Summary
Mikroinjektion är en vanlig teknik som används för att leverera DNA-konstruktioner, mRNAs, morfolino antisensoligonukleotider eller andra behandlingar in i ägg, embryon, och celler från olika arter.
Abstract
Mikroinjektion in i celler och embryon är en vanlig teknik som används för att studera en mängd olika biologiska processer. I denna metod en liten mängd behandlingslösning laddas i en mikroinjektion nål som används för att fysiskt injicera enskilda immobiliserade celler eller embryon. Trots behovet av grundutbildning för att utföra den här proceduren för hög genomströmning leverans, erbjuder mikroinjektion maximal effektivitet och reproducerbar leverans av ett brett utbud av behandlingslösningar (inklusive komplexa blandningar av prover) i celler, ägg eller embryon. Ansökan till microinjections omfattar leverans av DNA-konstruktioner, mRNA, rekombinanta proteiner, vinst på funktion, och förlust av funktions reagenser. Lysrör eller kolorimetrisk färgämne tillsätts till den injicerade lösningen för att möjliggöra omedelbar visualisering av effektiv leverans samt verktyg för tillförlitlig normalisering av beloppet för den levererade lösningen. Den beskrivna metoden möjliggör mikroinjektion 100-400 sjöborre zygotes inom 10-15 min.
Introduction
Effektiv och reproducerbar behandling leverans är en av de viktigaste metodologiska utmaningarna för forskare. Flera metoder har inrättats för att tillfälligt leverera behandlingslösningar i ägg, embryon och celler. Dessa metoder innefattar elektroporering (baserad på en genererande transienta porer i membranet med användning av korta elektriska pulser) 1,2, lipofektion (leveranstid genom fusion av behandling-innehållande liposomer med membranet) 1, mikropartikelbombardemang 1 (DNA utfälles på mikron stora metallpartiklar som sedan används för att tränga in i celler vid hög hastighet), och transduktion (viruset används som en tillförselvehikel av transgener). Just nu är mikroinjektion den enda metod som håller fördelen av att leverera en lösning med 100% effektivitet med minimal reagenser. Vidare kan en enda injektion lösning vara sammansatt av en komplex blandning av behandlingar. Denna teknik har använts för att framgångsriktly mikroinjicera ägg och embryon från många arter såsom sjöborrar 3,4, zebrafisk 5, mus 6, groda 7, och nötkreatur 8 samt enstaka celler i vävnadskultur 9. Enstaka blastomeres injektioner vid senare utvecklingsstadier har också genomförts 10-12.
De nuvarande metoderna för microinjections är baserade på tryckinjektionsmetod som ursprungligen beskrevs av Hiramoto 10, men har stora framsteg gjorts mot optimering av processen. Utmärkta mikroinjektion tekniker har beskrivits på annan plats 11, och här beskriver vi ett av de specifika metoder som idag används för att mikroinjicera sjöborre (Strongylocentrotus purpuratus) nyligen befruktade ägg. I över ett sekel har sjöborrar varit en värdefull experimentell modell 15,16. Sjöborrar är evolutionärt nära besläktade med chordates (inklusive oss) och analys avderas genom avslöjade att de innehåller alla de stora genfamiljer som det mänskliga 17. De producerar ett stort antal synkront utveckla transparenta embryon som lätt kan manipuleras. Använda sjöborre som modellorganism har sjöborre samfundet bidragit till vår förståelse av gödsling processen 18-21, cellbiologiska processer 22-24, och genen regleringsnät (GRNs) 25-28.
