol og en Q-tip.
2. Saml flowcellen i henhold til figur 2
Standardmontering af PDMS med glasrutsjebaner sker gennem iltplasmabehandling af begge overflader, hvilket sikrer lækagefri binding mellem PDMS og mikroskopglasrutsjebane. I den præsenterede protokol ville plasmabehandlingen ødelægge den kemiske belægning på glasrutsjebanen. Derfor er diaset tryklukket i stedet for plasmabehandlet.
- Placer glasvinduet i flowcellelommen.
- Læg et belagt glasrutsjebane over glasvinduet inde i lommen på flowcellen med den aktive side op, og placer PDMS-laget med kanaler nedad på toppen af det. Placer PDMS-diaset på en sådan måde, at kanalindgangene flugter med gennemhullerne i metalpladen. Skub forsigtigt luften ud mellem lagene.
- Spejlvend PDMS/glass slide-samlingen, så PDMS vender mod glasvinduet. Overlapper PDMS-kanalindgangene med gennemhullerne i metalpladen.
- Placer trykpladen ovenpå og stram skruerne.
- Placer den samlede flowcelle under mikroskopet. Indstil mikroskopforstørrelsen til 60X, og forjuster kanalpositionerne.
3. Forbered Log Fase Bakterier
- Dagen før eksperimentet: Pod 50 ml Mueller Hinton bouillon indeholdende 2% NaCl (MH2) med en bakteriekoloni. Ryst ved 250 omdrejninger natten over ved 37 °C.
En eller to bakteriestammer kan studeres i et eksperiment for den beskrevne opsætning. - Før forsøget blandes 50 μl bakteriekultur natten over i 50 ml MH2-medier. Ryst ved 250 omdrejninger i minuttet i 3 timer ved 37 °C for at sikre, at bakterierne er i logfasen.
4. Varm de eksperimentelle løsningskomponenter mindst 10 minutter, før de er nødvendige
- Fluorescerende farvestof (5 mM bestand) og lysostaphin (10 μg/ml lager) op ved stuetemperatur.
- Varm oxacillinpulveret til stuetemperatur.
5. Forbered og læs bakteriel suspension
- Efter afslutningen af 3 timers subkultur: Tag 10 ml bakteriekultur og centrifuge ved 1.650 x g i 2 min.
- De supernatant- og genanvendelige bakterier fjernes i 1 ml friske MH2-medier.
- Fastgør en kort slange til en 1 ml Luer-låsesprøjte. Skyl sprøjteslangen med 1 ml medier. Efterlad en lille smule medier i slangen for at undgå luftbobler, når du trækker i bakteriel suspension.
- 0,7 ml bakterietype 1 indlæses i sprøjten. Fyld to kanaler i flowcellen med bakterietype 1. Hold øje med væsken, der skal vises på den anden side af kanalen efter ca. 150 μl.
Gennemsigtigheden af kanalen ændringer, da det er fyldt med bakterier. - Hvis du eksperimenterer med flere bakterietyper, skal du gentage belastningsproceduren for bakterietype 2 i de to resterende kanaler i flowcellen.
- Flowcellen anbringes i inkubatoren ved 37 °C i 45 minutter, så bakteriel bundfældning og fastgørelse på diasoverfladen kan sættes i.
6. Forbered og indlæs de eksperimentelle løsninger
- Der fremstilles 140 μl 0,5 mM fluorescerende farvestofopløsning ved at blande 14 μl fluorescerende farvestof (5 mM) og 126 μl MH2-medier.
- 10 mg oxacillin fortyndes i 40 ml MH2-medier for at opnå en endelig koncentration på 250 μg/ml oxacillin.
- Der fremstilles 130 ml kontrolopløsning med endelige koncentrationer på 0,25 μM fluorescerende farvestof og 0,7 ng/ml lysostaphin. For at gøre dette blandes 65 μl fluorescerende farvestof (0,5 mM), 9,12 μl lysostaphinbestand (10 μg/ml) og 130 ml MH2-medier.
