Summary
Стандартная модель мыши из субарахноидального кровоизлияния по внутрипросветной Круга Уиллиса перфорации описывается. Судно перфорация и субарахноидальное кровотечение контролируются мониторинга внутричерепного давления. Кроме того различные жизненные параметры регистрируется и контролируется для поддержания физиологических условиях.
Abstract
В этом видео-публикации представлен стандартизированный модель мыши субарахноидального кровоизлияния (САК). Кровотечение индуцируется эндоваскулярной Круга Уиллиса перфорации (ХВО) и доказано внутричерепного давления (ВЧД) мониторинга. Таким образом равномерное распределение крови в субарахноидальных пространств, окружающих артериальное кровообращение и мозжечка трещин достигается. Физиологии животных поддерживается интубации, искусственной вентиляции легких, и непрерывного оперативного мониторинга различных физиологических и сердечно-сосудистых параметров: температуры тела, системного артериального давления, частоты сердечных сокращений, и насыщения гемоглобина. Тем самым церебральное перфузионное давление может быть плотно контролируется в результате чего меньше переменного объема из сосудов кровью. Это позволяет лучше стандартизации эндоваскулярной перфорации накаливания у мышей и делает вся модель высоковоспроизводимым. Таким образом, легко доступны для фармакологических и патофизиологических исследований в дикого типа и генетическийлы изменены мышей.
Introduction
САК является инсульт подтип с наименьшим полезного результата для пациентов: 40% пациентов умирают в течение месяца после кровотечения 1 и выжившие редко имеют клинически благоприятный исход.
Подавляющее большинство спонтанных SAHS (80%) обусловлены разрывом внутричерепных аневризм, которые в основном расположены вдоль передней и задней соединительной артерии, основной артерии и средней мозговой артерии (MCA) 2.
Такие аневризмы трудно смоделировать на животных, и поэтому животные модели САК либо выполняется путем инъекции крови в субарахноидальное пространство / желудочки мозга или эндоваскулярного перфорации субарахноидального судна.
Аутологичная инъекции крови в цистерны не легко выполнить и воспроизводимым как объем крови можно управлять напрямую 3. К сожалению, некоторые аспекты патофизиологии САК, напримертравмы сосуда, не могут быть смоделированы с помощью этой процедуры. Другой технический подход для индукции САК является открытие интрацистернального вены 4.
Тем не менее, внутрипросветный НВП в филиале MCA-видимому, является процедура, которая моделирует патофизиологии у человека наиболее тесно 5. Этот метод был разработан и впервые описана у крыс Бедерсон и его коллегами и в то же время по Veelken и его коллеги 6,7. Позже внутрипросветный модель перфорация была адаптирована к мышей 8,9. Нить вставляется в наружной сонной артерии (ЭКА) и вышла в основания черепа через внутренней сонной артерии (ВСА). В точки ответвления MCA нить прокалывает сосуд и вызывает кровотечение в субарахноидальное пространство в основании черепа. Кровь затем распределяет в оставшееся субарахноидальное пространство вдоль трещин и кровеносных сосудов. Кровотечение останавливают тромба в месте перфорации, но rebleedings, белыйICH часто вредно у пациентов 10, может произойти. Соответственно, эндоваскулярные модель нить стал широко используется модель SAH в течение последних нескольких лет. Наиболее часто упоминаемый недостаток модели накаливания перфорации является то, что кровотечение том не может быть непосредственным контролем и поэтому может быть переменной. Эта изменчивость может значительно сократится на жестком контроле физиологии животных и постгемморагической ПМС.