Mikroinjektion i sjöborre zygotes kräver flera steg. Först äggen behöver immobiliseras före injektioner (beskrivs nedan). Mikroinjektion rätter är belagda med protaminsulfat (PS), som skapar en positivt laddad yta vid vilken de negativt laddade ägg kan vidhäfta 3. Äggen dejellied genom inkubering i surt havsvatten (pH 5,15) under 10 min, följt av två tvättningar i naturligt havsvatten eller artificiellt havsvatten (pH 8,0). De dejellied äggen försiktigt rodde i en rak linjei mitten av PS belagda skålen i närvaro av 1 mM 3-aminotriazol (3-AT), som krävs för att inhibera aktiviteten av ovoperoxidase som utsöndras från kortikala granuler av ägg som ett resultat av befruktning 29. Detta steg är viktigt för att förhindra härdning av gödsling kuvertet och för att underlätta mikroinjektion nål posten. Som ett alternativ till ett mM 3-AT, kan 10 mM paraminobenzoic syra (PABA) användas. Injektionslösningen laddas i en mikroinjektion nålen med hjälp av specialiserad microloading pipettspetsen och monterade på en hållare fäst till mikromanipulator och tryckenhet (figur 1). Varje nål kan användas för att mikroinjicera enskilda zygoter i flera experiment på separata dagar. Mikroinjektion kan utföras efter 10-15 min tills zygoter hårdna. De zygoter tvättas sedan med havsvatten och odlades vid 15 ° C. När embryona når kläckning blastula skede, de släpper kläckning enzym som smälter komponenter i fertilization kuvertet 30 och tillåta dem att naturligt lossna från PS-belagda skålen. Vid behov kan embryona försiktigt loss från skålen genom att använda en mun pipett eller pasteurpipett genom att försiktigt blåsa havsvatten på embryona. Den beskrivna metoden möjliggör effektiv och tillförlitlig mikroinjektion av 100-400 nyligen befruktade ägg på en enda maträtt, som ger en hög genomströmning metod för analyser i senare led.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av protaminsulfat (PS) Bestruket Rätter
- Bered en% lösning av protaminsulfat (PS) genom att tillsätta 0,5 g av PS till 50 ml avjoniserat, destillerat vatten (DDH 2 O) i ett 50 ml koniskt rör. Skaka väl i hög hastighet på en bänk skakapparat vid rumstemperatur i 1-2 timmar för att säkerställa fullständig upplösning av PS. Denna lösning kan förvaras vid 4 ° C i minst tre månader (se till att fullständigt upplösa gelliknande fällning före varje användning) 3.
- Ta en hylsa av 60 mm x 15 mm petriskålar av polystyren och lägga ut både lock och bottnar på bänken.
- Häll 1% PS-lösning i varje skål (både bottnar och lock kan användas) precis tillräckligt för att täcka ytan, låt stå i minst 2 minuter. PS lösning överblivna kan återanvändas många gånger inom tre månader vid förvaring vid 4 ° C.
- Place PS-behandlade rätter i en bägare fylld med destillerat vatten (dH 2 O). Låt bägaren under rinnande dH 2 O i minst10 min.
- PS-belagda rätter kan användas omedelbart eller lufttorka för förvaring. Täck dem för att förhindra ansamling av damm. De kan lagras vid rumstemperatur under 1 månad 3.
2. Skaffa Sea Urchin Könsceller och Immobilisera ägg på en PS-belagd skålen för mikroinjektion
- Spawn sjöborrar genom skakning eller intracoelomic injektion av upp till 1 ml av 0,5% KCl för att inducera kontraktion av glatta muskler att släppa gameter 3 (figur 2).
- Om djuret är en hanne, såsom indikeras av den vita färgen spermier, samla spermier torr från ytan av ett djur i ett 1,5 ml rör. Torr sperma kan lagras vid 4 ° C i en vecka utan väsentlig förlust av biologisk funktion.
- Om djuret är en hona, vilket framgår av den gula färgen på grund av äggulan innehållet ägg, samla sina könsceller genom att sänka de gonopores i en bägare full med havsvatten. Äggen kommer att släppas från gonopores och slå sig ner av gravitationen. </ Li>
- Filtrera äggen från skräp som djur ryggar som använder 80 nm nylonfilter mesh. Bäst resultat uppnås om äggen används inom 5-7 timmar efter leken.
