Summary
윌리스 천공의 관내 서클 지주막 하 출혈의 표준화 된 마우스 모델을 설명한다. 선박 천공 및 지주막 하 출혈은 두개 내 압력 모니터링에 의해 모니터링된다. 또 각종 중요한 파라미터는 기록 및 생리적 조건을 유지하도록 제어된다.
Abstract
이 비디오 발행물에서 지주막 하 출혈 (SAH)의 표준화 된 마우스 모델을 제시한다. 출혈은 윌리스의 천공 (CWP)의 혈관 내 서클에 의해 유도 및 두개 내압 (ICP) 모니터링에 의해 입증된다. 이에 동맥 순환을 둘러싼 막밑 공간 및 소뇌에서 균열 균질 혈액 분포가 달성된다. 체온, 전신 혈압, 심박수, 및 헤모글로빈 포화 : 동물 생리학은 삽관, 기계 환기, 다양한 생리 학적 및 심혈관 파라미터의 연속 온라인 모니터링에 의해 유지된다. 따라서 대뇌 관류 압력이 단단히 extravasated 혈액의 적은 변수 볼륨의 결과를 모니터 할 수 있습니다. 이 생쥐의 혈관 필라멘트 천공의 더 나은 표준화를 허용하고 모든 모델은 높은 재현성 있습니다. 따라서 야생 유형과 유전학의 약리학 적 및 병리 생리 학적 연구를 위해 쉽게 사용할 수 있습니다LY 쥐를 변경.
Introduction
SAH 환자를위한 가장 유익한 결과에 뇌졸중 서브 타입입니다 : 환자의 40 %는 출혈 후 1 개월 이내에 사망하고 생존자는 거의 임상 적으로 유리한 결과가 없습니다.
자연 SAHs (80 %)의 대다수는 대부분 동맥, 기저 동맥과 중대 뇌동맥 (MCA) 2 통신 전방과 후방을 따라 위치한 두개 내 동맥류의 파열에 의해 발생합니다.
이러한 동맥류는 동물 모델하기가 어렵습니다 때문에 SAH의 동물 모델은 하나 지주막 하 공간 / 대뇌 심실로 또는 지주막 혈관의 혈관 천공에 의해 혈액의 주입에 의해 수행된다.
혈액량은 직접 3을 제어 할 수 Cisterna의 마그나로자가 혈액 주입이 수행하기 쉽고 재현성이다. 불행하게도 SAH의 병태 생리의 일부 측면은, 예를 들어혈관 손상이 절차에 의해 모델링 할 수 없습니다. SAH의 유도를위한 또 다른 기술 방식은 수조 내 정맥 4의 시작입니다.
그러나, MCA 지점에서 관내 CWP 모델 인간의 병태 생리에 가장 가까운 5 절차로 나타납니다. 방법은 Veelken와 동료 6,7 의해 Bederson 및 동료와 동시에 개발되어 제 래트에서 설명 하였다. 나중에 관내 천공 모델은 마우스 8,9에 적응했다. 필라멘트는 외부 경동맥 (ECA)에 삽입하고 내 경동맥 (ICA)를 통해 두개골 바닥으로 전진된다. MCA의 분기점에서 필라멘트는 배를 관통하고 및 두개골 바닥에서 지주막 하 공간에 출혈을 유도한다. 혈액은 균열 및 혈관을 따라 잔존 막밑 공간으로 분배한다. 출혈은 천공 부위에 혈전 형성에 의해 중지,하지만 rebleedings, 어있다무형 문화 유산 환자 10 발생할 수 있습니다 종종 해로운. 따라서, 혈관 필라멘트 모델은 지난 몇 년 동안 널리 사용 SAH 모델이되었다. 필라멘트 천공 모델의 가장 자주 언급 한 단점은 출혈 볼륨이 직접 제어 될 수없고, 따라서 가변 될 수 있다는 것이다. 이 변화는 크게 동물 생리학 및 사후 출혈성 ICP의 엄격한 제어에 의해 감소 될 수있다.