- Der fremstilles 130 ml antibiotisk opløsning med endelige koncentrationer på 0,25 μM fluorescerende farvestof, 0,7 ng/ml lysostaphin og 50 μg/ml oxacillin. For at gøre dette blandes 65 μl fluorescerende farvestof (0,5 mM), 9,12 μl lysostaphinbestand (10 μg/ml), 26 ml oxacillin (250 μg/ml) og 104 ml MH2-medier.
- Fyld to 60 ml sprøjter med kontrolopløsning og to 60 ml sprøjter med antibiotisk opløsning. Opbevar opløsninger indpakket i aluminiumsfolie for at undgå let induceret nedbrydning af reagenserne.
Overfyld sprøjterne for at tage højde for tab på grund af skylning af slangen. - Fjern luftbobler fra sprøjterne ved at svirpe. Fastgør og fyld inputrør til spidsen med den eksperimentelle opløsning.
- Monter sprøjter på pumpen. Placer sprøjten med det mindste volumen først, og lås derefter stemplets position. Sæt resten af sprøjterne på pumpen, og klem deres stempler efter behov.
- Pumpens hastighed indstilles til 1 ml/min. og pumpevolumenet til 60 ml. Skyl med pumpen, indtil der ses en jævn strøm af væske fra alle sprøjter.
7. Opsæt flowcellen under mikroskopet
- Flowcellen fjernes fra centrifuge og monteres på mikroskopstadiet (Figur 3).
- Tilslut input/output-slange til hver af flowcellekanalerne (en indgang/en udgang pr. kanal).
Indsamling af output i fire forskellige beholdere gør det muligt at måle individuelle kanaloutputmængder.
8. Kør 60 minutters eksperiment
- Kontroller de forudindstillede positioner fra trin 2.5. Hvis mikroskopfeltet ikke er centreret om kanalen og/eller er ude af fokus, skal du justere indstillingerne og gemme de nye positioner.
Præcis fokusering er muligvis ikke mulig før flowstart på grund af den høje tæthed af indlæste bakterier. - Indstil fasekontrastopsamlingstiden til 10 msec og fluorescenserhvervelsestiden til 1.600 msec.
- Anskaf fasekontrast- og fluorescensbilleder for hver position, før strømmen påbegyndes.
Dette giver et kvalitativt skøn over den indlæste bakterietæthed. - Start væskestrømmen og kontroller straks, at mikroskopet er fokuseret på bunden af kanalerne.
- Tag fasekontrast og fluorescensbilleder af målområderne inden for det første minut af flowet.
- Erhverve billeder hver 2 min efter det første sæt af billeder, indtil 60 minutters flow har fundet sted. Fokuser igen efter behov.
9. Desinficere flowcellen
- Lav en 10% blegemiddelopløsning i et bægerglas (100 ml). Fyld 4 x 20 ml sprøjter med 10 ml af blandingen. Debubble sprøjterne og fastgør dem til flowcellen.
Det vil tage ~ 1-2 min for kanalerne at være fri for bakterier. - Pumpens hastighed indstilles til 1 ml/min., og pumpevolumenet indstilles til 3 ml. Løb i 3 min.
- Fyld 4 x 60 ml sprøjter med 60 ml DI-vand. Debubble sprøjterne og fastgør dem til flowcellen.
- Pumpens hastighed indstilles til 1 ml/min. og pumpevolumenet til 30 ml. Løb i 30 min.
- Overvåg kanalrensningen under mikroskopet.
- Demontere flowcellen. Kassér det brugte epoxydias. Gennemblød flowcellekomponenterne i DI-vand i 20 min. Lufttørre.
10. Analyser billeder, og generer data
- Tæl antallet af bakterier i hvert billede.
