Summary
La ecocardiografía se utiliza comúnmente para caracterizar y cuantificar de forma no invasiva los cambios en la estructura y función cardíaca. Describimos un algoritmo de imagen ultrasonido-basado que ofrece una medida sustituta mejorada de microestructura del miocardio y se puede realizar usando el software de análisis de imagen de acceso abierto.
Abstract
La ecocardiografía es una modalidad ampliamente accesible de la proyección de imagen que se utiliza comúnmente para caracterizar y para cuantificar no invasor cambios en estructura y la función cardiacas. Las evaluaciones ultrasónicas del tejido cardíaco pueden incluir análisis de la intensidad de la señal de retrospersión dentro de una región determinada de interés. Las técnicas previamente establecidas se han basado predominantemente en el valor integrado o medio de las intensidades de la señal de retrospersión, que pueden ser susceptibles a la variabilidad de los datos con alias de velocidades de fotogramas bajas y los retrasos de tiempo para los algoritmos basados en la variación cíclica. Adjunto, describimos un algoritmo ultrasonido-basado de la proyección de imagen que extiende de métodos anteriores, se puede aplicar a un solo marco de la imagen y explica la distribución completa de los valores de la intensidad de la señal derivados de una muestra del miocardio dada. Cuando se aplica a datos representativos de imágenes de ratones y humanos, el algoritmo distingue entre sujetos con y sin exposición a la resistencia crónica a la poscarga. El algoritmo ofrece una medida sustituta mejorada de la microestructura miocárdica y se puede realizar utilizando un software de análisis de imágenes de acceso abierto.
Introduction
La ecocardiografía es una modalidad ampliamente accesible de la proyección de imagen que se utiliza comúnmente para caracterizar y para cuantificar no invasor cambios en estructura y la función cardiacas. Las evaluaciones ultrasónicas del tejido cardíaco pueden incluir análisis de la intensidad de la señal de retrospersión dentro de una región dada de interés en un solo punto en el tiempo, así como a lo largo del ciclo cardíaco. Estudios previos han sugerido que las medidas de intensidad de la señal sonográfica pueden identificar la presencia subyacente de desorden de la fibra miocárdica, tejido miocárdico viable versus no viable, y fibrosis intersticial1-3. Nos referimos a la 'microestructura' miocárdica como la arquitectura tisular que se puede caracterizar, mediante análisis sonográfico, más allá de las mediciones lineales de tamaño bruto y morfología. En consecuencia, se han utilizado análisis de la intensidad de la señal sonográfica para evaluar las alteraciones microestructurales del tejido miocárdico en el contexto de la miocardiopatía hipertrófica y dilatada4,5,la enfermedad arterial coronaria crónica6,7y la cardiopatía hipertensiva8,9. Sin embargo, las técnicas previamente establecidas se han basado predominantemente en el valor integrado o medio de las intensidades de la señal de retrospersión, que pueden ser susceptibles a la variabilidad del ruido aleatorio5,los datos con alias de velocidades de fotogramas bajas10,y los retrasos de tiempo para los algoritmos basados en la variación cíclica11.
Adjunto, describimos el método de usar un algoritmo ultrasonido-basado del análisis de la imagen que extienda de métodos anteriores; este algoritmo se centra en un único marco diastólico final para el análisis de imágenes y explica la distribución completa de los valores de intensidad de la señal derivados de una muestra miocárdica dada. Mediante el uso del pericardio como referencia en el marco12,13,el algoritmo cuantifica de forma reproducible la variación en las distribuciones de intensidad de la señal sonográfica y ofrece una medida sustitutiva mejorada de la microestructura miocárdica. En un protocolo paso a paso, describimos métodos para preparar imágenes para su uso, muestrear regiones de interés y procesar datos dentro de regiones seleccionadas de interés. También mostramos resultados representativos de la aplicación del algoritmo a imágenes ecocardiográficas adquiridas de ratones y seres humanos con exposición variable a la tensión de poscarga en el ventrículo izquierdo.
