Summary
Un modèle de souris standardisée de l'hémorragie sous-arachnoïdienne par intraluminal cercle de Willis perforation est décrit. perforation du navire et méningée saignements sont contrôlés par la surveillance de la pression intracrânienne. En outre différents paramètres vitaux sont enregistrées et contrôlées pour maintenir des conditions physiologiques.
Abstract
Dans cette publication vidéo un modèle de souris standardisée de l'hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) est présenté. Saignement est induite par Cercle endovasculaire de Willis perforation (CWP) et prouvé par la pression intracrânienne (PIC) de surveillance. De ce fait une répartition homogène de sang dans les espaces sous-arachnoïdiens entourant la circulation artérielle et des fissures du cervelet est atteint. Physiologie animale est maintenu par intubation, ventilation mécanique, et la surveillance de divers paramètres physiologiques et cardiovasculaires continue en ligne: la température du corps, la pression artérielle systémique, la fréquence cardiaque et la saturation de l'hémoglobine. De ce fait la pression de perfusion cérébrale peut être surveillé étroitement résultant en un volume variable de moins de sang extravasé. Cela permet une meilleure standardisation des endovasculaire perforation de filament dans les souris et rend l'ensemble du modèle hautement reproductible. Ainsi, il est facilement disponible pour les études pharmacologiques et physiopathologiques de type sauvage et génétiquely modifié souris.
Introduction
SAH est le sous-type de course avec le résultat le moins bénéfique pour les patients: 40% des patients meurent dans le mois suivant le saignement 1 et survivants ont rarement un résultat clinique favorable.
La grande majorité des SEP spontanées (80%) sont causés par la rupture des anévrismes intracrâniens qui sont principalement situés le long de la partie antérieure et artère communicante postérieure, l'artère basilaire, et de l'artère cérébrale moyenne (MCA) 2.
Ces anévrismes sont difficiles à modéliser chez l'animal et par conséquent des modèles animaux de SEP sont effectuées par injection de sang dans l'espace sous-arachnoïdien ventricules cérébraux / ou par perforation endovasculaire d'un vaisseau sous-arachnoïdienne.
Injection de sang autologue dans la grande citerne est facile à réaliser et reproductible que le volume de sang peut être commandé directement 3. Malheureusement, certains aspects de la physiopathologie SEP, par exemple lela lésion du vaisseau, ne peut être modélisée par cette procédure. Une autre approche technique pour l'induction de SAH est l'ouverture d'une veine intracisternale 4.
Toutefois, le CWP intraluminal à la succursale MCA semble être la procédure que les modèles de la physiopathologie chez l'homme le plus étroitement 5. La méthode a été développée et décrite pour la première chez le rat par Bederson et collègues, et en même temps par Veelken et collègues 6,7. Plus tard, le modèle de perforation intraluminal a été adapté aux souris 8,9. Un filament est inséré dans l'artère carotide externe (CEA) et avancé à la base du crâne par l'artère carotide interne (ACI). A l'endroit de la MCA de branchement du filament perfore la cuve et provoque un saignement dans l'espace sous-arachnoïdien de la base du crâne. Le sang distribue ensuite dans l'espace sous-arachnoïdien restant le long des fissures et des vaisseaux sanguins. Saignement est arrêté par la formation de caillots sur le site de perforation, mais rebleedings, which sont souvent préjudiciable chez les patients 10, peuvent se produire. Par conséquent, le modèle de filament endovasculaire est devenu un modèle SAH largement utilisé au cours des dernières années. L'inconvénient le plus souvent mentionné le modèle filament de perforation est que le volume de saignement peut pas être contrôlée directement et peut donc être variable. Cette variabilité peut être significativement réduite par un contrôle strict de la physiologie animale et post-hémorragique ICP.
Les souris ont le grand avantage d'un grand nombre de souches génétiquement modifiées sont disponibles. Toutefois, en raison de leur petite taille les procédures chirurgicales ont tendance à être plus complexe que dans les plus grandes espèces, par exemple les rats ou les lapins. Par conséquent, la mise à l'échelle des techniques développées pour les rats à des souris souvent n'entraîne pas les résultats escomptés, par exemple que les souris ont une des techniques non invasives très limitées de poids de corps et de volume de sang pour la pression sanguine et l'analyse des gaz du sang ainsi que pour la saturation de l'hémoglobine et de la surveillance de la fréquence cardiaquedoivent être appliquées dès que possible. Par conséquent, le but de la présente publication est de décrire le modèle de perforation de filament pour SAH chez les souris et pour montrer comment ce modèle peut être effectuée d'une manière normalisée et hautement reproductible.
