Summary
L'ecocardiografia è comunemente usata per caratterizzare e quantificare in modo non invasivo i cambiamenti nella struttura e nella funzione cardiaca. Descriviamo un algoritmo di imaging basato su ultrasuoni che offre una misura surrogata migliorata della microstruttura miocardico e può essere eseguito utilizzando un software di analisi delle immagini ad accesso aperto.
Abstract
L'ecocardiografia è una modalità di imaging ampiamente accessibile che è comunemente usata per caratterizzare e quantificare in modo non invasivo i cambiamenti nella struttura e nella funzione cardiaca. Le valutazioni ultrasoniche del tessuto cardiaco possono includere analisi dell'intensità del segnale di backscatter all'interno di una data regione di interesse. Le tecniche precedentemente stabilite si sono basate prevalentemente sul valore integrato o medio delle intensità del segnale backscatter, che possono essere suscettibili alla variabilità dai dati alias da bassi frame rates e ritardi di tempo per gli algoritmi basati sulla variazione ciclica. Nel presente documento, descriviamo un algoritmo di imaging basato su ultrasuoni che si estende dai metodi precedenti, può essere applicato a un singolo fotogramma dell'immagine e rappresenta la distribuzione completa dei valori di intensità del segnale derivati da un dato campione di miocardio. Se applicato a dati rappresentativi di imaging del mouse e dell'uomo, l'algoritmo distingue tra soggetti con e senza esposizione alla resistenza cronica al carico post-carico. L'algoritmo offre una misura surrogata migliorata della microstruttura miocardico e può essere eseguito utilizzando un software di analisi delle immagini ad accesso aperto.
Introduction
L'ecocardiografia è una modalità di imaging ampiamente accessibile che è comunemente usata per caratterizzare e quantificare in modo non invasivo i cambiamenti nella struttura e nella funzione cardiaca. Le valutazioni ultrasoniche del tessuto cardiaco possono includere analisi dell'intensità del segnale di backscatter all'interno di una data regione di interesse in un singolo momento, nonché nel corso del ciclo cardiaco. Studi precedenti hanno suggerito che le misure di intensità del segnale sonografico possono identificare la presenza sottostante di disordine della fibra miocardica, tessuto miocardico vitale contro non vitale e fibrosi interstiziale1-3. Ci riferiamo alla 'microstruttura' miocardico come all'architettura tissutale che può essere caratterizzata, utilizzando l'analisi sonografica, al di là delle misurazioni lineari di dimensioni e morfologia lorde. Di conseguenza, le analisi dell'intensità del segnale sonografico sono state utilizzate per valutare le alterazioni microstrutturali del tessuto miocardico nell'impostazione della cardiomiopatia ipertrofica edilatata 4,5, della malattia coronarica cronica6,7e della cardiopatia ipertensiva8,9. Tuttavia, tecniche precedentemente stabilite si sono basate prevalentemente sul valore integrato o medio delle intensità del segnale backscatter, che possono essere suscettibili alla variabilità dal rumore casuale5, dati aliasati da bassi frame rates10e ritardi di tempo per gli algoritmi basati sulla variazione ciclica11.
Nel presente documento, descriviamo il metodo di utilizzo di un algoritmo di analisi delle immagini basato su ultrasuoni che si estende dai metodi precedenti; questo algoritmo si concentra su un singolo frame end-diastolic per l'analisi delle immagini e rappresenta la distribuzione completa dei valori di intensità del segnale derivati da un dato campione miocardico. Utilizzando il pericardio come riferimento in-frame12,13, l'algoritmo quantifica in modo riproducibile la variazione nelle distribuzioni dell'intensità del segnale sonografico e offre una misura surrogata migliorata della microstruttura miocardica. In un protocollo passo-passo, descriviamo i metodi per preparare le immagini per l'uso, campio campiodando le aree di interesse e elaborando i dati all'interno di aree di interesse selezionate. Mostriamo anche risultati rappresentativi dall'applicazione dell'algoritmo alle immagini ecocardiografiche acquisite da topi e umani con esposizione variabile allo stress post-carico sul ventricolo sinistro.