- Dejelly äggen:
- Bered 100 ml sur havsvatten under approximativt 1 ml av ägg. Använd 0,5 M citronsyra för att justera pH i havsvatten från pH 8,0 till 5.1-5.2. Alltför lite av ett pH minskar befruktning och för högt av ett pH kommer inte att tillåta äggen att fästa till PS-belagda plattor.
- Tillsätt ägg (inte mer än 1 ml) till surt havsvatten och tillåta äggen att slå sig ner på is under 10 min. Alternativt kan avlägsnandet av gelé coat underlättas genom försiktig rotering av äggen under behandlingen. Man kan på ett effektivt sätt dejelly S. purpuratus ägg i 3-4 min på detta sätt.
- Häll försiktigt av surt hav vatten, tillsätt färskt havsvatten och låt äggen slå sig ner på isen igen. Dejellied ägg kan förvaras på is i upp till 6 h utan befruktning problem
3. Rad av ägg
- Bered en M förrådslösning av 3-aminotriazol (3-AT, MW = 84,08) genom upplösning av 0,84 g av 3-AT i 10 ml DDH 2 O. Denna lösning kan förvaras vid 4 ° C i upp till 6 månader.
- Bered en mM arbetslösning av 3-AT genom att tillsätta 50 | il av 1 M stamlösning till 50 ml förkyld havsvatten. Förvara lösningen på is.
- Förbered mun pipett (Figur 3) för skonsam hantering av äggen:
- Pipettspetsen manuellt dras från glasmikropipetter (100 x OD 1,09 mm). Håll mikropipett med båda händerna över öppen eld. Eftersom glaset börjar smälta, dra försiktigt i ändarna av pipetten i motstående riktningar.
- Anslut en drog pipett till en plastslang (ID 1,14 mm), täta tätt med Parafilm. Längden på slangen bör vara ca 50-70 cm.
- Sätt i en steril filtrerad P20 eller P200 spetsen vid änden av röret som är motsatt glasröret tillanvändas som munstycket.
- Kläm fast änden av glas mikropipett med en sax för att justera diametern av spetsen. Den optimala diameter överstiger diametern hos ägg (80 | im) något.
- Häll 4 ml 1 mM 3-AT havsvatten i varje PS belagda skålen (botten eller lock).
- Ta munnen pipett, satte P20/P200 spetsen i munnen och fäst den med tänderna. För att aspirera ägg, först aspirera en liten mängd av havsvatten. Genom att ha en kolumn med vätska innan du fyller äggen, kommer man ha maximal kontroll över munnen pipetteringsteknik.
- Placera mikropipett spets nära äggen och försiktigt aspirera på flera hundra ägg i pipetten. Begränsa äggen i glasmikropipett.
- Rad dejellied ägg i en rak linje på en maträtt genom att försiktigt blåsa dem ut ur munnen pipett medan du flyttar spetsen i en rak linje. Rad äggen precis innan injektionerna, eftersom gödslings problem kan uppstå på grund av prolonged exponering för 3-AT havsvatten 3. Dessutom kan katjoniska lim som PS vara giftiga för ägg, och det är inte tillrådligt att utsätta embryon till dessa reagens under lång tid, i synnerhet om de gödslings kuverten har tagits bort.
- Gör en repa på skålen nära raden av rodde ägg med ett glas pipett. Denna skrapa kommer att vara viktigt för att bryta den injektionsnål för att justera flödet av lösningen efter behov. Alternativt kan repa göras innan häll 3-AT havsvatten till skålen.
4. Mikroinjektion av sjöborre Zygotes
- Slå på mikroinjektion station. Här beskriver vi användningen av FemtoJet insprutningssystemet.
- Dra injektions kapillärer med hjälp av en nål avdragare. Ett exempel på en bra nålen är avbildad i figur 4. Obs: För RNA injektioner, bör injektions kapillärer förbehandlas för att undvika RNAase kontamination 31:
- Placera injektions kapillärer i 50 ml konisktrör och tillsätt 50 ml filtrerad metanol / HCl (9:1). Skaka väl och låt stå över natten i högst 10 timmar.