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Protocol
Toutes les interventions chirurgicales ont été soumis à un examen éthique et approuvés par le gouvernement de Haute-Bavière (numéro de référence: 55.2-1-54-2532.3-13-13 et -2532-136-11). Les animaux sont mâles C57BL / 6 avec un poids corporel d'environ 25 g.
Une. Préparation des animaux
- Induire une anesthésie en plaçant la souris dans une chambre. Rincer la chambre avec 5% d'isoflurane que l'animal perd conscience.
- Injecter des anesthésiques par voie intrapéritonéale prémélangés: fentanyl (0,05 mg / kg), le midazolam (5 mg / kg) et la médétomidine (0,5 mg / kg). Vérifiez réflexes avant et régulièrement pendant la procédure. Réinjecter un tiers du montant initial horaire pour maintenir l'anesthésie.
- Intuber orotracheally avec un tube d'un cathéter veineux G 11 20. Pour intubation fixer l'animal sur une plate-forme inclinée (30 °), rétracter la languette avec une pince pliées, de visualiser les cordes vocales sous un microscope d'opération et insérer le tube dans la trachéependant l'inspiration.
- Placez la souris dans une position couchée et vérifier le positionnement correct du tube avec un morceau de coton ou un microcapnograph.
- Connecter le tube d'intubation au respirateur. Ventiler la souris avec l'air ambiant supplémenté avec 25% d'oxygène avec une fréquence de 180 à 220 respirations / min et un volume d'éjection de 200 à 250 pi.
- Connecter le tube d'intubation à la microcapnograph. Maintenir la fin d'expiration pCO 2 à 30 mm de Hg en ajustant la fréquence de ventilation.
- Insérer une sonde de température rectale et à placer l'animal sur un coussin chauffant pour maintenir 37 ° C de la température corporelle.
- Appliquer le capteur de pouls annulaire sur la patte arrière droite.
- Ouvrez la peau au-dessus du crâne avec une paire de ciseaux. L'incision doit être d'environ 0,5 cm de long et entre l'oreille et l'œil.
- Disséquer le muscle temporal gauche avec un scalpel à partir de l'os temporal.
- Collez le débitmètre laser Doppler (LDF) de la sonde surl'os temporal gauche. Tenir la sonde dans une position fixe jusqu'à ce que la colle durcisse.
- Percez un trou d'environ 1,5 mm de diamètre avec une fraise dentaire dans l'os temporal gauche. Refroidir l'os avec une solution saline pour prévenir les dommages de la chaleur.
- Insérez la sonde ICP dans la cavité crânienne. Pousser en avant comme le dos que possible pour éviter des dommages aux tissus du cerveau et une hémorragie.
- Si la sonde est à la bonne position, fixer et sceller avec du ciment. Laissez le ciment sécher pendant 5 min.
- Retournez la souris avec soin pour une position couchée.
- Pour la surveillance continue de la pression artérielle, cathétériser l'artère fémorale gauche.
- Connecter le cathéter fémoral au dispositif de surveillance de la pression sanguine.
2. SAH induction
- Ouvrez la peau avec une paire de ciseaux de sternum au menton (2 cm). Disséquer le tissu conjonctif et carrément pousser les glandes salivaires de côté.
- Exposer l'artère carotide commune gauche (CCA) et le mobiliser. Préserver l'nerf vague, qui se déroule dans la même gaine de tissu conjonctif comme le CCA. Déplacez crânienne et exposer et mobiliser l'ICA et la Cour des comptes en utilisant la même technique.
- Ligaturer le CEA autant crânienne que possible.
- Convenir deux autres ligatures pour filament autour de la CEA.
- Obstruer la CCA et la CIA temporairement microclips. Placez les microclips avec un applicateur de microclip. Assurez-vous que les clips sont correctement appliquées en les tirant doucement le dos.
- Coupez un trou pour l'insertion du filament dans le CEA avec un navire ciseaux.
- Insérez un filament Prolene 5-0 avec 12 mm de longueur dans le CEA.
- Fermer le site d'insertion avec une ligature préétabli.
- Retirez les microclips avec un applicateur de microclip de la CCA et la CIA.
- Avancer le filament avec une pince dans l'ICA jusqu'à la PIC augmente. Une hausse soudaine de l'ICP indique saignement induction.
- Retirer le filament immédiatement et ligaturer le CEA en fermant les deux prligatures earranged consécutivement. Cela empêche le saignement sur le site d'insertion.
- Suturer la plaie de la peau.
- Surveiller les paramètres physiologiques de l'animal pour un autre 20 min.
- Retirer ICP et les sondes de FDL et suturer la plaie de la peau.
3. Fin de l'expérience
- Perfuser l'animal transcardiaque avec 20 ml d'une solution saline (à température ambiante), suivi par 20 ml de PFA à 4% dans du PBS (4 ° C).