마우스는 유전자 변형 종자의 큰 숫자가 사용할 수있는 큰 장점이 있습니다. 그러나, 작은 크기로 수술 과정이 더 큰 종, 예를 들면 래트 또는 토끼에서보다 더 복잡한 경향이있다. 따라서 생쥐 래트 위해 개발 기술의 다운 스케일링은 종종 마우스 헤모글로빈 포화 및 심박수 모니터링 매우 제한된 체중과 혈액 부피 비 침습적 혈압과 혈액 가스 분석을위한 기술뿐만 아니라이 같은 예 원하는 결과로 이어질없는가능한 적용되어야한다. 따라서, 현재 출판의 목표는 생쥐의 SAH의 필라멘트 천공 모델을 설명하는이 모델은 표준화되고 재현성이 높은 방식으로 수행 할 수있는 방법을 설명하는 것입니다.
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Protocol
모든 수술은 윤리적 검토를 실시하고 바이에른 북부의 정부 (참조 번호 : 55.2-1-54-2532.3-13-13 및 -2532-136-11)에 의해 승인되었다. 동물은 약 25 g의 체중을 가진 남성 C57BL / 6 마우스입니다.
1. 동물 준비
- 챔버에 마우스를 넣어 마취를 유도한다. 동물이 의식을 잃을 때까지 5 % 이소 플루 란과 챔버를 세척합니다.
- 복강 예 혼합 마취제를 주입 : 펜타닐 (0.05 ㎎ / ㎏), 미다 졸람 (5 ㎎ / ㎏)과 medetomidine (0.5 ㎎ / ㎏). 절차를 수행하는 동안 이전과 정기적으로 반사를 확인합니다. 마취를 유지하기 위해 시간당 초기 금액의 3 분의 1을 재 주입.
- 20 G 정맥 카테터 (11)에서 만든 튜브 삽관 orotracheally. 삽관이 기울어 진 플랫폼 (30 °)에 동물을 해결하기 위해, 구부러진 집게로 혀를 철회 작업 현미경으로 성대를 시각화하고 기관에 튜브를 삽입영감시.
- 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 놓고면의 조각 또는 microcapnograph와 튜브의 정확한 위치를 확인합니다.
- 호흡기에 삽관 튜브를 연결합니다. 180-220 호흡 / 분, 200 ~ 250 μL의 스트로크 양의 주파수와 25 %의 산소 보충, 실내 공기와 마우스를 환기.
- microcapnograph에 삽관 튜브를 연결합니다. 환기 주파수를 조정하여 30 mmHg로에서 기말 PCO 2를 유지한다.
- 직장 온도 프로브를 삽입하고 37 ° C의 코어 체온을 유지하기 위해 가열 패드 위에 동물을 배치.
- 오른쪽 뒷발에 환상 pulsoximeter 센서를 적용합니다.
- 가위로 머리 위의 피부를 엽니 다. 절개는 약 0.5 ㎝ 길이와 귀와 눈 사이에 있어야한다.
- 측두골에서 메스와 왼쪽 시간 근육을 해부하다.
- 레이저 도플러 유량계 (LDF) 프로브에 접착제좌측 측두골. 접착제가 경화 할 때까지 고정 된 위치에 프로브를 잡아.
- 좌측 측두골에 치과 드릴로 약 1.5 mm 직경의 구멍을 뚫습니다. 열 손상을 방지하기 위해 식염수로 뼈 쿨.
- 두개골 구멍에 ICP 프로브를 삽입합니다. 뇌 조직의 손상과 출혈을 방지하기 위해 등쪽으로 최대한 앞으로 밀어 넣습니다.
- 프로브가 올바른 위치에있는 경우, 수정, 시멘트로 밀봉. 5 분 동안 시멘트를 건조 시키십시오.
- 앙와위로 조심스럽게 마우스를 켭니다.
- 지속적인 혈압 모니터링의 경우, 왼쪽 대퇴 동맥 카테 테르를 꽂다.
- 혈압 감시 장치에 대퇴 카테터를 연결한다.
2. SAH 유도
- 턱 흉골에서 가위 (2cm)로 피부를 엽니 다. 퉁명스럽게 결합 조직을 해부하다 옆 침샘을 누릅니다.
- 왼쪽 경동맥 (CCA)를 노출하고 동원. 보존CCA와 같은 결합 조직 칼집에서 실행 미주 신경. 뇌신경 이동하고 동일한 기술을 사용하여 ICA와 ECA를 노출하고 동원.
- 지금까지 cranially 가능한 ECA을 결찰.
- ECA 주변의 필라멘트 두 개 더 ligations을 사전에 미리 협의.
- microclips으로 일시적으로 CCA와 ICA를 막다. microclip 어플리케이터와 microclips를 배치합니다. 클립을 조심스럽게 그들을 다시 잡아 당겨 올바르게 적용되었는지 확인합니다.
