海胆受精卵的高通量显微注射

Summary

显微注射是用于递送DNA构建体，mRNA表达，吗啉代反义寡核苷酸或其它处理成卵，胚胎，以及不同物种的细胞中的常见技术。

Abstract

显微注射到细胞和胚胎是用来研究广泛的生物学过程的一种常用技术。在该方法中少量的处理溶液被装入一个用于物理地注入单个固定的细胞或胚​​胎显微注射针。尽管需要对初始训练才能执行此程序用于高通量输送，显微注射提供最高的效率和可重复性交付各种各样的治疗方案（包括样品的复杂混合物）进入细胞，卵子或胚胎。应用显微注射包括递送的DNA构建体，mRNA表达，重组蛋白，增益功能，以及功能的试剂的损失。荧光或比色染料被加入到注射溶液，以使有效地提供实时可视化，以及提供可靠的递送溶液的量的归一化的工具。所描述的方法，使产生100-400海胆Ž显微注射在10-15分钟ygotes。

Introduction

高效的和可重复的治疗分娩是为研究人员的主要方法上的挑战之一。几种方法已经被建立以瞬时传送处理溶液进入卵，胚胎，和细胞。这些方法包括电穿孔（基于使用短的电脉冲的产生瞬态毛孔中的膜^）1,2，脂质转染（输送通过含有治疗的脂质体与细胞膜的融合体^）1，微粒轰击^1（沉淀DNA上的微米这随后被用来穿透细胞在高流速大小的金属颗粒），和转导（病毒被用作转基因的递送媒介物）。此刻，显微注射是保存提供任何溶液与100％的效率以最小的试剂的优点的唯一方法。此外，单一的注射液可组成一个处理复杂的鸡尾酒。这一技术已被用于成功LY微导的卵子和胚胎从众多种类，例如海胆^3,4，斑马鱼^5，鼠标器^6，青蛙^7，和牛⁸以及单个细胞在组织培养^9。单个卵裂球在注射后的发育阶段也已经进行了^10-12。

显微注射的当前方法是基于最初由平本¹⁰所述的压力注入法，但是，大的进展已经取得了这一过程的优化。优良的显微注射技术已在别处¹¹描述了，这里我们介绍的是目前用于微导海胆（ 紫色球海胆 ）新受精卵的具体方法之一。一个多世纪以来，海胆是一个有价值的实验模型^15,16。海胆是进化密切相关的脊索动物（包括我们），并分析它们的基因组发现，它们包含所有主要的基因家族的人^17。他们生产了大量的同步开发，可以很容易地操纵胚胎透明的。利用海胆作为模式生物，海胆社会对我们的受精过程的理解^18-21，细胞生物学过程^22-24和基因调控网络^{（GRNS）25-28}贡献。

显微注射到海胆受精卵需要几个步骤。首先，鸡蛋需要注射之前（在下面描述），固定。显微注射的菜肴都涂有硫酸鱼精蛋白（PS），它创建了一个带正电荷的表面到带负电荷的蛋能坚持^3。将卵孵育在酸性海水（pH值5.15）10分钟dejellied，随后在天然海水或人工海水（pH8.0）中洗涤两次。该dejellied鸡蛋小心划在一条直线上在1mM的3 -氨基三唑（3-AT），这是需要抑制是从卵的皮质颗粒分泌为受精²⁹的结果ovoperoxidase的活性存在PS涂 ​​覆盘的中间。这个步骤是重要的，以防止受精信封的硬化，并促进微注射针条目。作为替代，以1mM的3-AT，10毫对氨基苯甲酸（PABA），都可以使用。注射溶液装入用专门的微负载枪头微注射针以及安装在连接到显微操纵器和压力单元的保持器（ 图1）。每根针可以用于微导合子个体中在不同的日子多个实验。可10-15分钟进行显微注射​​，直至受精卵变硬。受精卵然后用海水和培养在15℃下当到达胚胎孵化囊胚期，它们会释放孵化酶，消化外汇储备的组成部分tilization信封^30，让他们自然地从PS-涂层盘分离。如果需要的话，将胚胎可以轻轻地从用口吸移管或巴斯德吸管海水轻轻地吹入胚胎培养皿分离。所描述的方法使得能够在一个单一的盘100-400新近受精的卵有效和可靠的显微注射，用于下游分析提供了一种高通量的方法。