Мыши имеют большое преимущество, что большое количество генетически модифицированных штаммов которые доступны. Однако из-за их малого размера хирургические процедуры имеют тенденцию быть более сложным, чем в более крупных видов, например, крыс и кроликов. Поэтому уменьшение масштаба методов, разработанных для крыс до мышей часто не приводит к желаемым результатам, например, как мыши имеют очень ограниченный вес тела и объем крови неинвазивные методы для кровяного давления и газового анализа крови, а также для насыщения гемоглобина и мониторинга сердечного ритмадолжны применяться, когда это возможно. Соответственно, цель текущей публикации является описание перфорации модель нити для САК у мышей и чтобы показать, как эта модель может быть выполнена в стандартном и высоко воспроизводимым образом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все хирургические процедуры были подвергнуты этической экспертизы и утвержден правительством Верхней Баварии (справочный номер: 55.2-1-54-2532.3-13-13 и -2532-136-11). Животные мужчины мышей C57BL / 6 с массой тела около 25 г.
1. Подготовка животных
- Анестезии, поставив курсор в камеру. Промойте камеру с 5% изофлуран, пока животное не теряет сознание.
- Введите предварительно смешанные анестетики внутрибрюшинно: фентанил (0,05 мг / кг), мидазолам (5 мг / кг) и медетомидин (0,5 мг / кг). Проверьте рефлексы до и регулярно во время процедуры. Инжектируем треть от первоначальной суммы почасовая для поддержания анестезии.
- Интубировать orotracheally с трубкой, изготовленной из 20 г венозный катетер 11. Для интубации зафиксировать животное на наклонной платформе (30 °), убрать язык с согнутыми щипцов, визуализировать голосовые связки под операционным микроскопом и вставить трубку в трахеюво время вдоха.
- Наведите в положении лежа и проверить правильное размещение трубки с кусочком ваты или microcapnograph.
- Подключите интубации трубку к респиратора. Вентиляцию мышь комнатным воздухом с добавлением 25% кислорода с частотой 180-220 вдохов / мин и ударного объема 200-250 мкл.
- Подключите интубации трубку к microcapnograph. Поддерживать в конце выдоха рСО 2 на 30 мм рт.ст., регулируя частоту вентиляции.
- Вставьте ректальное датчик температуры и поместите животное на грелку для поддержания 37 ° C температуры тела.
- Применение кольцевой датчик пульсоксиметр на правую заднюю лапу.
- Откройте над череп с ножницами кожу. Разрез должен быть примерно 0,5 см в длину и между ухом и глазом.
- Проанализируйте левой височной мышцы с помощью скальпеля от височной кости.
- Приклейте лазерного доплеровского расходомера (СОЛ) зонда налевой височной кости. Держите датчик в фиксированном положении, пока клей не затвердеет.
- Просверлите отверстие около 1,5 мм в диаметре с бормашины в левой височной кости. Охладите кость физиологическим раствором, чтобы предотвратить повреждение тепла.
- Вставьте датчик ПМС в полость черепа. Нажимаем вперед, как на спинке, насколько это возможно, чтобы предотвратить мозга повреждение тканей и кровотечение.
- Если зонд находится в правильном положении, исправить, и запечатать его с цементом. Пусть цемента высохнуть в течение 5 мин.
- Переверните мышь тщательно положении лежа на спине.
- Для непрерывного мониторинга артериального давления, катетер в левую бедренную артерию.
- Подключите бедренной катетер с устройством мониторинга артериального давления.
2. САК Индукционная
- Откройте кожу ножницами от грудины до подбородка (2 см). Проанализируйте соединительной ткани прямо и нажмите слюнных желез в сторону.
- Expose левую общую сонную артерию (CCA) и мобилизовать его. Заповедникблуждающий нерв, который проходит в том же соединительной ткани оболочки как ОСО. Перемещение черепной и разоблачить и мобилизовать ICA и ЭКА, используя ту же технику.
- Лигируют ЭКА насколько краниально, насколько это возможно.
- Заранее планировать еще два лигирования для нити вокруг ЭКА.
- Закупоривать ОСО и МКА временно с microclips. Расположите microclips с microclip аппликатора. Убедитесь, что зажимы применяются правильно, осторожно потянув их обратно.
- Вырежьте отверстие для вставки накаливания в странах ЕЦА с ножницами сосудов.