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Protocol
1. Preparazione di immagini per le analisi
- Ottenere immagini in modalità B ecocardiografica murina o umana nella vista parasternale ad asse lungo. Regola le impostazioni di compensazione del guadagno di tempo e il posizionamento della messa a fuoco di trasmissione per ottimizzare la visualizzazione dell'LV e di altre strutture cardiache nella vista parasternale, secondo la pratica abituale. Verificare che tutte le immagini vengano salvate in formato file DICOM. Le viste immagine standardizzate posizionano la parete ventricolare sinistra inferolaterale alla base del fotogramma. I telai devono mostrare l'intero miocardio ventricolare sinistro e il pericardio. La risoluzione deve essere abbastanza alta da delimitare il bordo pericardico, la parete del miocardio e il bordo endocardico del ventricolo sinistro. Scartare le immagini con un abbandono in eccesso o artefatti dell'immagine.
- Importare un file di immagine per l'analisi nella piattaforma software ImageJ v1.46 come file DICOM. Convertire il file in un file di immagine a 8 bit.
- Scorrere fotogrammi consecutivi del ciclo cardiaco fino a raggiungere un telaio end-diastolico di qualità appropriato. In alternativa, selezionare il frame end-diastolic in un programma di visualizzazione ecocardiografica e quindi esportare in un formato di file .jpg ad alta risoluzione da utilizzare in ImageJ. Identificare i fotogrammi più vicini alla diastole finale utilizzando l'onda R della traccia ECG, quindi identificare il singolo fotogramma migliore che cattura l'LV con la dimensione interna massima. Si consideri questo singolo fotogramma il telaio end-diastolic.
- Si suggerisce che gli utenti siano accecati dall'identità del soggetto quando selezionano le aree di interesse.
2. Campionamento del ROI
- Selezione dei riferimenti pericardiali. Quando si seleziona la regione di interesse pericardica (ROI), mirare a catturare l'eterogeneità del tessuto pericardico. Si noti che la luminosità e il contrasto dell'immagine possono essere regolati per la selezione del ROI, in base alle esigenze, senza alcun effetto sui risultati dell'analisi.
- Utilizzando lo strumento di disegno rettangolo di ImageJ, selezionate un rettangolo con lunghezza approssimante il terzo centrale della parete pericardico inferolaterale basale.
- Ridimensionare il ROI rettangolare per estenderlo sulla larghezza del pericardio utilizzando lo strumento di ridimensionamento del ROI.
- Ruotare il ROI in modo che si trova all'interno dell'area del pericardio utilizzando lo strumento di rotazione di ImageJ.
- Apportare le modifiche necessarie agli angoli del ROI pericardico. Cattura un'ultima regione di interesse pericardica che si trova all'interno del terzo centrale della parete pericardica, e include la larghezza della parete pericardica senza estendersi nelle regioni miocardiche o extra cardiache. Mirare a catturare la stessa posizione relativa e la percentuale dell'area totale del pericardio per tutte le misure adottate in un determinato studio.
- Applicare l'algoritmo alla selezione tramite gli strumenti di analisi ImageJ (vedere la sezione 3).
- Selezione del miocardio. Ancora una volta, mirare a catturare l'eterogeneità del tessuto miocardico all'interno del terzo centrale della parete miocardiale inferolaterale basale. Si noti che la luminosità e il contrasto dell'immagine possono essere regolati per la selezione del ROI, in base alle esigenze, senza alcun effetto sui risultati dell'analisi.
- Selezionare un rettangolo che si estende sulla larghezza della parete miocardico, escludendo l'endocardio e l'epicardio. Assicurarsi che la selezione del miocardio sia adiacente alla selezione del pericardio e allo stesso angolo theta. Non includere aree del muscolo papillare all'interno dell'area di selezione.
- Ruotare il ROI del miocardio in modo che si trovi parallelamente alla selezione del pericardio.
- Apportare le modifiche necessarie agli angoli del ROI del miocardio. Isolare un'ultima regione di interesse miocardica che si trova all'interno del terzo centrale della parete del miocardio e cattura la larghezza della parete senza estendersi nelle regioni pericardiche o intraluminali.
- Applicare l'algoritmo alla selezione tramite una macro ImageJ.