- Disséquer le cerveau sur le crâne. Couper le crâne sur la ligne médiane et entre les cavités orbitales. Puis peler l'os du cerveau.
- Évaluer la distribution du sang dans l'espace sous-arachnoïdien.
4. Considérations en cas de chirurgie de survie (non représenté dans la vidéo)
- Injecter Carprofen (4 mg / kg par voie sous cutanée) pour l'analgésie postopératoire directement après induction de l'anesthésie. Au cours de la période d'observation postopératoire carprofène (4 mg / kg sous-cutanée) est injecté à tous les 24 h. Au lieu de la mesure de la pression artérielle invasive font usage d'un système de surveillance de pression sanguine non invasive.
- Pour la terminaison de l'anesthésie injection sous-cutanée, les agents antagonistes: la naloxone (1,2 mg / kg), le flumazénil (0,5 mg / kg) et de l'atipamézole (2,5 mg / kg).
- Extubation l'animal.
- Après avoir repris des réflexes mettre l'animal dans une chambre préchauffé. Garder l'animal à environ 32 ° C pendant 24 heures.
- Les animaux sont contrôlés régulièrement pour la respiration spontanée et leur état général durant les premières heures après la chirurgie. Si la tige de cerveau est affecté animaux ont des problèmes respiratoires et doivent être euthanasiés.
- Les animaux sont contrôlés quotidiennement pour leur état général et le poids du corps ainsi que des déficits neurologiques et sensoriels 15.
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Representative Results
Mortalité
Une fois la technique de la chirurgie est maîtrisé la procédure ne provoque pas de mortalité peropératoire. Saignement peut également être réalisé dans pratiquement tous les animaux. La mortalité postopératoire est de 30-40%, la plupart des animaux meurent au jour 1 après la chirurgie (Figure 5).
ICP valeurs après SAH
Le PIC avant la saignée est d'environ 4 mmHg. Saignement des résultats dans une forte augmentation de la PIC à 120 mmHg. Valeurs PIC se stabilisent ensuite à moins de 5 min à environ 30 mmHg (Figure 1). 24 h après la purge du PIC est encore un peu élevé à 10 mmHg 5.
La pression artérielle après SAH
La pression artérielle augmente immédiatement après l'induction (figure 2) des saignements. Cela est dû au réflexe de Cushing, qui est initiée par une PIC élevée.
Perfusion cérébrale après SAH
After le saignement induction une diminution spectaculaire de la perfusion cérébrale peut être contrôlée. Reperfusion à un niveau différent individuellement se produit dans les 5 min après l'agression (Figure 3).
Sang distribue le long de cerveau fournissant les artères et les fissures du cervelet
Nous animaux perfusés 3 h après SAH transcardiaque avec 20 ml d'une solution saline suivi par 20 ml de PFA à 4% refroidi. Le cerveau a été soigneusement enlevé et la distribution du sang dans l'espace sous-arachnoïdien a été observée. Sang distribue le long de l'espace périvasculaire de cerveau fournissant artères vers le cortex dorsal. Dans tous les cas, le sang épanché porté sur la MCA jusqu'à la deuxième ramification. Le côté ipsilatéral à l'hémorragie a été couvert avec plus de sang que l'hémisphère controlatéral (figure 4).
la distribution de sang ne correspond pas avec le PIC hausse
En 5 animaux nous avons examiné si l'augmentation de la PIC d urant SAH a un impact sur la distribution du sang dans l'espace sous-arachnoïdien. Une hypothèse est que les animaux qui montrent une hausse de seulement ICP modérée pendant SAH peut présenter moins de sang extravasé, qui alors ne distribue pas les parties dorsales du cortex. Nous avons constaté que seulement la taille de l'hématome à la base du crâne semble être en corrélation avec l'augmentation du PCI. la distribution de sang le long des artères cérébrales fournir ne différait pas entre les animaux avec des valeurs de pointe PIC.
Figure 1. Valeur ICP après les valeurs HSA. Représentant PIC de 5 animaux après HSA. Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Figure 2. La pression artérielle après SAH. valeurs de la pression artérielle représentatifs de 5 animaux après HSA. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Perfusion cérébrale après SAH. Valeurs du débitmètre Doppler laser représentatifs de 5 animaux après HSA. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. la distribution de sang le long de cerveau fournissant artères. Représentant dist de sangribution de 5 animaux après HSA. Les lignes rouges indiquent la distribution de sang le long de cerveau fournissant artères. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 5. Courbe de survie après la courbe SAH. Survie suivant SEP dans 49 mâles C57BL / 6. Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
Les options de traitement après HSA sont rares et la plupart du temps inefficaces. Par conséquent, la physiopathologie de lésions cérébrales post-hémorragique doit encore être compris afin d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Standardisés et des modèles animaux et reproductibles chez les animaux génétiquement modifiés, à savoir les souris, sont cruciales pour ces enquêtes. Le modèle CWP est devenu un modèle largement utilisé pour SAH comme elle ressemble beaucoup à la physiopathologie chez l'homme, mais son utilisation chez la souris est entravée par une faible reproductibilité et une variabilité interpersonnelle élevé. Les variations du modèle sont causées par des protocoles anesthésiques différents, qui modifient les conditions physiologiques. La quantité de sang varie entre les animaux du fait de la réactivité du vaisseau, la pression artérielle et des différences de coagulation 12. Ainsi, il est important de surveiller les conditions physiologiques tout au long de la procédure et d'établir des protocoles chirurgicaux et de surveillance qui permettent de réduire la variability de ce modèle.