- Häll av metanol / HCl och skölj kapillärerna 2x med filtrerad metanol i samma rör.
- Drain metanol så mycket som möjligt och lyofilisera kapillärerna över natten för att säkerställa fullständigt avlägsnande av metanol.
- Montera försiktigt nålen kapillär på en nål lasthållare och ladda den med <0.5 l av en provlösning med hjälp av microloader tips. Provlösningar innehåller vanligen 20% glycerol, beroende på det insprutade materialet 3.
- Placera skålen med rodde ägg på mikroskop scenen (ägg bör anpassas vertikalt när de betraktas genom okular) och fokusera på äggen.
- Montera försiktigt laddade nålen på nålen microinjecting hållaren och justera positionen av nålen för att få en perfekt fokuserad spets i mitten av fältet.
- Tryck ner knappen för att applicera det maximala trycket for nål rengöring. Vätska kommer ut ur nålen. Justera trycket om nödvändigt: insprutningstrycket vara i intervallet från 90 till 360 hPa, med tryckkompensation vid ungefär 1/3 av insprutningstrycket.
- Justera lösningens flöde genom att spruta in i obefruktade ägg. Med hjälp av en styrspak mikromanipulator, rikta spetsen av injektionsnålen till det obefruktade ägget. För att underlätta nål posten, skapar en lätt darrning genom försiktig knackning på scenen med ett hårt föremål, t.ex. en skruvmejsel. En injektions bolus bildas inuti ägget bör ses (Figur 5).
- Om injektions bolus inte syns något höja nålspetsen över äggen, lokalisera repa på skålen och ställ den att placeras i mitten av fältet. Knacka försiktigt på nålspetsen till scratch märket att bryta spetsen av kanylen. Justera injektion och kompensationstrycket för att säkerställa att injektions bolus inte överstiger 1/5 av tHan diameter av ägget (1-2 pm).
- När injektions bolus är kalibrerad, befrukta äggen genom att lägga utspädd sperma (1:1000) eller 1-2 l av spermier. Blanda väl försiktigt för att undvika att rubba den rad av ägg.
- Starta injektioner direkt efter befruktningen kuvertet blir synlig (Figur 5). Flytta längs linjen av rodde ägg med scenen controller och injicera så många zygotes som möjligt genom att peta dem med nålen styrs av joystick mikromanipulator.
- Efter 10-15 minuter, kommer de nyligen befruktade äggen blivit härdad och kan inte injiceras längre. Ta bort skålen från scenen och försiktigt aspirera ut spermier i 3-AT havsvatten med hjälp av en plast pasteurpipett.
- Låt inte zygotes torka. Snabbt lägga färska förkyld havsvatten för att täcka skålen. Inkubera embryon vid 15 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP och mCherry reporterkonstruktioner var in vitro-transkriberat och mikroinjiceras in i de nyligen befruktade ägg. Embryon inkuberades vid 15 ° C under 24 h (tills blastula steget) och avbildas med Zeiss Observer Z1 mikroskop. Injektion av reporterkonstruktioner ledde inte till några utvecklingsdefekter (Figur 6). För kvantifiering av fluorescerande signaler, var bildinhämtning utförs vid låg förstoring (100X) för att maximalt fånga fluorescerande pixlar (fig. 6D-F). Fluorescerande signaler kvantifierades med användning AxioVision 4.8.2.0. Standardfelen för intensiteten i den fluorescerande signaler inom populationen av 100-200 blastulae översteg inte 1,5% (data ej visade).