3. Analisi ed elaborazione dei dati
- Installare la macro ImageJ denominata "getHistogramValues.txt".
- Utilizzare lo strumento di analisi dell'istogramma ImageJ per visualizzare in anteprima la distribuzione dei valori di intensità del segnale all'interno del ROI (eseguire questo passaggio per la selezione del pericardico e per la selezione del miocardio).
- Utilizzare la macro ImageJ per registrare questi valori di densità del segnale per il ROI (eseguire questo passaggio per la selezione del pericardio e per la selezione del miocardio).
- Assegnare un valore di intensità da 0 (più scuro) a 255 unità (più luminose) a ogni pixel all'interno della selezione.
- Disporre i valori di intensità gerarchicamente, in ordine di intensità crescente, per produrre una distribuzione dell'intensità del segnale.
- Selezionare e segnalare i seguenti valori percentili per la distribuzione: 20° percentile, 50° percentile (mediana) e 80° percentile.
- Normalizzare le intensità miocardiali utilizzando il riferimento pericardico.
- Normalizzare dividendo i valori percentili miocardi di intensità per i corrispondenti valori percentili pericardiali di intensità12o sottraendo il valore percentile miocardico dell'intensità dal valore percentile pericardico di intensità13.
- Valori di report per i quattro metodi analitici: valori miocardio-pericardico normalizzati per i valori del 20° percentile, del 50° percentile (mediana) e dell'80° percentile.
4. Quantificare la variabilità ciclica
- Applicare l'algoritmo alle selezioni miocardico attraverso fotogrammi consecutivi del file DICOM, spostandosi attraverso il ciclo cardiaco. Confrontare le differenze nelle distribuzioni di intensità tra i fotogrammi, con attenzione ai fotogrammi end-sistolici e end-diastolic.
Tutte le analisi delle immagini sopra descritte vengono eseguite offline su immagini ecocardiografiche nonive precedentemente acquisite e archiviate digitalmente in formato DICOM. Tutti i protocolli di studio sono stati approvati dal comitato di revisione istituzionale di Brigham and Women e dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'area medica di Harvard.
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Representative Results
L'analisi dell'intensità del segnale viene eseguita in 4 passaggi principali(Figura 1),tra cui: 1) selezione e formattazione dell'immagine, 2) ROI di campionamento e aree di riferimento, 3) applicazione dell'algoritmo e 4) elaborazione dei valori finali per ottenere rapporti di intensità miocardica-pericardica. La selezione e le dimensioni del ROI sono standardizzate per limitare la variabilità tra utenti e intrautente (Figura 2). Il posizionamento di ogni ROI è anche standardizzato rispetto alle strutture anatomiche di ciascun soggetto per limitare la variabilità intersoggetto e intrasoggetto.
Come misura della densità del miocardio, si prevede che l'algoritmo riveli cambiamenti nell'intensità del segnale durante tutto il ciclo cardiaco, corrispondenti al previsto aumento della densità del miocardio nel sistole rispetto al diastole. Come mostrato nella figura 3, valori percentili più elevati di intensità del segnale accentuano la variabilità ciclica neitopi con e senza 7 settimane di esposizione alla resistenza al carico post-carico (cioè un topo che ha subito una costrizione aortica crescente rispetto a un topo di controllo del veicolo che è stato sottoposto a un intervento chirurgico fittizio).
Dall'analisi di un singolo frame end-diastolic(figura 4), sinotano differenze significative anche per i soggetti topi e umani esposti a stress cronico post-carico (casi) rispetto alle loro controparti rappresentative (controlli). Sia l'intervallo che la grandezza dell'intensità del segnale differiscono tra casi e controlli. Come si vede nelle analisi della variabilità ciclica, 80°rispetto ai valori del 50° percentile all'interno di ogni distribuzione dell'intensità del segnale suggeriscono una maggiore differenza relativa nell'intensità del segnale tra casi e controlli.