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Protocol
1. Preparación de imágenes para análisis
- Obtenga imágenes ecocardiográficas murinas o humanas en modo B en la vista paraesternal de eje largo. Ajuste la configuración de compensación de ganancia de tiempo y la colocación del enfoque de transmisión para optimizar la visualización del VI y otras estructuras cardíacas en la vista paraesternal, según la práctica habitual. Asegúrese de que todas las imágenes se guardan en formato de archivo DICOM. Las vistas estandarizadas de la imagen colocan la pared ventricular izquierda inferolateral en la base del marco. Los marcos deben mostrar la totalidad del miocardio y el pericardio del ventrículo izquierdo. La resolución debe ser lo suficientemente alta como para demarcar el borde pericárdico, la pared miocárdica y el borde endocárdico del ventrículo izquierdo. Descartar imágenes con exceso de abandono o artefactos de imagen.
- Importe un archivo de imagen para su análisis en la plataforma de software ImageJ v1.46 como un archivo DICOM. Convierta el archivo en un archivo de imagen de 8 bits.
- Desplácese a través de fotogramas consecutivos del ciclo cardíaco hasta alcanzar un marco diastólico final de calidad adecuada. Como alternativa, seleccione el marco diastólico final en un programa de visualización ecocardiográfica y, a continuación, exporte a un formato de archivo de .jpg de alta resolución para su uso en ImageJ. Identifique las tramas más cercanas a la diástole final utilizando la onda R del trazado de ECG y, a continuación, identifique la mejor trama que capture el LV con la dimensión interna máxima. Considere este marco único el marco diastólico final.
- Se sugiere que los usuarios se cegarán a la identidad del sujeto al seleccionar las regiones de interés.
2. Muestreo de ROI
- Selección de referencia pericárquica. Al seleccionar la región pericárcica de interés (ROI), trate de capturar la heterogeneidad del tejido pericárquio. Tenga en cuenta que el brillo y el contraste de la imagen se pueden ajustar para la selección del ROI, según sea necesario, sin ningún efecto en los resultados del análisis.
- Usando la herramienta de dibujo de rectángulo de ImageJ, seleccione un rectángulo con longitud que se aproxime al tercio medio de la pared pericárquica inferolateral basal.
- Cambie el tamaño del ROI rectangular para abarcar el ancho del pericardio utilizando la herramienta de dimensionamiento del ROI.
- Gire el ROI para que se encuentra dentro de la región pericárquica utilizando la herramienta de rotación de ImageJ.
- Realice los ajustes necesarios en las esquinas del ROI pericárquica. Capturar una región pericárdica final de interés que se encuentra dentro del tercio medio de la pared pericárdica, e incluye el ancho de la pared pericárdica sin extenderse hacia las regiones miocárdicas o extra-cardíacas. Trate de capturar la misma ubicación relativa y el mismo porcentaje del área pericárcica total para todas las medidas realizadas en un estudio determinado.
- Aplique el algoritmo a la selección a través de las herramientas de análisis de ImageJ (consulte la sección 3).
- Selección miocárdica. Una vez más, trate de capturar la heterogeneidad del tejido miocárdico dentro del tercio medio de la pared miocárdica inferolateral basal. Tenga en cuenta que el brillo y el contraste de la imagen se pueden ajustar para la selección del ROI, según sea necesario, sin ningún efecto en los resultados del análisis.
- Seleccione un rectángulo que abarque el ancho de la pared miocárdica, excluyendo el endocardio y el epicardio. Asegúrese de que la selección miocárdica se encuentra adyacente a la selección pericárdica y en el mismo ángulo theta. No incluya áreas del músculo papilar dentro del área de selección.
- Rotar el ROI miocárdico de tal manera que se encuentre paralelo a la selección pericárdica.
- Haga los ajustes necesarios en las esquinas del ROI miocárdico. Aísle una región miocárdica final de interés que se encuentre dentro del tercio medio de la pared miocárdica y capture el ancho de la pared sin extenderse a las regiones pericárdicas o intraluminales.
- Aplique el algoritmo a la selección a través de una macro ImageJ.
3. Análisis y procesamiento de datos
- Instale la macro ImageJ llamada "getHistogramValues.txt".
- Utilice la herramienta de análisis de histograma ImageJ para obtener una vista previa de la distribución de los valores de intensidad de la señal dentro del ROI (realice este paso para la selección pericárdica y para la selección miocárdica).
- Utilice la macro ImageJ para registrar estos valores de densidad de señal para el ROI (realice este paso para la selección pericárdica y para la selección miocárdica).
- Asigne un valor de intensidad de 0 (más oscuro) a 255 unidades (más brillantes) a cada píxel dentro de la selección.