Den åbne adgang software, CellProfiler bruges til at udføre batch billedbehandling16. En disposition på højt niveau af CellProfiler-rutinen er opsummeret i tabel 1. Antallet af bakterier, der er til stede i fasekontrastbilledet (Np), giver det samlede bakterietal. Antallet af bakterier, der er synlige i fluorescensbilledet (Nf), giver antallet af døde bakterier. - Beregn den normaliserede bakteriecelledødsprocent som en funktion af tiden.
- Importer Nf og Np for individuelle billeder til dataanalysesoftwaren.
- Den brøkdel af døde bakterier i hver kanal beregnes på et bestemt tidspunkt, der er angivet af fraktionen (Nf / Np) ved t = T.
- Træk den fraktion af døde bakterier, der var til stede ved forsøgets indtraf (t = 1 min.) fra for både kontrol- og forsøgskanalerne.
- Træk den fraktion af døde bakterier, der er til stede i kontrolkanalen, fra den, der findes i forsøgskanalen på hvert tidspunkt, med følgende ligning:
- Graf DPnorm vs t for løbet af eksperimentet.
Bemærk, at en prøve med en celledødsprocent på over 1% anses for modtagelig, mens mindre end 0,5% død er tegn på resistens. Procenter, der falder mellem disse to afskæringer, betragtes som ubestemte, og prøven skal testes igen. - Brug et regneark til at opsummere og analysere resultater fra forskellige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De data, der præsenteres i figur 4, viser reaktionen fra en modtagelig Staphylococcus aureus-stamme over tid i en antibiotisk-holdige mikrofluidic kanal. Fasekontrastbilleder, der er erhvervet på 1 min. og i slutningen af 1 time-eksperimentet, er vist i figur 4A og B. De analyserede 1 time data er vist i figur 4C med bakterierne fremhævet med rødt (5.828 i alt). Tilsvarende fluorescensbilleder er vist i figur 4D og E. De analyserede 1 time data er vist i figur 4F med fluorescerende bakterier fremhævet med rødt (174 døde).
Dette sæt billeder illustrerer flere punkter. Vigtigst af alt observeres en betydelig stigning i antallet af fluorescerende bakterier ved forsøgets afslutning (sammenlign antallet af lyse lysstofrør ved 1 min. og 60 min. i figur 4D og E), hvilket indikerer celledød inde i kanalen. Disse resultater er tegn på en modtagelig stamme.
Et andet vigtigt punkt at bemærke er nødvendigheden af de normaliseringer, der anvendes i ligningen ovenfor. På grund af den stokastiske nonuniformitet af individuelle epoxydiasbelægninger kan der være bakterielt celletab under hele forsøget under vedvarende forskydningstryk (sammenlign figur 4A og B). For at tage højde for denne variation normaliseres hvert fluorescensbillede af en død cellepopulation med det coacquired fasekontrastbillede, der giver den samlede cellepopulation på samme tidspunkt (inden for 1 sek.).
Endnu en normalisering sker ved at trække den normaliserede fluorescens ved forsøgets begyndelse (t = 1 min. ) fra alle andre tidspunkter (t = T). Den døde celle fluorescens på 1 min svarer til celledød før begyndelsen af forsøget. Høj fluorescens observeret i begyndelsen af eksperimentet for enten MSSA eller MRSA indikerer normalt en dårlig tilstand af bakteriekulturen. I sjældne tilfælde repræsenterer det forurening af PDMS-diaset.
Insets på de nederste hjørner af billederne er forstørrede versioner af de boksede billedområder fra både de rå og analyserede billeder. Disse udvidelser viser, at vores tællealgoritme er mere vellykket til nøjagtigt at tælle individuelle bakterier i fluorescensbilleder end i tætbefolkede fasekontrastbilleder.