- Вставьте нить Prolene 5-0 с длиной 12 мм в ЭКА.
- Закройте место введения с одной заранее определенной перевязки.
- Удалите microclips с microclip аппликатора из ОАС и ВСА.
- Авансовые нить с пинцетом в ICA, пока ПМС не поднимается. Внезапный подъем ПМС указывает индукции кровотечения.
- Немедленно вывести нить и перевязывать ЭКА, закрыв как пр.earranged лигирование подряд. Это предотвращает кровотечение из места введения.
- Шовный рану кожи.
- Монитор физиологические параметры животного течение еще 20 мин.
- Удалить ПМС и LDF зондов и сшивать раны кожи.
3. Конец эксперимента
- Заливать животное транскардиально с 20 мл физиологического раствора (при комнатной температуре), а затем 20 мл 4% PFA в PBS (4 ° C).
- Проанализируйте мозг из черепа. Разрежьте череп в средней линии и между орбитальных полостей. Затем кожуру от кости из мозга.
- Оценить распределение крови в субарахноидальное пространство.
4. Соображения в случае дожития хирургии (не показано на видео)
- Введите Carprofen (4 мг / кг подкожно) для послеоперационного обезболивания непосредственно после индукции анестезии. В послеоперационном периоде наблюдения Carprofen (4 мг / кг подкожно) вводят каждые 24 ч. Вместо измерения инвазивного артериального давления использовать неинвазивный системы мониторинга артериального давления.
- Для прекращения анестезии Inject антагонистической агентов подкожно: налоксон (1,2 мг / кг), флумазенила (0,5 мг / кг) и атипамезол (2,5 мг / кг).
- Экстубации животное.
- После восстановления рефлексов положить животное в предварительно нагретую камеру. Держать животное приблизительно 32 ° С в течение 24 часов.
- Животные регулярно проверяются при самостоятельном дыхании и общего состояния в течение первых часов после операции. Если ствол мозга влияет животные проблемы с дыханием и должны быть умерщвлены.
- Животные проверяются ежедневно для их общего состояния и массы тела, а также для неврологических и сенсорного дефицита 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Смертность
После того, как техника хирургия освоено процедура не вызывает никаких интраоперационной смертности. Также кровотечение может быть достигнуто практически во всех животных. Послеоперационная летальность составляет 30-40% с большинство животных умирает 1 день после операции (рис. 5).
ПМС значения после САК
ПМС до кровотечения составляет около 4 мм рт.ст.. Кровотечение приводит к резкому увеличению ПМС до 120 мм рт. Значения МСП затем стабилизируется в течение 5 мин при примерно 30 мм рт.ст. (рис. 1). В 24 часов после кровотечения ПМС до сих пор слегка повышенной до 10 мм рт.ст. 5.
Кровяное давление после САК
Артериальное давление повышается сразу после кровотечения индукции (рис. 2). Это связано с рефлекса Кушинга, которая инициируется повышенной ПМС.
Церебральный перфузии после САК
Миндукции кровотечения тер резкое снижение перфузии головного мозга можно контролировать. Реперфузия к индивидуально разного уровня происходит в течение 5 мин после инсульта (рис. 3).
Кровь распределяет по мозга поставки артерий и мозжечка трещин
Мы перфузии Животные 3 ч после САК транскардиально с 20 мл физиологического раствора с последующим 20 мл охлажденной 4% PFA. Мозг осторожно удаляли и наблюдалось распределение крови в субарахноидальное пространство. Кровь распределяет по периваскулярной пространстве мозга поставки артерий к спинной мозга. Во всех случаях излившейся крови покрыли MCA до второй разветвления. Боковая ипсилатеральная к кровоизлияния была покрыта больше крови, чем контралатерального полушария (рис. 4).