- Organice los valores de intensidad jerárquicamente, en orden de intensidad creciente, para producir una distribución de la intensidad de la señal.
- Seleccione e informe de los siguientes valores de percentiles para la distribución: percentil 20, percentil 50 (mediana) y percentil80.
- Normalizar las intensidades miocárdicas utilizando la referencia pericárdica.
- Normalizar dividiendo los valores de intensidad del percentil miocárdico por los correspondientes valores de percentiles pericárdicos de intensidad12,o restando el valor del percentil miocárdico de intensidad del valor percentil pericárdico de intensidad13.
- Reportar valores para los cuatro métodos analíticos: valores normalizados de miocardio a pericárdico para el percentil 20, percentil 50 (mediana) y 80percentil.
4. Cuantificación de la variabilidad cíclica
- Aplicar algoritmo a selecciones miocárdicas a través de marcos consecutivos del archivo DICOM, moviéndose a través del ciclo cardíaco. Compare las diferencias en las distribuciones de intensidad entre fotogramas, prestando atención a los fotogramas sistólicos y diastólicos finales.
Todos los análisis de imágenes descritos anteriormente se realizan fuera de línea en imágenes ecocardiográficas no invasivas previamente adquiridas y almacenadas digitalmente en formato DICOM. Todos los protocolos del estudio fueron aprobados por la junta de revisión institucional de Brigham and Women y el Comité institucional de cuidado y uso de animales del Área Médica de Harvard.
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Representative Results
El análisis de la intensidad de la señal se realiza en 4 pasos principales(Figura 1),que incluyen: 1) selección y formato de imágenes, 2) roi de muestreo y áreas de referencia, 3) aplicación de algoritmos y 4) procesamiento de valores finales para producir relaciones de intensidad miocárdica a pericárdica. La selección y el tamaño del ROI están estandarizados para limitar la variabilidad interusuario e intrausuario (Figura 2). El posicionamiento de cada ROI también está estandarizado con respecto a las estructuras anatómicas de cada sujeto para limitar la variabilidad intersubjetiva e intrasujetiva.
Como medida de la densidad miocárdica, se espera que el algoritmo revele cambios en la intensidad de la señal a lo largo del ciclo cardíaco, correspondientes al aumento anticipado de la densidad miocárdica en la sístole en comparación con la diástole. Como se muestra en la Figura 3,los valores percentiles más altos de la intensidad de la señal acentúan la variabilidad cíclica en ratones con y sin 7 semanas de exposición a la resistencia a la poscarga(es decir, un ratón que se sometió a constricción aórtica ascendente en comparación con un ratón de control de vehículo que se sometió a una cirugía simulada).
A partir del análisis de un único marco diastólico final(Figura 4),también se observan diferencias significativas tanto para los sujetos de ratón como para los humanos expuestos al estrés crónico de poscarga (casos) en comparación con sus homólogos representativos (controles). Tanto el rango como la magnitud de la intensidad de la señal difieren entre los casos y los controles. Como se observa en los análisis de la variabilidad cíclica, los valores de percentiles 80º en comparación con los 50º dentro de cada distribución de intensidad de señal sugieren una mayor diferencia relativa en la intensidad de la señal entre los casos y los controles.
El algoritmo aquí presentado proporciona una salida en forma de relaciones miocárdicas a pericárdicas de intensidad de la señal, donde los valores pericárdicos sirven como referente en el marco (Figura 5). La relación de intensidad de la señal miocárdica a pericárdica se determinó con base en el análisis de un solo fotograma de imágenes adquiridas a partir de controles representativos y casos de estrés postcarga. De acuerdo con los resultados anteriores, la relación miocardio-pericárdica de los valores de intensidad de la señal delpercentil 80 ofrece la mayor capacidad para diferenciar entre controles y casos. Las diferencias esperadas en la microestructura miocárdica, basadas en los resultados de nuestro análisis de imágenes, fueron consistentes con los hallazgos de la histología de tejido miocárdico en ratones control y de caso a las 7 semanas siguientes a la cirugía simulada o de bandas aórticas, respectivamente (Figura 6).
Figura 1. Proceso de flujo de trabajo para una imagen individual. El proceso incluye cuatro pasos principales que pueden repetirse al comparar sujetos o al cuantificar la variabilidad cíclica.
