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Immunology and Infection

Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

Published: October 11, 2013 doi: 10.3791/50830
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 4
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Global Health and Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine and Dentistry, University of Rochester

Summary

Newcastle Disease Virus (NDV) wurde ausgiebig in den letzten Jahren, um neue Vektoren für Impfung und Therapie zu entwickeln, unter anderem untersucht. Diese Studien wurden durch Techniken, um rekombinante Virus aus cDNA zu retten, wie die, die wir hier beschreiben, möglich.

Abstract

Newcastle-Disease-Virus (NDV), dem Prototyp Mitglied der Avulavirus Gattung der Familie Paramyxoviridae 1, ist ein nicht-segmentierten Negativ-Sense-Einzelstrang, umhülltes RNA-Virus (Abbildung 1) mit potentiellen Anwendungen als Vektor zur Impfung und Behandlung von menschlichen Krankheiten. In eingehende Erforschung dieser Anwendungen hat erst nach der Gründung der reversen Genetik Techniken, um rekombinante Viren aus Plasmiden ihre vollständige Genome als cDNA 2-5 kodiert möglich zu retten. Virale cDNA bequem in vitro unter Verwendung von Standard-Klonierungsverfahren, um den Genotyp des Virus zu verändern und / oder neue Transkriptionseinheiten modifiziert werden. Rettung von genetisch modifizierten Viren stellt ein wertvolles Werkzeug, um Faktoren, die mehrere Stadien der Infektion, sowie ermöglicht die Entwicklung und Verbesserung von Vektoren für die Expression von Antigenen und Liefer verstehenImpfung und Therapie. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Rettung von rekombinanten NDVs.

Introduction

Newcastle Disease Virus (NDV), ein Vogel-Paramyxovirus zu der Gattung Avulavirus 1 gehört, ist eine wirtschaftlich relevante und damit weit erforscht und überwachten Zoonoseerreger, die schwerwiegende Auswirkungen auf die Geflügelzucht in der ganzen Welt. Obwohl nicht ein menschlicher Krankheitserreger, NDV wurde auch gründlich über den Tierarzt Feld sowohl als Modell Paramyxovirus und aufgrund seiner höchst interessanten, Natur onkolytischen Eigenschaften 6 untersucht. Forschung auf NDV stark von der Entwicklung der Techniken reverser Genetik für einzelsträngige, nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Viren, zunächst für Tollwutvirus von Conzelmann und coleagues 2 beschrieben profitiert. Eine Vielzahl von gentechnisch veränderten NDVs, Trage fremde Gene oder Änderungen ihrer Wildtyp-Genoms wurden weitgehend seit sucht. Die Arbeit mit diesen rekombinanten Viren war entscheidend für verschiedene Virulenzfaktoren nicht nur von NDV, sondern auch von anderen relevanten huma charakterisierenn Krankheitserreger wie Influenza-A-Virus 7 - oder 8 emergent Nipah-Virus. Weiterhin wurden eine Reihe von verschiedenen Studien die Verwendung dieser Techniken, um die Antitumoraktivität von angeborenen NDV 6,9,10 verbessern, vor allem durch die Verstärkung der immunstimulierenden Eigenschaften des Virus untersucht. Andere relevante Bereich der Forschung auf rekombinante NDVs war die Erzeugung von Impfstoffkandidaten gegen andere Viruserkrankungen, wie Influenza 5,11,12, 13 HIV, Masern 14, SARS 15 oder die durch die Atem sincytial Virus (RSV) 16 verursacht wird. Unter den verschiedenen bemerkenswerten Vorteile, die durch NDV bereitgestellt sind der Mangel an bereits existierenden Immunität in menschlichen Populationen, die Stabilität der fremden genetischen Einsätze, einen rekombinatorischen Mangel an Aktivität und einer hohen Gesamtwirkungsprofil in Kombination mit den zuvor genannten natürlichen immunstimulierenden Eigenschaften 17. Es ist auch bemerkenswert, die mögliche Verwendung von rekombinanten Impfstoffen in bivalenten poultry, Schutz sowohl gegen NDV und hochpathogene aviäre Influenzaviren 11,12. Dies kann eine hervorragende Möglichkeit, um die Chancen des letzteren Verbreitung von wild bis domestizierte Tiere, also auch helfen, eine mögliche interspezifische Sprung der gefürchteten Vogelgrippe auf den Menschen zu verhindern, zu verringern. Schließlich Reportergen exprimierenden NDV Zur Beurteilung der angeborenen Immunantwort sowie der Identifizierung von Interferon-Antagonist durch mehrere Viren codiert 18-27 verwendet.