Распределение крови не коррелирует с ростом ПМС
В 5 животных мы исследовали, может ли рост МСП г о время САК оказывает влияние на распределение крови в субарахноидальное пространство. Одна из гипотез было то, что животные, которые показывают только умеренный рост МСП во САК может проявлять меньше излившейся крови, которая затем не распространять в спинных частях мозга. Мы обнаружили, что только размер гематомы у основания черепа кажется, коррелируют с ростом ПМС. Распределение крови вдоль мозга поставки артерий не отличались от животных с различными пиковыми значениями ПМС.
Рисунок 1. Значение МСП после значений САК. Представитель МСП по 5 животных после САК. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
pload/50845/50845fig2.jpg "ширина =" 600px "/>
Рисунок 2. Кровяное давление после САК. Представительства значениях кровяного давления у 5 животных после САК. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Церебральный перфузии после САК. Представительства лазерных доплеровских расходомеров значений 5 животных после САК. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Распределение крови наряду мозга поставки артерий. Представитель расстояние кровиribution из 5 животных после САК. Красные линии обозначают распределение крови вдоль мозга поставки артерий. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 5. Кривая выживания после кривой САК. Выживаемость после САК в 49 мужских мышей C57BL / 6. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Варианты лечения после САК не хватает, а в основном неэффективными. Поэтому патофизиология постгемморагической повреждения головного мозга необходимо также понимать, с тем чтобы определить новые терапевтические цели и развития новых терапевтических подходов. Стандартизован и хорошо воспроизводимые модели на животных в генетически модифицированных животных, то есть мышей, имеют решающее значение для таких исследований. Модель НВП стала широко используется модель для САК, как это напоминает патофизиологии у человека тесно, однако его использование в мышей затрудняется низкой воспроизводимости и высокой межличностного изменчивости. Вариации модели вызваны различными протоколами анестезии, которые изменяют физиологические условия. Количество кровотечения варьируется от животных из-за сосуда реактивности, кровяного давления и различий коагуляции 12. При этом важно следить за физиологические условия на протяжении всей процедуры и установить хирургические и мониторинга протоколов, которые уменьшают ваriability этой модели.
Распределение крови после САК может отличаться у разных видов. В крыса модели крови, кажется, равномерно распределяется на оба полушария головного мозга 6. Как человеческий мозг показать gyrencephalic архитектуру кровь, вероятно, распространять главным образом вдоль мозга борозд, а не преимущественно вдоль сосудов. С другой стороны, мозг подачи артерии работают в тех борозд например MCA в боковой борозды. Таким образом патологий сосудов могут быть сходными в животных моделях грызунов и человеческого мозга.
В нашей лаборатории мы использовать сочетание фентанила, медетомидина и мидазолама, как описано выше для хирургической анестезии. Эта комбинация имеет относительно небольшой эффект на кровяное давление и реакционной емкости 11. В противоположность этому, изофлураном, широко используется обезболивающий в исследовании САК, приводит к периферической вазодилатации, тяжелыми нарушениями мозговой саморегуляции 13, и низкое кровяное давление сразу на кормеэ САК 12, выводы, которые не регулярно, связанные с ранней патофизиологии САК в организме человека. Таким образом, использование анестезирующего протокола, который не нарушает постгеморрагической патофизиологии является важной предпосылкой для действительного экспериментальной модели САК.