Protocol

1。硫酸鱼精蛋白的制备（PS）包被的培养皿

1. 通过在50ml锥形管中加入0.5 G PS的50毫升去离子蒸馏水（双蒸₂ O）制备硫酸鱼精蛋白（PS）的1％溶液。摇匀在一条长凳上振动筛在室温下1-2小时高速，确保PS完全溶解。此溶液可以储存在4℃下至少3个月（确保在每次使用前，以完全溶解的凝胶样沉淀物^）3。
2. 取为60毫米×15毫米的聚苯乙烯培养皿套筒，奠定了两个盖子和底部的板凳上。
3. 倒在每一道菜1％的PS溶液（两者底部和盖子都可以使用）就足以覆盖表面，留下至少2分钟。剩的PS溶液可在3个月内，贮存于4℃。当多次重复使用
4. 在盛有蒸馏水（DH ₂ O）的烧杯代替PS处理过的菜。离开下运行DH _{2 O}的烧杯中至少10分钟。
5. PS涂层的菜肴可以立即或风干用于存储。掩护他们，以防止灰尘堆积。它们可以在室温下保存1个月^3。

2。获得海胆配子及固定的鸡蛋在PS上涂盘的显微注射

1. 产卵海胆通过摇动或intracoelomic注射高达至1ml 0.5％的KCl诱发的平滑肌收缩，释放配子^3（ 图2）。
2. 如果动物是雄性，由白色精子所示，收集精子干从动物的表面至1.5 ml管。干燥的精子可以保存在4℃下一个星期没有显著亏损生物学功能。
3. 如果动物是雌性，由黄色彩色由于蛋黄含量所指示的，通过浸渍生殖孔在一个充满海水烧杯中收集其配子。这些卵会从生殖孔释放，通过重力沉淀下来。</ LI>
4. 筛选蛋碎片，如使用80微米的尼龙过滤网动物棘。最好的结果是，如果卵产卵后的5-7小时，用于达到。
5. Dejelly鸡蛋：
   1. 制备100ml的酸性海水约1毫升蛋。用0.5M的柠檬酸在pH 8.0调节pH海水到5.1-5.2。太低的pH值将减少施肥和过高的pH值不会允许卵附着到PS包被的板。
   2. 加入鸡蛋（不超过1毫升）中，以酸性海水和允许卵定居于冰上10分钟。可选地，除去透明带的可通过蛋轻轻旋转在治疗过程中提供便利。一方面可以有效dejelly S.紫石鸡蛋3-4分钟这样。
   3. 小心倒出酸性海水，补充新鲜海水，让鸡蛋落户在冰上了。 Dejellied鸡蛋可以储存在冰上直至6小时没有受精的问题

   3。行的蛋

   1. 通过在10毫升双蒸₂ O溶解0.84克3-AT的准备3 -氨基三唑（3-AT，MW = 84.08）1米原液这种解决方案可以被存储在4℃下进行长达6个月。
   2. 制备3 - 以1mm工作液通过加入50μl的1M储备溶液至50ml预冷的海水。置于冰上的解决方案。
   3. 准备口吸管（ 图3）鸡蛋的柔和处理：
      1. 吸头从玻璃微（100×外径1.09毫米）手动拉。握住微量用双手在明火。作为玻璃开始融化，小心地将吸液管的端部在相对的方向。
      2. 连接一个上拉移液管的塑料管（编号1.14毫米），用封口膜封紧。管子的长度应为约50-70厘米。
      3. 插入无菌过滤P20或P200的尖管对面的结束玻璃管到用作口片。
      4. 夹用剪刀来调整前端部的直径的玻璃微量的末端。的最佳直径略微超过蛋（80微米）的直径。
   4. 倒入加入4ml 1毫米3-AT的海水到每个PS-涂层菜（底部或盖）。
   5. 搭口吸管，把P20/P200尖的嘴和牙齿固定。抽吸鸡蛋，先吸出少量的海水。通过装载的鸡蛋之前有液体柱，人们将有极大的控制口移液技术。
   6. 定位微量移液器尖端附近的鸡蛋和几百鸡蛋中的吸管轻轻吸出。玻璃微吸管内限制了鸡蛋。
   7. 排轻轻吹出来的吸管口在移动笔尖在一条直线上dejellied鸡蛋的菜一条直线。排鸡蛋打针之前正确的，因为可能会因为p发生受精的问题rolonged暴露在3-AT的海水^3。此外，阳离子性胶粘剂像PS可能是有毒的鸡蛋，这是不可取的，以暴露胚到这些试剂很长时间，特别是如果受精信封已被删除。
   8. 就用玻璃吸管划鸡蛋的线附近的菜划痕。此刮将是重要的突破注射针根据需要调整溶液的流动。或者，可以从头浇3-AT海水的菜前进行。