Den døde celleplet giver en høj fluorescens kontrast for individuelle døde bakterier. Da antallet af fluorescerende bakterier sjældent overstiger 5% af det samlede antal, er hver bakterie meget lys sammenlignet med baggrunden. Af denne grund kan de fluorescerende bakterier let tælles med en høj grad af nøjagtighed. På den anden side er bakterier tæt pakket på fasekontrastbilledet. Desuden er fasekontrasten i en bakterie ikke altid ensartet. Disse to faktorer udgør en udfordring for en tællealgoritme, da den er afhængig af tærskelværdi for forskellige områder baseret på deres omtrentlige størrelsesintervaller og intensiteter.
For at sammenligne eksperimentelle resultater er det derfor nødvendigt at bruge den samme tællealgoritme med de samme parametre gennem forskellige eksperimenter. Det er værd at bemærke, at der på grund af det lave antal fluorescenstællinger er en højere følsomhed over for fluorescensfejl; derfor er det vigtigere at tælle fluorescensbillederne nøjagtigt end fasekontrastbillederne.
Endelig er MSSA- og MRSA-data, der er normaliseret i henhold til ovenstående ligning, vist i figur 5 for tre forskellige eksperimenter. Som forventet for resistente stammer er den normaliserede celledød lav i størrelse (<0,5%) og ændrer sig ikke i løbet af eksperimentet. Modtagelige stammer viser en støt stigning i celledød og en højere værdi ved forsøgets afslutning (>1%). Indledningen af celledød for modtagelige stammer varierer lidt mellem eksperimenter, men forbliver normalt mellem 10-30 min.
Figur 1. Et fotografi, der viser geometrierne og størrelserne af de mikrofluidiske kanaler i PDMS-laget. De smalle dele af kanalerne er 3,7 cm lange, 200 μm høje og 400 μm brede.
Figur 2. En CAD-model, der illustrerer hver af flowcellekomponenterne og deres relative positioner.
Figur 3. Et fotografi, der viser den eksperimentelle opsætning af mikroskopet og sprøjtepumpen.
Figur 4. Fasekontrast (A-C) og fluorescensbilleder (D-F) for en repræsentativ MSSA-stamme i en antibiotisk indeholder kanal. Indsat viser forstørrede billeder af de indrammede områder. Mikroskop billeder blev erhvervet ved 60X forstørrelse. Klik her for at se større billede.
Figur 5. En graf, der viser normaliserede celledødsprocenter i forhold til tid. Hver af MSSA- og MRSA-stammerne blev testet i tre separate forsøg.
Tabel 1. CellProfiler rutinekomponenter til automatiseret bakterietælling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede protokol blev valideret og optimeret i et sæt eksperimenter med methicillin-følsomme og methicillin-resistente Staphylococcus aureus stammer10. Derfor bør denne protokol uden ændringer være direkte anvendelig for andre stammer af S. aureus og andre antibiotika med virkningsmekanismer, der påvirker bakteriecellevæggens biosyntese. Andre bakterietyper end S. aureus kan kræve variation i stressparametrene: opløselige (enzymatiske) og mekaniske belastninger. Hvis der ønskes opløselige stressfaktorer ved testning af andre bakteriearter end Staphylococcus, vil der være behov for et andet stressmiddel, da lysostaphin er et stafylokok-specifikt enzym.
Mængden af forskydningsbelastning er proportional med væskens strømningshastighed og omvendt proportional med kanalens størrelse, derfor kan den i princippet varieres inden for et stort værdiområde. De opnåede stressværdier er begrænset af følgende eksperimentelle faktorer: immobiliseringssubstratets evne til at holde bakterier på plads under højere strømningshastigheder, den mikrofluidiske samling opretholder højt tryk uden at lække, væskestrømsmodstanden inde i systemet, hvilket kan gøre strømningshastigheden ustabil eller endda stoppe den ved lavere strømningshastigheder. Bindingens styrke var tilstrækkelig til S. aureus-forsøgene, men en stigning i strømningshastigheden eller ændringen af bakteriearter kan kræve en anden belægningstype. De epoxybelagte dias bruges traditionelt til proteinmikroarrayanalyse og er ikke specielt designet til at rumme store cellulære objekter. Da formuleringen og tætheden af belægningen er proprietær, er udvikling af alternative formuleringer med den kontrollerede overfladebelægningsaflejring meget ønskelig.