Das Rettungsverfahren eines rekombinanten, nicht-segmentierten, besteht Negativstrang-RNA-Virus im wesentlichen zu erzwingen künstlich einen viralen Replikationszyklus in einer erzeugenden Zelle durch Transfektion von cDNA, die die minimale infektiöse molekulare Maschinerie, wie Ribonukleoprotein oder RNP bekannt (Fig. 2) codiert. Die RNPs aus der viralen Polymerase (P-und L-Proteine), das Nucleoprotein (NP) und das Volllängen-antigenomischen RNA des Virus. Diese RNA + Anti ist thzur Erzeugung der komplementären RNA-Genomen, die auch mit dem Rest der Proteine ​​der viralen RNP erforderliche zugehörigen E-Vorlage, rekapituliert die gleiche Infektionskomplex eine natürliche Virus würde auf das Zytoplasma der Zelle nach der Infektion (Fig. 2A frei ). Von diesem Schritt ab, kann das virale Zyklus selbst fort und rekombinanten Virionen enkapsidieren die modifizierten Genom, erzeugt (Fig. 2B). Bemerkenswert ist, Transfektion der genomischen cDNA anstelle der cDNA antigenomische stark beeinträchtigt oder ganz abschafft Rettungs Effizienz 2,28-30. Selbst wenn antigenomischen cDNA transfiziert ist die Effizienz der Einkapselung der rekombinanten RNA in RNPs in transfizierten Zellen vermutlich sehr gering. Dadurch Rettungs Protokolle für NDV umfassen häufig verschiedene Schritte zur Amplifikation der wenigen Viruspartikel von den ursprünglich transfizierten Zellen durch Co-Kultivierung mit ihnen permissiven Zellen und / oder das freiInfektion von bebrüteten Eiern.

Vor der Rettungs kann die cDNA durch Standard Klonierungsverfahren, um die gewünschten Änderungen erzeugen manipuliert werden. Während spezifische Mutationen der verschiedenen Genprodukte und regulatorischen Sequenzen des Virus kann ohne weiteres auf diese Weise erreicht werden kann, hat viele der veröffentlichten Arbeiten mit rekombinanten NDV das Hinzufügen einer neuen Transkriptionseinheit in das NDV-Genoms erforderlich ist. Wie andere Mitglieder der Familie der Paramyxoviren, kodiert die NDV Genom acht verschiedene Proteine ​​in sechs Transkriptionseinheiten, die differentiell exprimiert werden je nach ihrer Lage in Bezug auf das 3'-Ende in einer abnehmenden Gradienten kritisch für den viralen Lebenszyklus ein. Aus diesem Grund muss die Lage des neuen Transkriptionseinheit, innerhalb des Genoms sorgfältig ausgewählt werden, um ein Gleichgewicht zwischen der Expression des Transgens und die Beeinträchtigung der viralen Replikation zu erreichen. Einsetzen zwischen P-und M-Gene verwendet wurde den meisten, though anderen Websites wurden ebenfalls getestet 13,31.

Was auch immer der Einsatz, die Klonierung in NDV cDNA muss einige Regeln zu befolgen, um eine rescuable Konstrukt zu generieren: (i) ein neues Gen in das Genom NDV aufgenommen werden muss unter der Kontrolle der entsprechenden Signale für die virale RNA-abhängigen RNA-sein Polymerase. Diese Sequenzen sind stromaufwärts des neuen offenen Leserahmen (ORF) zugegeben werden, so kann die Polymerase das Ende der vorherigen Gen (GE) und dem Beginn des neuen Transgen (GS) zu erkennen, um ein einziges Nukleotid intergenischen Sequenz (IG) beabstandet . Zugabe eines gültigen Kozak (K)-Sequenz an eukaryontische Ribosomen Übersetzung zu verbessern, wird auch eine bessere Fremdproteinexpression 32 empfohlen, (ii) eine effiziente Replikation von NDV, wie für die meisten Mitglieder der Familie Paramyxoviridae, ist abhängig von der Genomlänge, die ein mehr von sechs 33, daher das Einstecken in die NDV hat, um dieses "rule of six" zu folgen. Wenn nötig, required zusätzliche Nukleotide stromabwärts des ORF neue hinzugefügt werden, und (iii) die Sequenz des Transgens überprüft werden, um zu finden möglich GE und GS wie Rettungssequenzen, die Effizienz, die Transgen-Expression und / oder die Lebensfähigkeit des Virus beeinträchtigt. Falls vorhanden, müssen diese Sequenzen durch stille Mutagenese entfernt werden. Die Erzeugung von rekombinanten cDNA voller Länge folgenden genannten Regeln ist der erste Schritt, um effizient zu produzieren, eine genetisch modifizierte NDV wie hier beschrieben.