Figur 1. Den mikroinjektion inställningar. (A) En PS-belagd dish med immobiliserade ägg ligger på scenen av (B) ett inverterat mikroskop. Mikroinjektion nål är fäst till (C) en nålhållare som är ansluten till en (D) tryckenhet. Förflyttning i x-, y-, och z-dimensionerna är riktad med användning av (E) mikromanipulator eller (F) grov manipulator. (G) En skruvmejsel lindade med hushållspapper används för att försiktigt knacka på mikroskop scenen för att framkalla viss bävan för att underlätta nål inträde i den nyligen befruktade ägget.
Figur 2. Leken av sjöborrar. (A) Sjöborre induceras att spridas av intracoelomic injektion av 0,5% KCl. Nålen pekar mot den peristomial membran som omger mynningen hos djuret, den enda mjuka delen av djuret.(B) Kvinna sjöborre placeras med sina gonapores nedsänkta i havsvatten i en plastbägare för att samla gula ägg. (C) Vit spermier frisätts från gonapores av det manliga sjöborre.
Figur 3. . Mun pipett en mun pipett består av tre delar: (A) glasmikropipett nål, (B) plaströr, och (C) en steril filtrerad P20 eller P200 spets. Den glasmikropipett införes i plaströret som är anslutet till P20 eller P200 munstycket.
Figur 4. Mikroinjektion nål. (A) Den mikroinjektion nål är pulledde med hjälp av en nål avdragare med en specifik inställning. Inställningen av nålen avdragare måste bestämmas empiriskt. Med hjälp av en Narishege PC-10 nål avdragare, använder vi 72,8 ° C för värmeinställning 1 och 83,7 ° C för värmeinställning 2. Använda repa på plattan vi bryta nålspetsen för att underlätta vätskeflödet. (B) Den goda nål ska ha en längd av 500-600 nm från en bredd på 50 pm på axeln till 5 um vid spetsen.
Figur 5. Injektion av de nyligen befruktade sjöborre ägg. Dejellied ägg rodde på en PS-belagd skålen och befruktas. Nyligen befruktade ägg injicerades en efter en medan mikroskop scenen längs linjen av zygoter (uppifrån och ned) rörelse. (A) Injektion bolus är tydligt att bildas inuti den nyligen befruktadeägg på spetsen av nålen. (B) Transparent gödsling kuvertet bildas vid befruktningen. (C) Spermier visas som små svarta prickar i bakgrunden. Skala bar är 50 pm. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 6. Mikroinjicerades zygotes utvecklades till blastulae utan utvecklings-eller morfologiska defekter. Nyligen befruktade ägg injicerades med fluorescerande markörer, som tillåter dem att tydligt skiljas från de uninjected embryon (som visas med pilar). (AC) Embryon röntgas 400X förstoring. (DF) Embryon avbildas vid 100 gångers förstoring för att fånga de flesta av de emitterade fluorescenssignaler för tillförlitlig kvantifiering. Efter 24 timmar pOST gödsling, blastulae samlades och behandlades med 2x havsvatten i 2 min för att immobilisera simning embryon 3, följt av 1x havsvatten tvätt. Bilder förvärvades med Zeiss Observer Z1 mikroskop och AxioCam monochromic kamera. (A, D) DIC bilder av blastulae. (B, E) Överlagrings bilder av embryon som injicerats med in vitro-transkriberat mCherry i fluorescens och DIC-kanaler. (C, F) Overlay bilder av embryon som injicerats med in vitro transkriberade GFP i fluorescens-och DIC-kanaler. Skala bar är 50 pm. Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroinjektion är en kraftfull teknik för att avge olika behandlingar, såsom DNA, mRNA, rekombinanta proteiner, förlust av funktion och funktionsökning reagens, färgämnen och kombinationer av dessa in i ägg, embryon, och celler av olika organismer 1-7. Dock bör flera faktorer hållas i åtanke när man utformar en mikroinjektion experiment.