   4。海胆受精卵显微注射

   1. 开启显微注射站。在这里，我们描述了使用FemtoJet喷射系统。
   2. 用针拉马拉注射毛细血管。一个好的针的一个例子示于图4。注意：对于RNA注射，注射毛细血管应进行预处理，以避免RNA酶污染^31：
      1. 将注射毛细血管进入50ml锥形管和加入50 mL过滤甲醇/盐酸（9:1）的。摇匀并留下过夜不超过10小时以上。
      2. 倾掉甲醇/ HCl和冲洗毛细管2倍与过滤甲醇在同一管中。
      3. 漏甲醇尽可能和冻干毛细血管过夜以确保完全除去甲醇。
   3. 小心装入毛细管针上的针保持器加载并以<0.5微升的样品溶液使用微加载提示加载。样品溶液一般含有20％甘油，取决于注射材料^3。
   4. 将菜划鸡蛋放在显微镜阶段（鸡蛋应垂直对齐，通过目镜观察时），并专注于鸡蛋。
   5. 小心装入装入针到针质注射支架和调整针的位置有一个完全集中在尖端的场的中间。
   6. 压下按钮应用FO的最大压力的R针清洗。解决方案应该出来了针。如有必要，调整的压力：注射压力应在90-360百帕的范围内，补偿压力大约为注射压力的1/3。
   7. 通过注入未受精的卵子调节溶液流。使用操纵杆显微操作，直接注射针的未受精的卵的小费。为了便于落针，用硬物如螺丝刀舞台轻拍创建一个轻微的颤抖。一个注射小丸形成蛋内应该被看作（ 图5）。
   8. 如果注射小丸是不可见的，稍微抬高以上鸡蛋的针尖，找到划痕上的菜，并调整它被放置在场地中央。轻轻拍打针尖划伤大关注射针的尖端。调整注入和补偿压力，以确保注射小丸不超过的1/5吨的他径蛋（下午1-2点）的。
   9. 一旦注入丸校准，加入稀释的精液（1:1000）或1-2微升精子受精的卵子。拌匀小心，以防止撞出鸡蛋的行。
   10. 开始注射后立即受精信封变得可见（ 图5）。待着使用阶段控制器鸡蛋划的线，并通过由操纵杆控制的显微操作针戳他们注入许多受精卵越好。
   11. 后10〜15分钟后，将新的受精卵将变得硬化并不能注射任何更长的时间。从舞台中删除的菜，仔细用塑料巴斯德吸管吸出精子在3-AT的海水。
   12. 不要让受精卵干。迅速补充新鲜预冷的海水覆盖的菜。孵化的胚胎在15℃。

Representative Results

GFP和的mCherry记者构造进行体外转录和显微注射到新的受精卵。胚培养在15℃下放置24小时（直到囊胚期），并使用蔡司观察Z1显微镜成像。注射记者构造并没有导致任何发育缺陷（ 图6）。用于荧光信号的量化，图像采集是在低放大倍数（100X）进行，以最大程度地捕获荧光像素（ 图6D-F）。荧光信号使用的AxioVision 4.8.2.0定量。供的荧光信号中的100-200囊胚人口的强度的标准误差不超过1.5％（数据未示出）。

图1。显微注射的设置。（A）PS包覆二SH与固定化鸡蛋位于（B）的倒置显微镜台上。显微注射针连接到（C）被连接到一个（D）的压力单元的缝合针夹持器。移动在x-，y-和z轴的尺寸是针对使用（E）的显微操作或（F）的粗操纵器。 （G）螺丝刀包裹着纸巾是用来轻轻拍打显微镜阶段诱发轻微的颤抖，方便针头进入新的受精卵。

图2。产卵的海胆（A）海胆是诱发intracoelomic注射0.5％的KCl摆脱。在针点周围的动物，该动物的唯一软部的口部的口围膜。（B）母海胆置于其gonapores浸没在海水中的塑料烧杯中，收集黄色的蛋。 （C）白色精子从雄性海胆的gonapores释放。

图3。 。口吸管口吸液管由三部分组成：（ 一 ）玻璃微针，（B）塑料管材，以及（C）无菌过滤P20或P200的一角。的玻璃微插入其中连接到P20或P200口形件的塑料管。

图4。显微注射针（A）的显微注射针PUL导致用针拉马与特定的设置。需要将针拔出器的设置也可以根据经验确定。使用Narishege PC-10针拉马，我们用72.8℃，热定型1和83.7℃，热定型2。用刮盘上，我们打破了针尖，方便的解决方案流程。 （B）本好的针应具有500〜600微米，长度从50微米的宽度，肩至5μm的小费。