In dem System sind alle DNA-Konstrukte unter der Kontrolle des T7-RNA-Polymerase-Promotor (Fig. 3). Das Zytoplasma-Polymerase in trans durch Koinfektion mit einem rekombinanten Vaccinia Ankara Virus verändert (MVA-T7) 34 vorgesehen. 3A zeigen die pNDV-B1 Plasmid, das in voller Länge cDNA antigenomische 5 kodiert. 3B zeigt pTM1 Plasmide NP kodiert, P und L ORFs. Plasmide pCITE-GFP, die codiert, under der T7-Promotor, dem Green Fluorescent Protein (GFP) und GFP pCAGGS 18, die die gleiche ORF unter dem Huhn beta-Aktin-Promotor 35 kodiert werden als Kontrollen verwendet. In diesem Protokoll zeigen wir das Verfahren zur rekombinanten NDV aus der cDNA der lentogenen NDV-Stamm Hitchner B1 5 (Abbildung 4) zu retten.

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Protocol

1. Herstellung von Säugerzellen (4A, Tag 1)

Split HEp-2-Zellen oder A549 am Tag vor der Transfektion in 6-Well-Platten. Dichte der Zellen sollte 80-90% Konfluenz am nächsten Tag zu erreichen. Normalerweise kann eine konfluente 100-mm-Schale in 8 Vertiefungen aufgeteilt werden (ca. 1 x 10 6 Zellen pro Vertiefung). Für jedes Virus, gerettet zu werden, sollte 2-4 verschiedenen Vertiefungen enthalten sein, sowie 2 zusätzliche Bohrungen für die Kontrollen pCAGGS-GFP und GFP-pCITE 18, zielte darauf ab, Transfektion und MVA-T7-Infektion Effizienz zu überwachen sind.

2. Infektion von Säugerzellen mit dem rekombinanten Modified Vaccinia Ankara Virus, das Bakteriophagen T7 RNA-Polymerase (MVA-T7) (4A, Tag 2)

  1. Wärm dich PBS 1x/BA/PS und Medien bei 37 ° C
  2. Zellen zu waschen, zweimal mit 1 ml PBS 1x/BA/PS.
  3. Infizieren die kultivierten Säugerzellen, die mit dem MVA-T7-Virus mit einer Multiplizität der Infektion (moi) Von 1 pfu / Zelle in einem Gesamtvolumen von 200 ul in PBS / BA / PS für 1 h bei Raumtemperatur.
  4. Während der Virusinfektion Inkubationszeit, bereiten Sie die Transfektion Mischung wie in 3 beschrieben.

3. Transfektion von Säugerzellen (4A, Tag 2)

  1. Herstellung von Lipofectamine: Mix 1-2 ug LPF2000 mit 250 ul pro OptiMEM Rettungsversuch und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
  2. Herstellung von DNA: Machen Sie eine Plasmid-Cocktail für jeden Rettungs in 50 ul OptiMEM. Hinzufügen von 0,4 ug pTM1-NP, 0,2 ug pTM1-P und 0,2 ug pTM1-L pro Röhrchen. 1 &mgr; g Volllängen-cDNA-Klon von NDV zu jedem Röhrchen gerettet werden. Auch bereiten zwei Kontrolltransfektionen, eines mit 2 ug pCAGGS-GFP (Transfektion Effizienz zu prüfen) und das andere mit 2 ug pCITE-GFP (um zu prüfen, T7-Polymerase angetrieben Expression durch die MVA-T7).
  3. Nachdem die LPF2000-OptiMEM Lösung wurde für 5 min (Schritt 3.1) vorinkubiert worden, fügen Sie 250ul der Lösung mit den DNA-Rohre (Schritt 3.2) und Inkubation für 20-30 Minuten bei Raumtemperatur.
  4. Nach Inkubation mit MVA-T7, entfernen Sie den Virus-Inokulum durch Aspiration und ersetzen mit der DNA-Transfektion LPF2000 Mix (Schritt 3.3).
  5. 1 ml DMEM-10% FBS / PS zu jeder Schale.
  6. Die infizierten / transfizierten Zellen für 6-8 Stunden (oder über Nacht) bei 37 ° C, 5% CO 2 und ersetzen Sie dann die Medien-Transfektion mit 1,5 ml frischem DMEM 10% FBS / PS.
  7. Bei 24 Stunden nach der Transfektion können Steuerbohrungen unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um die Transfektionseffizienz (pCAGGS-GFP) und T7-Polymerase-Aktivität (pCITE-GFP) (5A) zu beurteilen. Fahren Sie mit der Co-Kultur der infizierten / transfizierten Zellen mit Vogelgrippe Fibroblasten wie unten beschrieben.