Vi har for nylig konstateret, at den tid, der kræves til bakteriel dyrkning og fastgørelse kan reduceres kraftigt. Kolonier kan dyrkes til at logge fase direkte fra en agar plade i en lille mængde medier inden for tre timer, fjerne natten kultur skridt. Derudover kan fastgørelse fremskyndes ved at centrifugere bakterierne inde i flowcellen i et minut og fjerne 45 minutters afregningstid. Eksperimenter i vores laboratorium køres i øjeblikket med denne forkortede protokol.
Selv om protokollen er specielt designet til antibiotika rettet mod bakteriel cellevæg biosyntese, nylige undersøgelser viser, at antibiotika med forskellige primære mål i bakterieceller aktivere den samme nedstrøms bakteriel respons veje17,18. Derfor kan vores metode være anvendelig til hurtig identifikation af modtagelighed for antibiotika, der er målrettet biosyntetiske veje, der ikke er relateret til cellevægbiosyntese, og indledende undersøgelser i vores laboratorium giver tiltro til denne hypotese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den mikrofluidiske metode er patentanmeldt: Sauer-Budge A, Sharon A, Kalashnikov M, Wirz H, opfindere; Metode og anordning til hurtig påvisning af bakteriel antibiotikaresistens/modtagelighedspatent PCT/US10/33523.
Acknowledgments
Vi takker ingeniører og studerende på Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. For at hjælpe med design, bearbejdning og automatisering af det eksperimentelle system takker vi Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin og Dr. Sudong Shu. Vi takker Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu og Katarzyna Kuliga for hjælp til at teste eksperimentelle protokoller og dataindsamling. Vi anerkender Dr. Anne E. Carpenter og Mark-Anthony Bray fra Imaging Platform på Broad Institute of Harvard og MIT for at få hjælp til udvikling af billedanalyserutinen i CellProfiler. Det beskrevne projekt blev delvist støttet af Awards R21AI079474 og 1R01AI101446 fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases eller National Institutes of Health. Projektet blev også støttet af Fraunhofer USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | Dead cell fluorescence stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | Used for lysostaphin storage |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | Used for lysostaphin storage |
| Lysostaphin | Cell Sciences | CRL309A | Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml lysostaphin for storage |
| Oxacillin salt | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | Antibiotic |
| Mueller Hinton Broth | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving |
| 1 ml, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 309653 - 60 mL | Overfill to ~65 ml |
| Microscope | |||
| Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, Fluorescence/Phase contrast objective | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12-bit monochrome CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| Microscope automation | |||
| Shutters phase contrast/fluorescence | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| Focus motor | PRIOR Scientific | H122 | |
| Joystick for XYZ control | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscan Controller | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| Image Acquisition Software | Fraunhofer CMI | ||
| Flow Cell Assembly and PDMS | |||
| Flow Cell | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI |
| Glass window | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| Sealing plate | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| Epoxide glass slide | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS master | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine) |
| PDMS slide design | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| Tubing | |||
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green | IDEX Health Science | M-644-03 | Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule |
| Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black | IDEX Health Science | M-657 | |
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural | IDEX Health Science | P-255 | |
| Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow | IDEX Health Science | P-259 | Fits Luer-lock adapter |
| Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green | IDEX Health Science | 1520G | |
| Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red | IDEX Health Science | P-658 |
References
- Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Cao, J., et al. Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles. Lab Chip. 12, 474-484 (2012).
- Chen, C. H., et al. Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels. Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).
- Churski, K., et al. Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system. Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).
- Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).
- Kim, K. P., et al. In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device. Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).
- Peitz, I., van Leeuwen, R. Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis. Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).
- Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus. Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).
- Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin. J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).
- Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).
- Koch, A. L. Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research. Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell. 130, 797-810 (2007).