- 선박 가위로 ECA에 필라멘트의 삽입을위한 구멍을 잘라 버릴거야.
- ECA에 12mm의 길이 Prolene으로 5-0 필라멘트를 삽입합니다.
- 한 사전 협의 결찰 삽입 사이트를 닫습니다.
- CCA와 ICA에서 microclip 주걱으로 microclips를 제거합니다.
- ICP가 상승 할 때까지 ICA에 집게로 필라멘트를 사전. ICP의 급격한 상승은 출혈 유도를 나타냅니다.
- 즉시 필라멘트를 철회 및 홍보를 모두 닫아 ECA을 결찰연속 earranged ligations. 이 삽입 부위의 출혈 방지 할 수 있습니다.
- 피부의 상처를 봉합.
- 20 분 동안 동물의 생리 학적 파라미터를 모니터링합니다.
- ICP와 LDF 프로브를 제거하고 피부의 상처를 봉합.
3. 실험 종료
- PBS에서 20 ㎖ 4 % PFA (4 ° C) 다음에 생리 식염수 (실온) 20 ㎖로 transcardially 동물을 Perfuse.
- 두개골의 두뇌를 해부하다. 중간 선 및 궤도 구멍 사이의 두개골을 잘라. 그런 다음 머리에서 뼈 껍질.
- 지주막 하 공간에 혈액 분포를 평가합니다.
4. 생존 수술의 케이스에있는 고려 사항 (비디오에 표시되지 않음)
- 직접 마취 유도 수술 후 진통을 위해 Carprofen을 (4 ㎎ / ㎏ 피하) 주사. 수술 후 관찰 기간 동안 Carprofen은 (4 ㎎ / ㎏ 피하) 매 24 시간을 주입한다. 대신 침습적 혈압 측정은 비 침습적 혈압 모니터링 시스템을 사용한다.
- 날록손 (1.2 ㎎ / ㎏), 플루 마제 닐 (0.5 ㎎ / ㎏)과 atipamezole (2.5 ㎎ / ㎏) : 피하 에이전트를 반감 마취 주사의 종료하십시오.
- 동물을 튜브를 빼내.
- 반사 신경의 회복 후 예열 실에 동물을 넣어. 24 시간 동안 약 32 ° C에서 동물을 유지합니다.
- 동물은 수술 후 첫 번째 시간 동안 자발적 호흡과 자신의 일반적인 상태를 정기적으로 확인합니다. 뇌간이 영향을받는 경우 동물 문제를 호흡하고 안락사되어야한다.
- 동물은 자신의 일반적인 상태와 체중뿐만 아니라 신경 및 감각 적자 15 매일 확인합니다.
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Representative Results
사망
수술 기술이 숙달되면 절차는 수술 사망률을 유도하지 않습니다. 또한 출혈은 거의 모든 동물에서 달성 될 수있다. 수술 후 사망률은 대부분의 동물은 수술 후 (그림 5) 1 일에 죽어 가고 30~40%입니다.
ICP는 SAH 후 값
출혈 전에 ICP은 약 4 mmHg로합니다. 최대 120 mmHg로에 ICP의 급격한 증가에 결과를 출혈. ICP 값은 5 분으로 약 30 mmHg로 (도 1) 내에서 안정. 24 시간에서 ICP 출혈 후에도 약간 10 mmHg로 5로 상승.
SAH 후 혈압
혈압은 즉시 유도 (그림 2) 출혈 후 상승한다. 이것은 높은 ICP에 의해 시작됩니다 쿠싱 반사에 의한 것입니다.
SAH 후 대뇌 관류
AF터의 출혈 유도 뇌 관류의 극적인 감소를 모니터링 할 수 있습니다. 각각 다른 레벨로 재관류는 모욕 (그림 3) 후 5 분 이내에 발생합니다.
혈액이 뇌에 공급 동맥과 소뇌의 균열을 따라 분배
우리는 냉장 4 % PFA 20 ㎖ 다음에 생리 식염수 20 ㎖로 transcardially SAH 후 동물에게 3 시간을 관류. 뇌를주의 깊게 제거하고, 거미 막밑 공간에 혈액 분포가 관찰되었다. 피 지느러미 피질으로 뇌에 공급 동맥의 혈관 주위 공간에 따라 분배한다. 모든 경우에 extravasated 피가 두 번째 분기까지 MCA에 덮여있다. 출혈에 측면 동측은 반대쪽 반구 (그림 4)보다 더 많은 혈액으로 덮여있다.