4. Co-Kultur von Säugerzellen mit Vogelzellen (4A, Tag 3)

Üblicherweise wird eine konfluente 100 mm Gewebekulturschale von Huhn (CEF) or Ente (DEF) Embryo-Fibroblasten pro zwei transfiziert Brunnen verwendet. Achten Sie darauf vorbereiten, im Voraus, genug 100 mm Gewebekulturschalen der aviären Zellen pro aller Rettungsversuche. Für eine effiziente Rettung des Virus wird DMEM 10% FBS / PS-Medien mit 5% Allantoisflüssigkeit und 30 mM MgCl 2 ergänzt. An dieser Stelle, 24 Stunden pi, Säugetierzellen kann beginnen, welche zytopathischen Effekt (CPE) durch MVA-T7-Infektion, asevident in 5A.

  1. Wärm dich 1x PBS und Medien bis 37 ° C
  2. Säugetierzellen zu waschen, 2x mit 1 ml PBS 1x.
  3. Trypsinize Säugerzellen mit 0,2 ml Trypsin-EDTA, bis sie gelöst wird. Resuspendieren der Zellen in 1 ml DMEM-10% FBS / PS, 5% Allantoisflüssigkeit, 30 mM MgCl 2 und in einen 100-mm-Gewebekulturschale. 3 ml gleichen Medien.
  4. Vogelzellen waschen, zweimal, mit 4 ml PBS 1x.
  5. Trypsinize aviären Zellen mit 1 ml Trypsin-EDTA und Inkubation für 1-2 min bei 37 ° C, bis die Zellen zu lösen. Resuspendieren the Zellen Zugabe von 8 ml DMEM-10% FBS / PS, 5% Allantoisflüssigkeit, 30 mM MgCl 2 und 4 ml der Zellen mit Trypsin behandelt, um die Säugetierzellen in der co-kultivierten 100-mm-Gewebekulturschale mit einem Volumen von 8 ml (4 ml von Säugetieren, 4 ml Vogelzellen).
  6. Schütteln Sie von Hand die co-kultivierten Zellen in der 100-mm-Schale, um eine gleichmäßige Verteilung zu haben und dann legen Sie sie in den Brutschrank bei 37 ° C für 3-4 Tage. Die Kriterien für die Infektion von Eiern 3 oder 4 Tage nach der Co-Kultivierung von Säugetier-und Vogelzellen abhängt, wie viel zytopathischen Effekt (Zellabrundung, Tod, Ablösen von der Oberfläche, usw..) In dem MVA-T7 Virusinfektion beobachtet.

5. Die Infektion von Hühner befruchteten Eiern (Abbildung 4A, Tag 6-7)

  1. Nach 3-4 Tagen der Co-Kultur von Säugetier-und Vogelzellen, entfernen, 1 ml des Zellkulturüberstands entnommen und in ein Eppendorf-Röhrchen.
  2. Zentrifugieren der Gewebekulturüberstand für 1 min bei 12.000 rpm in einer TischZentrifuge, um Zelltrümmer zu entfernen.
  3. Candle die Eier mit einem Licht-Durchleuchtungsfeld, um die Schnittstelle zwischen dem Luftsack und die Allantoishöhle sehen. Machen Sie eine Markierung auf die Schnittstelle Grenze Vermeidung Blutgefäß-Lokalisierung. Spray 70% Ethanol über die Eier, um sterile Bedingungen zu schaffen. Ein Loch in der Eierschale leicht machen auf die markierte Stelle und impfen 500 ul des Überstandes mit einer Insulin (1 ml) Spritze, mit dem Ziel die Nadel vertikal und direkt in die Allantoishöhle. (Abbildung 4B).
  4. Verschließen Sie den nick in der Eierschale mit geschmolzenem Wachs oder Paraffin.
  5. Die Eier inkubieren 2-3 Tage bei 37 ° C.