L'algoritmo qui presentato fornisce l'output sotto forma di rapporti miocardico-pericardico di intensità del segnale, dove i valori pericardico fungono da referente in-frame (Figura 5). Il rapporto di intensità del segnale miocardico-pericardico è stato determinato sulla base dell'analisi a fotogramma singolo delle immagini acquisite da controlli rappresentativi e dei casi di sollecitazione post-carico. Concordando con i risultati di cui sopra, il rapporto miocardico-pericardico di80° valore di intensità del segnale percentile offre la massima capacità di distinguere tra controlli e casi. Le differenze previste nella microstruttura miocardica, basate sui risultati della nostra analisi delle immagini, erano coerenti con i risultati dell'istologia del tessuto miocardico nel controllo e nei topi di casi a 7 settimane dalla chirurgia sham o aortic-banding, rispettivamente (Figura 6).
Figura 1. Processo del flusso di lavoro per una singola immagine. Il processo include quattro passaggi principali che possono essere ripetuti quando si confrontano i soggetti o quando si quantifica la variabilità ciclica.
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Figura 2. Tecnica di campionamento della regione di interesse (ROI). L'algoritmo di analisi delle immagini è standardizzato per l'applicazione neitopi( A ) e nell'uomo (B). Vengono visualizzate le selezioni miocardico e pericardico per le immagini rappresentative del mouse e dell'uomo.
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Figura 3. Variazione dell'intensità del segnale sonografico durante tutto il ciclo cardiaco. L'algoritmo è stato applicato a una regione di interesse miocardica su fotogrammi consecutivi di immagini DICOM acquisite da un mouse di controllo rappresentativo (A) e da un mouse a banda aortica (B). La frequenza fotogrammi era di 212 per entrambe le immagini. Per queste immagini, la variabilità ciclica è stata valutata utilizzando 3 punti di taglio: 20° percentile (diamante), 50° percentile (quadrato) e 80° percentile (triangolo). La variabilità ciclica relativa è più elevata per i valoridell'80° percentile che per i valori dei punti di taglio più bassi. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
Figura 4. Le distribuzioni dell'intensità del segnale sono mostrate dall'analisi a fotogramma singolo di immagini rappresentative del mouse e dell'uomo. Gli istogrammi mostrano distribuzioni dell'intensità del segnale derivate dal miocardio di un topo di controllo a 7 settimane dall'intervento fittizio(A),un topo a banda aortica a 7 settimane dall'intervento chirurgico (B), un umano normotensivo (C) e un essere umano ipertensivo (D). Le linee verticali blu indicano valori di 20° percentile, 50° percentile e 80° percentile. Le distribuzioni dell'intensità del segnale sono spostate a destra, e sono di portata più ampia, per i soggetti con stress cronico post-carico (cioè aortico-fasciato rispetto al topo dicontrollo, e ipertensivo rispetto all'umano normotensivo).
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Figura 5. Dati rappresentativi prodotti dall'algoritmo di analisi delle immagini. (A) mostra i dati di un mouse a banda aortica (caso) a 7 settimane. (B) mostra i dati di un essere umano con pressione sanguigna normale (controllo) rispetto a un essere umano con ipertensione cronica (caso). Il rapporto di intensità del segnale miocardico-pericardico è stato determinato utilizzando 3 metodi analitici all'interno dell'algoritmo: rapporto di 20valori percentili; rapporto di50° valore percentile; e rapporto di 80valori percentili. La differenza maggiore tra controlli e casi è dimostrata utilizzando rapporti degli 80valori percentili dell'intensità del segnale.
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Figura 6. Differenze nell'istologia del tessuto miocardico tra topi con e senza esposizione allo stress post-carico. Le sezioni macchiate tricromatiche del ventricolo sinistro del rappresentante Masson sono mostrate per un topo che è stato sottoposto a un intervento chirurgico fittizio(A: controllo) e un topo che è stato sottoposto a bande aortiche (B: caso) a 7 settimane dopo l'intervento chirurgico. Le sezioni mostrano presenza di una sostanziale deposizione di collagene e fibrosi interstiziale nel caso rispetto al controllo. Le barre di scala rappresentano 50 μm.