혈액 분포는 ICP 상승과 상관하지 않습니다
5 동물에서 우리는 ICP (D)의 상승 여부를 조사 uring SAH는 지주막 하 공간에 혈액 공급에 영향을 미치고 있습니다. 하나의 가설은 SAH 동안 만 적당한 ICP 상승을 보여 동물은 다음 피질의 지느러미 부분에 배포하지 않고 적은 extravasated 혈액을 나타낼 수있는 것이 었습니다. 우리는 두개골 바닥에서 혈종의 크기 만이 ICP 상승과 상관 관계를 보이는 것으로 나타났습니다. 두뇌 공급하는 동맥을 따라 혈액 분포가 다른 ICP 피크 값 동물 사이에 차이가 없었다.
그림 1. SAH 후 5 동물의 SAH. 대표 ICP 값을 후 ICP 값은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 2. SAH 후 5 동물의 SAH. 대표 혈압 값을 후 혈압. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. SAH 후 5 동물의 SAH. 대표 레이저 도플러 유량계 값을 후 대뇌 관류. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 두뇌 공급하는 동맥을 따라 혈액 유통. 대표 혈액 DISTSAH 후 5 동물의 ribution. 레드 라인은 뇌에 공급 동맥을 따라 혈액 분포를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 5. 49 남성 C57BL / 6 마우스의 SAH 다음 SAH. 생존 곡선 후 생존 곡선은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
SAH 후 처리 옵션이 부족하고 대부분 효력이없는 수 있습니다. 따라서 사후 출혈성 뇌 손상의 병태 생리 더욱 새로운 치료 표적을 식별하고 새로운 치료 방법을 개발하기 위해 이해되어야한다. 표준화 및 유전자 변형 동물 즉, 마우스, 잘 재생 가능한 동물 모델은 조사를 위해 매우 중요하다. 그것은 밀접하게 인간의 병태 생리와 유사한으로 CWP 모델은 SAH를위한 널리 사용되는 모델이되고 있습니다하지만, 마우스에서의 사용은 낮은 재현성이 높은 대인 관계 변화에 의해 방해된다. 모델의 변화는 생리적 조건을 변경 다른 마취 프로토콜에 의해 발생합니다. 출혈의 양으로 인해 혈관 반응성, 혈압 및 응고의 차이 (12)에 동물간에 변화한다. 따라서이 과정을 통하여 생리적 조건을 모니터링 및 VA를 감소 수술 및 모니터링 프로토콜을 확립하는 것이 중요이 모델의 riability.
SAH 후 혈액 분포는 종 사이 다를 수 있습니다. 쥐 모델의 혈액에서 동일하게 두 대뇌 반구 6에 분산 될 것으로 보인다. 인간의 두뇌는 gyrencephalic 아키텍처를 보여으로 혈액은 주로 뇌 sulci을 따라하지 주로 혈관을 따라 배포 할 가능성이있다. 한편, 이러한 sulci 실행 뇌 공급 동맥 횡 고랑에서 MCA를 예. 따라서 혈관 병변은 설치류 동물 모델과 인간의 뇌와 유사 할 수 있습니다.
실험실에서 우리는 펜타닐, medetomidine 수술 마취에 대해 전술 한 바와 같이 미다 졸람의 조합을 사용한다. 이 조합은 혈압과 혈관 반응성 (11)에 상대적으로 작은 영향을 미친다. 대조적으로, 이소 플루 란으로 SAH 연구에 널리 사용되는 마취제, 즉 후방 말초 혈관 확장, 심하게 손상된 대뇌 자동 조절 (13), 저혈압에 이르게어 SAH 12, 정기적으로 인간의 SAH의 초기 병태 생리와 연관되지 않은 결과. 따라서, 후 출혈성 병태 생리를 방해하지 않는 마취 프로토콜의 사용은 유효한 실험 SAH 모델을위한 중요한 전제 조건입니다.