图5。注入新受精的海胆卵。Dejellied蛋被划上一个PS-涂层菜和受精。新近受精的卵注射逐个移动的同时沿合子的线（从顶部到底部）的显微镜载物台上。 （A）注射小丸清楚地看到被里面刚受精形成蛋在针的尖端。 （二）透明施肥信封受精后形成。 （三）精子出现黑色小点的背景。比例尺为50微米。 点击这里查看大图。

图6。发展到囊胚没有发展或形态缺陷显微注射受精卵。新受精卵注射荧光标记物，使它们能够被清楚地未注射胚胎（箭头所示）来区分。 （AC）胚胎成像在400X放大倍数。 （DF）的胚胎被成像在100X放大倍数来捕获大部分发射的荧光信号的可靠的定量。 24小时后pOST受精，囊胚进行了收集，并与2个海水2 min后，以固定的游泳胚胎^3，其次是1X海水冲洗。图像被收购与蔡司观察Z1显微镜和AxioCam单色相机。 （A，D）的囊胚的DIC图像。 （B，E）注射胚胎在体外的叠加图像转录的mCherry荧光和DIC的渠道。 （C，F）注入胚胎在体外的图像叠加在荧光和DIC渠道转录的GFP。比例尺为50微米。 点击这里查看大图。

Discussion

显微注射法是一种强大的技术用于递送各种治疗方法，如DNA，mRNA表达，重组蛋白，功能丧失和增益的功能的试剂，染料和它们的组合成蛋，胚胎，和各种生物^1-7细胞。然而，设计一个显微注射实验的时候几方面的考虑，应牢记。

这是极为重要的是要考虑的递送治疗和注射量的溶解性。如果显微注射液趋向于形成即使是轻微的沉淀，在质注射针将被堵塞。一般来说，建议加载到针内，以确保任何沉淀物从溶液中除去³之前，离心15分钟以上的溶液。另一种方法是通过Millipore公司的离心柱来传递的解决方案。如果这是不可能避免堵塞，有可能以疏通通过轻柔再次打破了尖的针，但它变得难以控制溶液的流动，如果针尖太宽。将大量的注射溶液可以是有毒的胚胎，而且，被广泛尖端引入溶液的体积注射到单个胚胎之间的更大的变化。同样重要的是体积注入到新受精卵的数量进行调整。注射体积可以通过拉动针在随后将溶液注射进油的各种设置进行校准。这允许用于测量液滴³²的直径（因而体积）。我们发现，注射溶液，在新的受精卵可接受的量不应超过的1/5的直径合子的， 如图5。

主要的建议是加载针注射前的权利，工作速度快，并且经常使用它触发应用程序可用的最大压力在出口喷油器的清洗按钮功能为了冲洗掉堵塞注射针。

有时针可能会堵塞从外部，当从先前注射的卵，精子和碎屑粘到针的尖端。在这种情况下，将针抬起所有的方式从在注入培养皿中3-AT的水是有益的。通常所造成的液体 - 空气界面的张力就足以除去碎屑。另外，轻轻刷洗注射针头对上喷射板的划痕可能有助于也。在极端情况下，也能够擦拭用湿滴的Kimwipe针的尖端。然而，这样的擦拭，需要格外小心和实践。

荧光染料如10,000 MW德克萨斯红赖氨酸带电葡聚糖（2毫克/毫升）产生可检测的和可靠的用于注射的溶液的归一化信号强。当mRNA的是要注入时，建议使用的mCherry或绿色荧光蛋白的mRNA，以共注校正随着在mRNA的票面​​以确保没有mRNA的降解发生。在这种情况下，荧光信号的可视化是依赖的mCherry或绿色荧光蛋白的翻译。如果使用染料或荧光性构建体是不可能的，所以建议排少量对每个人菜蛋，以确保在该盘的所有新的受精卵被注入。

总之，显微注射法是研究遗传学，分子，细胞和发育生物学的重要工具。使用这种技术，海胆社会作出我们的细胞和发育生物学等细胞的命运规范，基因功能，基因调控和生化途径潜在的胚胎发育¹⁶的认识显著贡献。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Inverted microscope  Axiovert 40 °C	Zeiss	4109431007990000	Injection microscope
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003	Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm	Amazon.com	03-80-37	Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips	Fisher Scientific	02707432 or 02707430	Part of a mouth pipette
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing	Intramedic	PE-160	Part of a mouth pipette
Protamine sulfate	MP Biomedicals, LLC	194729	Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
Sea water	any pet store	Instant Ocean
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1	Narishige	9124	Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Manipulate injection needle
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Vertical  needle puller	Narishige	PC-10	Pull injection needles