6. Ernte der Allantoisflüssigkeit von infizierten Huhn befruchteten Eiern (Abbildung 4A, Tage 8-10)

  1. Inkubieren Sie die infizierte Eier für 2-4 Stunden oder über Nacht bei 4 ° C, um die Hühnerembryo zu töten und das Blut gerinnen.
  2. Sprühen Sie die Eier mit 70% Ethanol (um sterile Bedingungen zu erhalten).
  3. Vorsichtig tippen Sie auf den apikalen Abschnitt des Eies, über die Lufthöhle, mit einem Löffel. Sobald die Eierschale geknackt wird, entfernen Sie die Bruchstücke mit einer Pinzette und voll setzen die Allantois-Membran.
  4. Setzen Sie die Allantoishöhle durch Ausschneiden des Allantois-Membran mit einer Pinzette und Schere, Vermeidung von Schäden an den Blutgefäßen und das Eigelb.
  5. Vorsichtig nach unten drücken, den Embryo mit einem Spatel und sammeln Sie die oben strömenden Allantoisflüssigkeit (8-12 ml pro Ei) mit einer 10 ml Pipette. Vermeiden Sie Beschädigungen des Dottermembran. Übertragung der Allantoisflüssigkeit, um ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis (Verwendung einer Röhre pro Ei).
  6. Klärung der Allantoisflüssigkeit durch Zentrifugation für 5 min bei 1500 UpM. Den Überstand in ein frisches Röhrchen, ohne das Pellet zu stören.
  7. Proben bei 4 ° C für bis zu 1 Woche, bis sie für die Überprüfung der Anwesenheit von NDV Hämagglutinations-Assay.

7. Hämagglutination (HA)-Assay

Das Vorhandensein des Virus in der allantoic Flüssigkeit aus infizierten Eiern makroskopisch durch ihre Fähigkeit, Truthahn roten Blutzellen (RBC) Hämagglutination bestimmt werden. Im Fall von NDV, sind etwa 10 6 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro ml erforderlich, um ein positives Signal in der HA-Assay zu ergeben. HA-Assays sind in V-Boden-96-Well-Platten durchgeführt. Negative (PBS 1x, nicht infizierten Allantoisflüssigkeit) als auch positive (Allantoisflüssigkeit von jedem NDV-Virus) Kontrollproben sollten immer in einer HA-Test zur Bestätigung enthalten sein. Um ein HA-Test durchzuführen:

  1. Je 50 ul PBS 1x pro Vertiefung in einer V-Boden 96-Well-Platte.
  2. Je 50 ul der Allantoisflüssigkeit Proben in die Vertiefungen in der ersten Spalte der Platte. Führen Sie 2-fach serielle Verdünnungen durch den Rest der Platte und entsorgen Sie die letzten, extra 50 ul aus Brunnen in der letzten Spalte.
  3. Geben Sie 50 ul 0,5% Puten RBC in PBS 1x pro Vertiefung. Schütteln Sie die Platte durch Antippen.
  4. Die Platte bei 4 ° C (oder Eis) foder 30-45 min oder bis eine klare Pellet wird in den Negativkontrollen gebildet.

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Representative Results

Rettung von NDV ist ein gut etabliertes Verfahren, die routinemäßig in den Laboratorien, die den Zugriff auf die vollständige cDNA des Virus durchgeführt. Die intrinsische stochastischen Natur des Verfahrens macht es jedoch schwierig, 100% Rettungseffizienz. Die Überwachung der frühen Schritte des Prozesses, speziell die Transfektionseffizienz und die Infektion mit MVA-T7, hilft, mögliche Probleme. 5A zeigt Standard-Transfektion und Transfektion / Infektion Wirkungsgrade, die genug für einen erfolgreichen Rettungs NDV sind. Nach den Amplifikationsrunden in Vogelsäugetier Co-Kulturen und befruchteten Eiern ist Gegenwart gerettet Virus durch positiven Vertiefungen im HA-Test nachgewiesen. NDV induziert Hämagglutinations indem Erythrozyten und verhindert deren Sedimentation im Boden der Vertiefung V-förmig so. Daher kann ein Mangel an HA-Aktivität leicht durch die Bildung einer roten, runden Pellet von RBC (5B) unterschieden werden. Negative Ergebnisseim HA-Test kann auf eine unzureichende Titer des Virus in der Allantoisflüssigkeit sein: mindestens Titer von etwa 10 6 pfu / ml erforderlich, um eine positive HA Ergebnis. Nieder virale Titer noch durch Immunfluoreszenztest (IFA) unter Verwendung spezifischer Anti NDV-Antikörpern nachgewiesen werden. Ein neuer Durchgang auf Eiern zur weiteren Verstärkung der in den ersten beimpften Eier vorliegenden Virus wird in diesen Fällen empfohlen.