la distribution de sang après SAH peut être différente entre les espèces. Dans le sang de modèle de rat semble être distribués de manière égale entre les deux hémisphères cérébraux 6. Comme le cerveau humain montrent une architecture gyrencephalic le sang est susceptible de distribuer principalement le long des sillons cerveau et pas principalement le long des vaisseaux. D'autre part, la fourniture des artères cérébrales dirigées dans ces sillons, par exemple la MCA dans le sillon latéral. Ainsi, les pathologies vasculaires peuvent être similaires dans les modèles animaux de rongeurs et le cerveau humain.
Dans notre laboratoire, nous utilisons une combinaison de fentanyl, la médétomidine et midazolam, comme décrit ci-dessus pour l'anesthésie chirurgicale. Cette combinaison a un effet relativement faible sur la pression artérielle et la réactivité navire 11. En revanche, l'isoflurane, un anesthésique largement utilisé dans la recherche SAH, conduit à une vasodilatation périphérique, l'autorégulation cérébrale sévèrement altérée 13, et une pression artérielle basse immédiatement à l'arrièreer SEP 12, les résultats qui ne sont pas régulièrement associés à la physiopathologie début de SEP chez les humains. Par conséquent, l'utilisation d'un protocole d'anesthésie qui ne perturbe pas la physiopathologie post-hémorragique est une condition préalable importante pour un modèle de SEP expérimental valide.
La quantité de sang dépend de la lésion du vaisseau et elle varie donc avec la taille du filament 14. Une autre étape essentielle du modèle est le retrait du filament après perforation du vaisseau. La circulation du sang dans le ICA est perturbé par le filament et un retrait retard peut entraîner dans les petites hémorragies. En conséquence, il est crucial de normaliser le temps entre la perforation de la cuve et le retrait du filament. Ceci est bien sûr possible que si le point de perforation du vaisseau de temps peut être déterminée avec une grande précision temporelle. Dans notre configuration ceci est réalisé par une mesure en continu de l'ICP. Une forte augmentation de la PIC indique réussie perforation de la cuve et permet ainsi la standardization de retrait du filament et de l'intensité des saignements donc. De plus, la perforation de la cuve ICP-contrôlée empêche que le filament est avancé trop loin empêchant ainsi les dommages du tissu cérébral. En conséquence, la mesure en continu ICP est une excellente technique pour minimiser la variabilité du modèle murin de SAH.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
La recherche actuelle est financé par la Fondation de recherche Solorz-Zak.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| operation microscope | Leica | KL2500 | |
| isoflurane vaporizer | Harvard Instruments | Continuous Flow Vaporizer | |
| respirator | Hugo Sachs | Minivent 845 | |
| microcapnograph | Hugo Sachs | Type 340 | |
| temperature controller | FHC | DC Temperature Controller | |
| dental drill | Paggen | Labset- N | |
| ICP monitor | Codman | ICP monitor | |
| blood pressure monitor | AD Instruments | Bridge Amp FE221 | |
| syringe pump | World Precision Instruments | SP101IZ | |
| pulsoximeter | Kent Scientific | MouseSTAT | |
| LDF | Perimed | Periflux 5000 | |
| analog data monitor | AD Instruments | Power Lab 16/35 | |
| Material | |||
| cement for ICP probe fixation | Speiko | Carboxylate cement | |
| glue for LDF probe fixation | Bob Smith Industries | Cyanoacrylate glue (Maxi Cure and Insta Set) | |
| venous catheter | Johnson Johnson | Jelco winged i.v. catheter; REF 4076 | modified intubation tube |
| tubing for femoral catheter | Smiths Medical | Fine Bore Polythene Tubing; ID 0.28 mm OD 0.61 mm; REF 800/100/100 | cut to 30 cm length |
| filament for vessel perforation | Ethicon | Prolene 5-0 | cut to 12 mm length |
| surgical equipment | Fine Scientific Instruments | forceps medical #5, vessel scissors 8 cm, microclip 4 mm jaw | |
References
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