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Figura 2. Técnica de muestreo de región de interés (ROI). El algoritmo de análisis de imágenes está estandarizado para su aplicación en ratones (A) y en humanos (B). Se muestran selecciones miocárdicas y pericárdicas para imágenes representativas de ratón y humanas, respectivamente.
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Figura 3. Variación de la intensidad de la señal sonográfica a lo largo del ciclo cardíaco. El algoritmo se aplicó a una región miocárdica de interés sobre fotogramas consecutivos de imágenes DICOM adquiridas de un ratón control representativo(A)y un ratón con bandas aórticas(B). La velocidad de fotogramas fue de 212 para ambas imágenes. Para estas imágenes, la variabilidad cíclica se evaluó utilizando 3 puntos de corte: percentil 20 (diamante), percentil 50 (cuadrado) y percentil80 (triángulo). La variabilidad cíclica relativa es mayor para los valores delpercentil 80 que para los valores de punto de corte más bajos. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 4. Las distribuciones de intensidad de la señal se muestran a partir del análisis de un solo fotograma de imágenes representativas de ratón y humanos. Los histogramas muestran distribuciones de intensidad de señal derivadas del miocardio de un ratón control a las 7 semanas después de la cirugía simulada(A),un ratón con bandas aórticas a las 7 semanas después de la cirugía(B),un humano normotenso(C),y un humano hipertenso(D). Las líneas verticales azules denotan valores depercentil 20,percentil 50 ypercentil 80. Las distribuciones de la intensidad de la señal se desplazan a la derecha, y son más grandes en rango, para los sujetos con estrés crónico de poscarga(es decir, con bandas aórticas en comparación con el ratón control, e hipertenso en comparación con el ser humano normotenso).
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Figura 5. Datos representativos producidos por el algoritmo de análisis de imágenes. (A)muestra los datos de un ratón operado con simulacro (control) en comparación con el ratón con bandas aórticas (caso) a las 7 semanas. (B)muestra datos de un ser humano con presión arterial normal (control) en comparación con un humano con hipertensión crónica (caso). El cociente de la intensidad del miocardio-a-pericardial de la señal fue determinado usando 3 métodos analíticos dentro del algoritmo: ratio de los valores del percentil 20; relación de valores depercentiles 50; y relación de valores depercentiles 80. La mayor diferencia entre los controles y los casos se demuestra mediante el uso de relaciones de los valores delpercentil 80 de la intensidad de la señal.
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Figura 6. Diferencias en la histología del tejido miocárdico entre ratones con y sin exposición al estrés poscarga. Las secciones teñidas tricromáticas del ventrículo izquierdo del representante Masson se muestran para un ratón que se sometió a una cirugía simulada(A:control) y un ratón que se sometió a bandas aórticas(B:caso) a las 7 semanas después de la cirugía. Las secciones muestran la presencia de deposición substancial del colágeno y de fibrosis intersticial en el caso comparado al control. Las barras de escala representan 50 μm.
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Discussion
Describimos el protocolo para un algoritmo del análisis de la imagen que cuantifique la distribución sonográfica de la intensidad de la señal y, a su vez, ofrezca una medida sustituta de la microestructura del miocardio. Las características estandarizadas del protocolo, incluida la selección, el tamaño y el posicionamiento del ROI y la región de referencia, sirven para minimizar la variabilidad basada en el usuario y el sujeto. Se demuestra que cuando se aplica a las imágenes ecocardiográficas de un solo marco diastólicas finales, el algoritmo puede distinguir adecuadamente entre el miocardio normal frente al miocardio expuesto a la tensión de poscarga.
El protocolo detalla cómo se puede emplear el algoritmo utilizando el paquete de software ImageJ de código abierto. Dentro de este entorno de análisis de imágenes, el algoritmo se puede utilizar para producir datos sobre la distribución de los valores de intensidad de la señal de una muestra de tejido miocárdico dada. Las distribuciones de intensidad de señal resultantes se pueden mostrar en forma de histogramas. Los histogramas de los valores de intensidad dentro de las selecciones miocárdicas muestran que los tejidos miocárdicos enfermos demuestran un cambio correcto en la distribución y un mayor rango de valores, en comparación con el miocardio no diseasado. Este patrón se observa cuando el algoritmo se aplica a imágenes ecocardiográficas humanas y murinas.