Figur 1
Fig. 1 ist. Genome Organisation von Newcastle Disease Virus (NDV) Die nicht-segmentierten, einzelsträngigen negativen Sense-RNA-Genom des NDV ist 15.186 Nukleotiden (nt) lang und kodiert für acht verschiedene Polypeptide in sechs Transkriptionseinheiten:. NP, P, M, F, HN und L plus V-und W-Proteine, entstand nach Verschiebungen im Leserahmen des P ORF während der Transkription. Nicht-kodierende regulatorische Sequenzen flankierendas Genom in seinem 3 '(Führer) und 5' (Anhänger) endet. Weitere nicht-kodierenden Gen Ende (GE), intergenen (IG) und Gen-Start (GS)-Sequenzen regulieren die virale Polymerase-Aktivität in den verschiedenen ORFs. Expression von verschiedenen Genen auf dem viralen Genom abhängig von ihrer relativen Position in Bezug auf das 3'-Ende (dh NP-Transkripte sind die häufigsten, L Transkripte gelinde), um damit eine Steigung kritisch für den Virus-Lebenszyklus 1.

Figur 2
2. Grundlagen der NDV Rettungs von geklonten DNA. Schematischer Vergleich zwischen einem natürlichen (A) und der künstlich induzierten (B) Zyklus während der Rettungsprozess. (A) Nach dem Anbringen an die Zielzelle, das Virus in das Zytoplasma eingekapselt gibt seine genomischen Inhalt in RNPs. Die RNA-Polymerase transkribiert die RNA-Genom in den verschiedenen mRNAs der viralen Proteine ​​und in eine komplementäre, in voller Länge antigenomische RNA + Kopie, die Vorlage für die Herstellung von Mehrfachkopien des Original Genom, das in naszierende Virionen aufgenommen wird, ist. (B ) in der Rettungsverfahren werden die Komponenten der RNPs (NP, P und L-Proteine ​​sowie eine in voller Länge, in der Regel modifizierte antigenomische RNA) Transfektion von cDNA bereitgestellt. Bei der Rekonstitution der antigenomische RNPs im Zytoplasma der transfizierten Zelle, können sie die komplementäre, rekombinanten genomischen RNPs produzieren kann und eine ganze Zyklus kann dann wieder neu zu starten, endet mit der Freigabe von rekombinanten Viren.

Fig. 3
3. T7 getriebenen Expressionsplasmide zur Erzeugung von rekombinanten NDV. (A) In voller Länge viralen cDNA: The voller Länge pNDV-B1 Ampicillin-Resistenz-Plasmid die Expression der lentogenen NDV Hitchner B1-Stamm-Anti unter der T7-Promotor (P-T7) und der T7-Terminator-Sequenz (T T7), die das Hepatitis-Delta-Ribozym (HDR) Spaltung. Die pNDV-B1 wurde ursprünglich entwickelt, um ausländische Einsätze zwischen P-und M-Genen 5 tragen. Einsetzen eines neuen Gens (XbaI) erfordert die Zugabe des Regulatorgens Ende (GE), intergenischen (IG) und Gen-Start (GS)-Sequenzen seiner funktionellen Erkennung durch die virale Polymerase ermöglichen. Expressionseffizienz des Transgens kann mit der Zugabe von einer Kozak-(K)-Sequenz stromaufwärts vom Startcodon 32 verbessert werden. Die ganze Kassette in den NDV-cDNA eingeführt muss eine Gesamtzahl von Nukleotiden durch sechs teilbar haben, um die "rule of six" 33, die eine effiziente Replikation der meisten paramyxovius Genome treibt folgen (B) Protein-Expressionsplasmide:. Viral NP, P, und L ORFs, flankiertder T7-Promotor (P-T7), die UTR des Encephalomyocarditis-Virus (EMC) und der T7-Terminator (T T7)-Sequenzen wurden in das Ampicillin-Resistenz pTM1 Rückgrat 5,36 Vektor kloniert.