Det är oerhört viktigt att beakta lösligheten hos den levererade behandlingen och injektionsvolymen. Om idag injiceras lösningen tenderar att bilda även en liten fällning skulle microinjecting nålen vara igensatt. I allmänhet är det rekommenderat att centrifugera lösningen under mer än 15 minuter innan de laddas i nålen för att se till några fällningen avlägsnas från lösningen 3. Det andra tillvägagångssättet är att passera lösningen genom Millipore-centrifugeringskolonner. Om det inte är möjligt att undvika igensättning, kan det vara möjligt att rensa nålen genom att försiktigt bryta spetsen igen,men det blir svårt att kontrollera flödet av lösningen om spetsen är alltför bred. Den stora mängden av den injicerade lösningen kan vara toxisk för embryot, och för övrigt införs den breda spetsen större variationer mellan de volymer av lösning injiceras i individuella embryon. Det är också viktigt att mängden injicerad volym in i de nyligen befruktade ägg justeras. Den injicerade volymen kan kalibreras genom att man drar isär nålar vid olika inställningar, följt av injicering av lösningen till olja. Detta möjliggör mätning av diametern (och därmed volym) av droppen 32. Vi finner att en godtagbar mängd av injektionslösningen i det nyligen befruktat ägg inte bör överstiga 1/5 diametern hos den zygot som visas i figur 5.
Det viktigaste råd är att läsa in nålen precis innan injektionen, för att arbeta snabbt, och att ofta använda rengöringsknappen funktion injektorn som utlöser tillämpning av det maximalt tillgängliga trycket till utloppet iFör att spola ut den blockerade injektionsnål.
Ibland kan nålen täppa från utsidan, när spermien och skräp från de tidigare injicerade äggen fastnar på nålspetsen. I det fallet är det lämpligt att höja nålen hela vägen upp från 3-AT vatten i injicera skålen. Vanligtvis den spänning som orsakas av det vätskeluftgränssnitt är tillräckligt för att ta bort skräpet. Alternativt kan försiktigt borsta injektionsnålen mot repor på insprutningsplattan hjälpa också. I extremfallet, är det möjligt att torka av spetsen på nålen med den droppande våt Kimwipe. Kräver dock en sådan avtorkning extrem försiktighet och praktik.
Fluorescerande färgämnen såsom 10.000 MW Texas Red lysin laddade dextran (2 mg / ml) producerar en stark signal som kan detekteras och användas för tillförlitlig normalisering av den injicerade lösningen. När mRNA skall injiceras, rekommenderas att coinject med mCherry eller GFP mRNA tillsammans med mRNA för iIntresset för att säkerställa att ingen mRNA nedbrytning ägde rum. I det fallet visualisering av den fluorescerande signalen är beroende av översättning av mCherry eller GFP. Om användningen av färgämnen eller fluorescerande konstruktioner inte är möjligt, rekommenderas att ro en liten mängd ägg på varje enskild maträtt att se till att alla de nyligen befruktade ägg på den maträtt injiceras.
Sammanfattningsvis är mikroinjektion ett värdefullt verktyg för forskning inom genetik, molekylär, cellulär och utvecklingsbiologi. Med hjälp av denna teknik har sjöborre samfundet gjort betydande bidrag till vår förståelse av cell-och utvecklingsbiologi, t.ex. cell öde specifikation, geners funktion, genreglering och biokemiska vägar underliggande embryonal utveckling 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Santiago Suarez för kritisk läsning av manuskriptet och Betty Cowgill stöd i fotografi. Vi tackar även de anonyma granskare för deras kritiska synpunkter. Detta arbete stöds av universitetet i Delaware forskningsfonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40 °C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
- Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, Elsevier Academic Press. (2004).
- Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
- Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
- Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
- Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
- O'Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
- Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Nonviral gene delivery. Cold Spring Harb. Protoc. , (2011).
- Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
- Wilson, L. Methods in Cell Biology. 25, Elsevier. (1982).
- Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
- Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
- Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
- Ernst, S. G. Offerings from an Urchin. Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).
- McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
- Sodergren, E., et al. Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
- Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
- Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
- Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
- Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
- Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
- Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
- Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
- Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
- Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
- Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
- Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).