Количество выделений зависит от поражения сосудов и, следовательно, зависит от размера нити 14. Другим важным шагом модели является вывод нити после сосуда перфорации. Кровоток в МКА нарушается нити и задерживается вывод может привести к уменьшению кровотечений. Соответственно, очень важно, чтобы стандартизировать время между перфорацией судна и снятия накаливания. Это, конечно, возможно только, если время точка сосуда перфорации могут быть определены с высоким временным точностью. В нашей установке это достигается путем непрерывного измерения ПМС. Резкое увеличение ПМС указывает на успешное перфорации сосудов и позволяет тем самым standardizatioн о выходе нитей и, следовательно, интенсивности кровотечения. Кроме того, МСП-контролируемых перфорация судно предотвращает что нить расширенный слишком далеко тем самым предотвращая мозга повреждение тканей. Соответственно, непрерывное измерение ПМС отличной техникой, чтобы минимизировать изменчивость мышиной модели САК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Настоящее исследование финансируется исследовательский фонд Solorz-Zak.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| operation microscope | Leica | KL2500 | |
| isoflurane vaporizer | Harvard Instruments | Continuous Flow Vaporizer | |
| respirator | Hugo Sachs | Minivent 845 | |
| microcapnograph | Hugo Sachs | Type 340 | |
| temperature controller | FHC | DC Temperature Controller | |
| dental drill | Paggen | Labset- N | |
| ICP monitor | Codman | ICP monitor | |
| blood pressure monitor | AD Instruments | Bridge Amp FE221 | |
| syringe pump | World Precision Instruments | SP101IZ | |
| pulsoximeter | Kent Scientific | MouseSTAT | |
| LDF | Perimed | Periflux 5000 | |
| analog data monitor | AD Instruments | Power Lab 16/35 | |
| Material | |||
| cement for ICP probe fixation | Speiko | Carboxylate cement | |
| glue for LDF probe fixation | Bob Smith Industries | Cyanoacrylate glue (Maxi Cure and Insta Set) | |
| venous catheter | Johnson Johnson | Jelco winged i.v. catheter; REF 4076 | modified intubation tube |
| tubing for femoral catheter | Smiths Medical | Fine Bore Polythene Tubing; ID 0.28 mm OD 0.61 mm; REF 800/100/100 | cut to 30 cm length |
| filament for vessel perforation | Ethicon | Prolene 5-0 | cut to 12 mm length |
| surgical equipment | Fine Scientific Instruments | forceps medical #5, vessel scissors 8 cm, microclip 4 mm jaw | |
References
- Cahill, J., Zhang, J. H. Subarachnoid hemorrhage: is it time for a new direction. Stroke. 40, 86-87 (2009).
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369, 306-318 (2007).
- Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. J. Neurosci. Methods. 123, 89-97 (2003).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J. Neurosci. Methods. 183, 136-140 (2009).
- Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. J. Neurosci. Methods. 190, 164-170 (2010).
- Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
- Veelken, J. A., Laing, R. J., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26, 1279-1283 (1995).
- Kamii, H., et al. Amelioration of vasospasm after subarachnoid hemorrhage in transgenic mice overexpressing CuZn-superoxide dismutase. Stroke. 30, 867-871 (1999).
- Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurol. Res. 24, 510-516 (2002).
- Broderick, J. P., Brott, T. G., Duldner, J. E., Tomsick, T., Leach, A. Initial and recurrent bleeding are the major causes of death following subarachnoid hemorrhage. Stroke. 25, 1342-1347 (1994).
- Thal, S. C., Plesnila, N. Non-invasive intraoperative monitoring of blood pressure and arterial pCO2 during surgical anesthesia in mice. J. Neurosci. Methods. 159, 261-267 (2007).
- Hockel, K., Trabold, R., Scholler, K., Torok, E., Plesnila, N. Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats. Exp. Transl. Stroke Med. 4, 5 (2012).
- Wang, Z., Schuler, B., Vogel, O., Arras, M., Vogel, J. What is the optimal anesthetic protocol for measurements of cerebral autoregulation in spontaneously breathing mice? Exp. Brain Res. 207, 249-258 (2010).
- Schwartz, A. Y., Masago, A., Sehba, F. A., Bederson, J. B. Experimental models of subarachnoid hemorrhage in the rat: a refinement of the endovascular filament model. J. Neurosci. Methods. 96, 161-167 (2000).
- Feiler, S., Plesnila, N., Thal, S. C., Zausinger, S., Scholler, K. Contribution of matrix metalloproteinase-9 to cerebral edema and functional outcome following experimental subarachnoid hemorrhage. Cerebrovasc. Dis. 32, 289-295 (2011).