Fig. 4
4. Plasmid-basierte Techniken reverser Genetik für die Erzeugung von rekombinanten Newcastle Disease Virus. (A) Viral Rettungs: A549 oder HEp-2-Zellen mit dem modifizierten Vaccinia-Virus Ankara Expression des Bakteriophagen-T7-Polymerase (MVA-T7) infiziert. Nach der viralen Infektion werden die Zellen unter dem T7-Promotor co-transfiziert mit dem Expressionsplasmid für die Replikation und Transkription des viralen Genoms NDV (NP, P und L) erforderlich ist, zusammen mit dem NDV-cDNA voller Länge. Vierundzwanzig Stunden post-infection/transfection, Säugerzellen co-kultiviert mit Huhn oder Ente Embryofibroblasten (CEF undDEF, beziehungsweise). Drei bis vier Tage nach der Co-Kultur, 8-10 Tage alten embryonierten Hühnereiern mit den Gewebekulturüberständen der Co-Kultur-Zellen zur weiteren Verstärkung inokuliert. Zwei bis drei Tage nach der Inkubation der 8-10 Tage alten Eiern bei 37 ° C wird Allantoisflüssigkeit aus den Eiern geerntet und zur erfolgreichen Rettung des rekombinanten Virus durch HA-Assay analysiert. Positive (+) Rettungs Viren sind weiter auf genomische (RT-PCR) gekennzeichnet und Eiweiß (z. B. Immunfluoreszenztest (IFA) und Western-Blot (WB) Ebenen negativen (-.) HA Ergebnisse können aufgrund des Mangels an genügend Viren zu sein . durch HA Reinfektion von frischem Hühner befruchteten Eiern, das Virus zu verstärken erkannt wird angegeben (B) Infektion von Hühnern befruchteten Eiern:. 10.08 Huhn befruchteten Eier werden durchleuchtet, um die Schnittstelle zwischen Luftsack und die Allantoishöhle Marke mit Insulin. (1 ml) Spritze, die Eier mit der Gewebekulturüberstand in der Allantois cavi infiziertty, wie angegeben.

Figur 5
5. Repräsentative Ergebnisse. (A) Transfektion und MVA-T7-Infektion Effizienz: Vertreter fluoreszierend (links) und hell (rechts) Felder von A549-Zellen mit pCAGGS-GFP (oben) transfiziert oder mit MVA-T7 infiziert und mit pCITE-GFP (unten) dargestellt sind transfiziert . Konstitutive Expression von GFP pCAGGS getrieben ist ein Indikator für die Effizienz der Transfektion, während T7-Promotor angetrieben GFP-Expression von pCITE ist eine Steuerung für MVA-T7-Infektion und T7-Polymerase-Aktivität. Vorhandensein von Viruspartikeln in Allantoisflüssigkeit induziert Hämagglutination, die durch einen Mangel an Pellet in dem Boden der V-förmig dargestellt ist gut: Die Zellen wurden nach 24 h post-transfection/post-infection (B) Hämagglutinationstest (HA) abgebildet. Fehlen des Virus ermöglicht die Bildung eines roten Pellet in dem Boden der the auch. Figur zeigt sowohl die Auslösevorrichtungen für HA-Assay (negativ, sauber Allantoisflüssigkeit, positive, eine bereits dadurch NDV Probe) benötigt werden, und die Ergebnisse der drei unbekannten Proben nach einer Rettungs erhalten, mit zwei positiven (+) und eine negative (-) Ergebnis.

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Discussion

Mehrere Faktoren sind zu berücksichtigen, um gute Ergebnisse zu erzielen, während die Rettung NDV werden. Zuerst wird die Volllängen-cDNA-Konstrukt verwendet werden muss, ausgelegt werden, um die funktionelle Einbindung der neuen Transgene / Änderungen in dem NDV-Genom zu ermöglichen. Dies bedeutet, wie oben angegeben, dass (i) entsprechende Gen Ende (GE), intergenen (IG) und Gen-Start (GS)-Sequenzen hinzugefügt werden, falls erforderlich, (ii) es gibt keine mutmaßlichen GE oder GS-Sequenzen in das Fremd Gen, und (iii) die vollständige rekombinante Genom folgt der "rule of six".

Wie für den Rettungsprozess, die Qualität der Plasmid-Präparationen, die MVA-T7-Aktien sowie die ordnungsgemäße Wartung der Zellen sind kritisch. Bei den meisten Fällen ist die Standard maxiprep Reinigung der Plasmid-DNA ausreichend, obwohl schwierig Klonierung und Rettungsverfahren aufgrund der Größe oder Art der Transgene können durch Reinigung von DNA durch CsCl-Dichtegradientenzentrifugation verbessert werden. Transfektionseffizienz mit Lipofectamine reicht in der Regel für eine erfolgreiche Rettung, obwohl andere Verfahren wie Transfektion Nukleofektion können ebenfalls verwendet werden. In jedem Fall ist das Verhältnis der verschiedenen Plasmide muss streng eingehalten (0.4:0.2:0.2:1 für NP-PL-pNDV bezeichnet) werden. Aufgrund der mühsamen und irgendwie stochastischen Natur des Rettungsprozesses sollte mindestens 2-4 verschiedenen Vertiefungen pro Konstrukt transfiziert werden, gerettet werden, und verschiedene Klone der gleichen Konstrukt sollte getestet werden.