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Discussion
Descriviamo il protocollo per un algoritmo di analisi delle immagini che quantifica la distribuzione dell'intensità del segnale sonografico e, a sua volta, offre una misura surrogata della microstruttura miocardica. Le funzionalità standardizzate del protocollo, tra cui la selezione, il dimensionamento e il posizionamento del ROI e dell'area di riferimento, servono a ridurre al minimo la variabilità basata su utenti e soggetti. Dimostriamo che se applicato alle immagini ecocardiografiche a fotogramma singolo end-diastolic, l'algoritmo può distinguere in modo appropriato tra miocardio normale e miocardio esposto allo stress post-carico.
Il protocollo descrive in dettaglio come l'algoritmo può essere utilizzato utilizzando il pacchetto software ImageJ open source. All'interno di questo ambiente di analisi delle immagini, l'algoritmo può essere utilizzato per produrre dati sulla distribuzione dei valori di intensità del segnale da un dato campione di tessuto miocardico. Le distribuzioni di intensità del segnale risultanti possono essere visualizzate sotto forma di istogrammi. Gli istogrammi dei valori di intensità all'interno delle selezioni miocardica mostrano che i tessuti miocardio mastici dimostrano un giusto spostamento nella distribuzione e una gamma maggiore di valori, rispetto al miocardio non disa disagio. Questo modello si vede quando l'algoritmo viene applicato sia alle immagini ecocardiografiche umane che murine.
Si osserva che la variabilità dell'intensità del segnale nel ciclo cardiaco corrisponde a cambiamenti fisiologici nella densità del miocardio. Si ritiene che un metodo analitico che distingue costantemente i cambiamenti di densità durante tutto il ciclo cardiaco sia sensibile alle differenze nella densità miocardico che si verificano in risposta ai processi patologici1,6. Infatti, la variabilità ciclica si osserva al momento dell'applicazione dell'algoritmo a fotogrammi consecutivi all'interno di ecocardiogrammi murini. Una maggiore variazione di intensità nel ciclo cardiaco è osservata per i valori di intensità dell'imaging più alti rispetto ai percentili inferiori all'interno della distribuzione totale dell'intensità del segnale.
Quando l'algoritmo viene applicato a campioni rappresentativi di immagini ecocardiografiche acquisite da soggetti con e senza esposizione alla resistenza al post-carico, la densità del rapporto miocardico-pericardico a valori percentili selezionati è osservata particolarmente efficace nel distinguere i soggetti rispetto a senza esposizione alla resistenza cronica al post-carico. Questa scoperta è osservata nelle analisi dei dati rappresentativi del topo e dell'uomo. Si prevede che nel tessuto miocardico dei soggetti esposti allo stress cronico post-carico si potrebbero vedere densità miocardiche elevate, poiché tale stress è noto per promuovere la deposizione interstiziale di collagene e lo sviluppo della fibrosi miocardiale14. La misurazione delle alterazioni del tessuto miocardico nel tempo potrebbe essere utilizzata per fornire una migliore comprensione della risposta dei tessuti allo stress prolungato e alla progressione della malattia. Ulteriori studi sono necessari per valutare se le variazioni nell'intensità del segnale sono correlate a cambiamenti istologici nel tempo e con l'aumento della gravità di un dato fenotipo di malattia.