출혈의 양이 혈관 병변에 따라 달라지며, 필라멘트 (14)의 크기와 따라서 변화한다. 모델의 또 다른 중요한 단계는 혈관 천공 후 필라멘트의 철수이다. ICA의 혈액 흐름을 필라멘트에 의해 방해하고 지연 철수 작은 출혈이 발생할 수 있습니다. 따라서, 혈관 천공 및 필라멘트 금단 간의 시간을 표준화하기 위해 중요하다. 혈관 천공의 시점은 높은 시간 정밀도로 측정 할 수 있다면 이것은 당연히에만 가능하다. 우리의 설정이는 ICP의 연속 측정에 의해 달성된다. ICP의 급격한 증가는 성공적인 혈관 천공을 표시함으로써 standardizatio에게 수필라멘트 철수 따라서 출혈 강도 명. 또, ICP 제어 혈관 천공 필라멘트가 너무 작게함으로써 뇌 조직의 손상을 방지하는 전진 것을 방지한다. 따라서, 연속 ICP 측정 뮤린 SAH 모델의 변동성을 최소화하기 위해 우수한 기술이다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
현재의 연구는 Solorz - 잭은 연구 재단에 의해 투자된다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| operation microscope | Leica | KL2500 | |
| isoflurane vaporizer | Harvard Instruments | Continuous Flow Vaporizer | |
| respirator | Hugo Sachs | Minivent 845 | |
| microcapnograph | Hugo Sachs | Type 340 | |
| temperature controller | FHC | DC Temperature Controller | |
| dental drill | Paggen | Labset- N | |
| ICP monitor | Codman | ICP monitor | |
| blood pressure monitor | AD Instruments | Bridge Amp FE221 | |
| syringe pump | World Precision Instruments | SP101IZ | |
| pulsoximeter | Kent Scientific | MouseSTAT | |
| LDF | Perimed | Periflux 5000 | |
| analog data monitor | AD Instruments | Power Lab 16/35 | |
| Material | |||
| cement for ICP probe fixation | Speiko | Carboxylate cement | |
| glue for LDF probe fixation | Bob Smith Industries | Cyanoacrylate glue (Maxi Cure and Insta Set) | |
| venous catheter | Johnson Johnson | Jelco winged i.v. catheter; REF 4076 | modified intubation tube |
| tubing for femoral catheter | Smiths Medical | Fine Bore Polythene Tubing; ID 0.28 mm OD 0.61 mm; REF 800/100/100 | cut to 30 cm length |
| filament for vessel perforation | Ethicon | Prolene 5-0 | cut to 12 mm length |
| surgical equipment | Fine Scientific Instruments | forceps medical #5, vessel scissors 8 cm, microclip 4 mm jaw | |
References
- Cahill, J., Zhang, J. H. Subarachnoid hemorrhage: is it time for a new direction. Stroke. 40, 86-87 (2009).
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369, 306-318 (2007).
- Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. J. Neurosci. Methods. 123, 89-97 (2003).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J. Neurosci. Methods. 183, 136-140 (2009).
- Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. J. Neurosci. Methods. 190, 164-170 (2010).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
- Veelken, J. A., Laing, R. J., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26, 1279-1283 (1995).
- Kamii, H., et al. Amelioration of vasospasm after subarachnoid hemorrhage in transgenic mice overexpressing CuZn-superoxide dismutase. Stroke. 30, 867-871 (1999).
- Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurol. Res. 24, 510-516 (2002).
- Broderick, J. P., Brott, T. G., Duldner, J. E., Tomsick, T., Leach, A. Initial and recurrent bleeding are the major causes of death following subarachnoid hemorrhage. Stroke. 25, 1342-1347 (1994).
- Thal, S. C., Plesnila, N. Non-invasive intraoperative monitoring of blood pressure and arterial pCO2 during surgical anesthesia in mice. J. Neurosci. Methods. 159, 261-267 (2007).
- Hockel, K., Trabold, R., Scholler, K., Torok, E., Plesnila, N. Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats. Exp. Transl. Stroke Med. 4, 5 (2012).
- Wang, Z., Schuler, B., Vogel, O., Arras, M., Vogel, J. What is the optimal anesthetic protocol for measurements of cerebral autoregulation in spontaneously breathing mice? Exp. Brain Res. 207, 249-258 (2010).
- Schwartz, A. Y., Masago, A., Sehba, F. A., Bederson, J. B. Experimental models of subarachnoid hemorrhage in the rat: a refinement of the endovascular filament model. J. Neurosci. Methods. 96, 161-167 (2000).
- Feiler, S., Plesnila, N., Thal, S. C., Zausinger, S., Scholler, K. Contribution of matrix metalloproteinase-9 to cerebral edema and functional outcome following experimental subarachnoid hemorrhage. Cerebrovasc. Dis. 32, 289-295 (2011).