In dem Protokoll, die wir hier beschrieben haben, verwenden wir MVA-T7 in trans die T7-Polymerase die Expression der viralen cDNA-Konstrukte erforderlich ist. Zwar ist dies die Standardverfahren im Labor ist es nicht die einzig mögliche Ansatz. Zum Beispiel haben andere Gruppen erfolgreich unter Verwendung von Zelllinien, die konstitutiv hohe Mengen an T7-Polymerase 4,37 gerettet NDV und andere nicht-segmentierten Negativstrang-RNA-Viren. Die Verfügbarkeit eines rekombinanten Vektorsoder Zelllinie Codierung T7-Polymerase, sowie die spezifische Leistung der beiden Ansatz in einem bestimmten Labor, sollte bei der Gründung von neuem die Rettungssystem für NDV werden.

Nach der Bestimmung der NDV Präsenz im Allantoisflüssigkeit von HA sind weitere Studien durchgeführt, um die vollständige Charakterisierung der neu gewonnenen Virus, wie RT-PCR, gefolgt von Sequenzierung des viralen Genoms ist, IFA-und West-Blot (WB), um die Expression zu bestimmen, des Fremdgens (falls zutreffend). Abhängig von der Art der Veränderungen, die die rekombinanten Viren tragen, könnten andere Arten von biochemischen und funktionellen Assays werden ebenfalls benötigt.

Die Rettung von rekombinanten NDV aus cDNA ist eine nützliche Technik aus mehreren Gründen. Erste und offensichtlichste, bietet diese Technik mit der Fähigkeit, die Biologie von NDV, ein wirtschaftlich relevanten Virus für die aviäre Industrie, durch experimentelles Veränderung seiner Gene und regulatorische Sequenzen zu analysieren. NDV ist ein Paramyxovirus eng an menschliche Krankheitserreger wie Masern, Mumps oder Respiratory-Syncytial-Viren, sowie die aufstrebenden, hoch pathogenen Hendra-und Nipah-Viren verwandt, die Forschung auf dem Grundlebenszyklus dieser Familie von Viren ist wichtig, ihre Biologie zu verstehen. Neben der Grundlagenforschung haben rekombinanten NDVs ein großes Potenzial als Impfstoff und onkolytischen vectos, kombiniert die Möglichkeit der Durchführung foreing Gene in ihrem Genom mit einer gut beurteilt der Biosicherheit Profil. Aus all diesen Gründen kann die NDV Rettungs Protokoll ein wertvolles Gut für viele Labors weltweit interessiert Virusforschung, die Entwicklung von Impfstoffen und Krebsbehandlung.

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Disclosures

Adolfo García-Sastre ist ein Erfinder von Patenten auf rekombinanten Viren der Newcastle-Krankheit, die von der Icahn School of Medicine am Berg Sinai gehören.

Acknowledgments

Autoren möchten Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder in den Labors von Dr. danken. Peter Palese und Adolfo García-Sastre für die Entwicklung von NDV Reverse Genetik Techniken und für die technische Unterstützung. Research in Newcastle-Disease-Virus in AG-S Labor wird teilweise finanziert durch NIAD R01AI088770 gewähren und durch das Department of Homeland Security Science & Technology Center of Excellence für Schwellen-und Tierkrankheiten Zoonosen (CEEZAD, Verleihungsnummer 2010-ST-061-AG001). Forschung in der LM-S-Labor wird von den NIH RO1 Zuschüsse AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, die NIAID Centers of Excellence für Influenza-Forschung und Überwachung (HHSN266200700008C), und der University of Rochester Zentrum für Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C) gefördert .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM CORNING Cellgro 10-013-CV Any supplier
OptiMEM GIBCO 31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019
35% Bovine Albumin (BA) Sigma 232-936-2 Any supplier
Trypsin-EDTA CORNING Cellgro 25-052-CI Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x CORNING Cellgro 30-002-CI Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Any supplier

Cell lines
A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS.
Embryonated chicken eggs
Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols.
Turkey red blood cells (RBC)
Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days.
Plasmids
Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography.
Viruses
The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures.
Tissue culture media and solutions:
DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C.
10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2.6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature.
1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4 °C.

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References

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Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA. J. Vis. Exp. (80), e50830, doi:10.3791/50830 (2013).

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