L'algoritmo di analisi delle immagini ha un'applicabilità limitata alle immagini con artefatti che interferiscono con il ROI e/o la selezione dei riferimenti, la visualizzazione incompleta dei bordi endocardiali o la scarsa qualità complessiva. L'algoritmo potrebbe non essere in grado di confrontare accuratamente le regioni di interesse miocardiche e pericardiche quando i valori percentili dimostrano un modello non lineare sulla mappatura in scala di grigi o quando viene utilizzato un intervallo dinamico insufficiente. Sebbene tali casi siano rari entro il 10° e il 90 ° valore percentile dell'intensità del segnale nella maggior parte dei fenotipi, la valutazione preliminare della linearità dello schienale e dell'intervallo dinamico può essere giustificata per lo studio di nuovi fenotipi di interesse e / o l'analisi delle immagini acquisite utilizzando tecniche ecografiche non convenzionali. L'algoritmo è anche limitato dalla mancanza di automazione del ROI e dal processo di selezione del campione di riferimento. Inoltre, l'algoritmo ha una capacità limitata per l'uso in confronti incrociati di immagini acquisite utilizzando parametri di acquisizione ecocardiografici marcatamente diversi. Nel rapporto attuale, le immagini nei topi sono state acquisite utilizzando un trasduttore a 18-38 MHz a frame velocità che vanno da 225-247 fps; le immagini nell'uomo sono state acquisite utilizzando un trasduttore a 1-5 MHz a frame velocità che vanno da 34-54 fps. Sono necessari ulteriori studi per determinare eventuali revisioni del protocollo che possono essere necessarie per le immagini acquisite utilizzando apparecchiature diverse e a frame rates in netto eccesso rispetto agli intervalli sopra riportati.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Acknowledgments
Siamo grati per le risorse fornite dalla Harvard Medical School / Brigham and Women's Hospital Cardiovascular Physiology Core Laboratory. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai finanziamenti dei National Institutes of Health grants HL088533, HL071775, HL093148 e HL099073 (RL). MB ha ricevuto un premio di borsa di studio post-dottorato affiliato all'American Heart Association. KU è destinatario di un premio di borse di studio post-dottorato affiliato ai fondatori dell'American Heart Association. SC è stato supportato da un premio della Ellison Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ v 1.46 | NIH (Bethesda, MD) | open access software | |
| Power ShowCase | Trillium Technology (Ann Arbor, MI) | commercial software |
References
- Yamada, S., Komuro, K. Integrated backscatter for the assessment of myocardial viability. Curr. Opin. Cardiol. 21, 433-437 (2006).
- Mimbs, J. W., O'Donnell, M., Bauwens, D., Miller, J. W., Sobel, B. E. The dependence of ultrasonic attenuation and backscatter on collagen content in dog and rabbit hearts. Circ. Res. 47, 49-58 (1980).
- Picano, E., et al. In vivo quantitative ultrasonic evaluation of myocardial fibrosis in humans. Circulation. 81, 58-64 (1990).
- Mizuno, R., et al. Myocardial ultrasonic tissue characterization for estimating histological abnormalities in hypertrophic cardiomyopathy: comparison with endomyocardial biopsy findings. Cardiology. 96, 16-23 (2001).
- Mizuno, R., Fujimoto, S., Saito, Y., Nakamura, S. Non-invasive quantitation of myocardial fibrosis using combined tissue harmonic imaging and integrated backscatter analysis in dilated cardiomyopathy. Cardiology. 108, 11-17 (2007).
- Marini, C., et al. Cyclic variation in myocardial gray level as a marker of viability in man. A videodensitometric study. Eur. Heart. J. 17, 472-479 (1996).
- Komuro, K., et al. Sensitive detection of myocardial viability in chronic coronary artery disease by ultrasonic integrated backscatter analysis. J. Am. Soc. Echocardiogr. 18, 26-31 (2005).
- Ciulla, M., et al. Echocardiographic patterns of myocardial fibrosis in hypertensive patients: endomyocardial biopsy versus ultrasonic tissue characterization. J. Am. Soc. Echocardiogr. 10, 657-664 (1997).
- Maceira, A. M., Barba, J., Varo, N., Beloqui, O., Diez, J. Ultrasonic backscatter and serum marker of cardiac fibrosis in hypertensives. Hypertension. 39, 923-928 (2002).
- D'Hooge, J., et al. High frame rate myocardial integrated backscatter. Does this change our understanding of this acoustic parameter. Eur. J. Echocardiogr. 1, 32-41 (2000).
- Finch-Johnston, A. E., et al. Cyclic variation of integrated backscatter: dependence of time delay on the echocardiographic view used and the myocardial segment analyzed. J. Am. Soc. Echocardiogr. 13, 9-17 (2000).
- Di Bello, V., et al. Increased echodensity of myocardial wall in the diabetic heart: an ultrasound tissue characterization study. J. Am. Coll. Cardiol. 25, 1408-1415 (1995).
- Takiuchi, S., et al. Quantitative ultrasonic tissue characterization can identify high-risk atherosclerotic alteration in human carotid arteries. Circulation. 102, 766-770 (2000).
- Querejeta, R., et al. Serum carboxy-terminal propeptide of procollagen type I is a marker of myocardial fibrosis in hypertensive heart disease. Circulation. 101, 1729-1735 (2000).