Se observa que la variabilidad en la intensidad de la señal a lo largo del ciclo cardíaco se corresponde con los cambios fisiológicos en la densidad miocárdica. Se cree que un método analítico que distingue consistentemente los cambios de densidad a lo largo del ciclo cardíaco es sensible a las diferencias en la densidad miocárdica que ocurren en respuesta a procesos patológicos1,6. De hecho, la variabilidad cíclica se observa sobre la aplicación del algoritmo a las tramas consecutivas dentro de ecocardiogramas murinos. Se observa una mayor variación en la intensidad a lo largo del ciclo cardíaco para los valores de intensidad de imagen a mayor comparación con los percentiles más bajos dentro de la distribución total de la intensidad de la señal.
Cuando el algoritmo se aplica a muestras representativas de imágenes ecocardiográficas adquiridas de sujetos con y sin exposición a la resistencia a la poscarga, se observa que la densidad de la relación miocardio-pericárdica a valores de percentiles seleccionados es particularmente eficaz para distinguir a los sujetos en comparación con la resistencia a la poscarga crónica. Este hallazgo se observa en análisis de datos representativos de ratones y humanos. Se espera que se vean densidades miocárdicas elevadas en el tejido miocárdico de sujetos expuestos a estrés crónico por poscarga, ya que se sabe que dicho estrés promueve la deposición intersticial de colágeno y el desarrollo de fibrosis miocárdica14. La medida de las alteraciones del tejido del miocardio en un cierto plazo se podría utilizar para proporcionar una mejor comprensión de la respuesta del tejido a la progresión prolongada de la tensión y de la enfermedad. Otros estudios son necesarios evaluar si las variaciones en intensidad de la señal correlacionan con cambios histologic en un cierto plazo así como con la severidad cada vez mayor de un fenotipo dado de la enfermedad.
El algoritmo de análisis de imágenes tiene una aplicabilidad limitada a imágenes con artefactos que interferirían con el ROI y/o la selección de referencias, la visualización incompleta de los bordes endocárdiales o la mala calidad general. Es posible que el algoritmo no pueda comparar con precisión las regiones de interés miocárdicas y pericárdicas cuando los valores de percentiles demuestran un patrón no lineal en el mapeo en escala de grises, o cuando se emplea un rango dinámico insuficiente. Aunque se espera que tales casos sean raros dentro de los 10mos a los 90mos valores del percentil de la intensidad de la señal en la mayoría de los fenotipos, el gravamen preliminar de la linearidad de la retrospersión y del rango dinámico se puede autorizar para estudiar nuevos fenotipos del interés y/o analizar las imágenes adquiridas usando técnicas no convencionales del ultrasonido. El algoritmo también está limitado por la falta de automatización del ROI y el proceso de selección de muestras de referencia. Además, el algoritmo tiene una capacidad limitada para su uso en comparaciones cruzadas de imágenes capturadas utilizando parámetros de adquisición ecocardiográficos marcadamente diferentes. En el informe actual, las imágenes en ratones fueron adquiridas usando un transductor 18-38 megaciclos en las velocidades de fotogramas que se extendían a partir del 225-247 fps; las imágenes en seres humanos fueron adquiridas usando un transductor de 1-5 megaciclos en las velocidades de fotogramas que se extendían a partir del 34-54 fps. Se necesitan estudios adicionales para determinar las posibles revisiones del protocolo que pueden ser necesarias para las imágenes adquiridas utilizando diferentes equipos y a velocidades de fotogramas marcadas en exceso de los rangos reportados anteriormente.
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Disclosures
No se declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Estamos agradecidos por los recursos proporcionados por la Escuela de Medicina de Harvard / Brigham and Women's Hospital Cardiovascular Physiology Core Laboratory. Este trabajo fue apoyado en parte por el financiamiento de las subvenciones hl088533, HL071775, HL093148 y HL099073 (RL) de los Institutos Nacionales de Salud. MB recibió un premio de beca postdoctoral afiliado a la Asociación Americana del Corazón. KU ha recibido un premio de beca postdoctoral afiliado a los fundadores de la Asociación Americana del Corazón. SC fue apoyado por un premio de la Fundación Ellison.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ v 1.46 | NIH (Bethesda, MD) | open access software | |
| Power ShowCase | Trillium Technology (Ann Arbor, MI) | commercial software |
References
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