Summary
心エコー検査は、心臓の構造および機能の変化を非侵襲的に特徴付け、定量化するために一般的に使用される。心筋微細構造の強化された代理尺度を提供し、オープンアクセス画像解析ソフトウェアを用いて実行できる超音波ベースの画像アルゴリズムについて述べる。
Abstract
心エコー検査は、心臓の構造および機能の変化を非侵襲的に特徴付け、定量化するために一般的に使用される広くアクセス可能な画像化モダリティである。心臓組織の超音波評価には、関心のある特定の領域内の後方散乱信号強度の解析が含まれる。以前に確立された技術は、主に後方散乱信号強度の統合値または平均値に依存しており、周期変動に基づくアルゴリズムの低フレームレートおよび時間遅延からの別名データによる変動の影響を受けやすい可能性があります。本明細書において、我々は、以前の方法から及ぶ超音波ベースの画像化アルゴリズムを記述し、単一の画像フレームに適用することができ、与えられた心筋サンプルから導出される信号強度値の全分布を占める。代表的なマウスおよびヒトイメージングデータに適用すると、このアルゴリズムは、慢性の後負荷抵抗の有無に関する被写体を区別します。このアルゴリズムは、心筋微細構造の拡張された代理尺度を提供し、オープンアクセス画像解析ソフトウェアを使用して実行することができる。
Introduction
心エコー検査は、心臓の構造および機能の変化を非侵襲的に特徴付け、定量化するために一般的に使用される広くアクセス可能な画像化モダリティである。心臓組織の超音波評価には、特定の時間内の特定の領域内の後方散乱信号強度の分析を含めることができ、また、心周期の過程で同様に。以前の研究では、ソノマの信号強度の尺度は、心筋線維の崩壊、生存可能対非生存性心筋組織、および間質線維症1-3の基礎的存在を特定できることを示唆している。我々は、心筋の「微細構造」を、総サイズおよび形態の線形測定を超えて、ソノグラフ解析を用いて特徴付けることができる組織アーキテクチャと呼ぶ。従って、ソノグラフィシグナル強度の解析は、肥大性および拡張型心筋症4,5、慢性冠動脈疾患6,7、および高血圧性心疾患8,9の設定における心筋組織の微細構造変化を評価するために用いられている。しかしながら、以前に確立された技術は、主に後方散乱信号強度の積分または平均値に依存しており、ランダムノイズ5、低フレームレート10からの別名データ、および周期変動11に基づくアルゴリズムの時間遅延による変動の影響を受けやすい可能性がある。
本明細書では、我々は、以前の方法から拡張超音波ベースの画像解析アルゴリズムを使用する方法を説明します。このアルゴリズムは、画像解析のための単一のエンド拡張フレームに焦点を当て、特定の心筋サンプルから導き出された信号強度値の完全分布を説明します。このアルゴリズムは、フレーム内基準12,13として心膜を用いることで、ソノグラフィ信号強度分布の変動を再現的に定量化し、心筋微細構造の強化された代理尺度を提供する。詳細なプロトコルでは、使用する画像の準備、対象領域のサンプリング、および対象領域内のデータの処理を行う方法について説明します。また、左心室の後負荷ストレスに対する可変暴露を有するマウスおよびヒトから取得した心エコー画像にアルゴリズムを適用した代表的な結果を示す。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 分析のための画像の作成
- 寄星長軸図でマウスまたはヒト心エコーBモード画像を取得します。時間利得補正の設定と送信フォーカスの配置を調整して、通常の練習に従って、パラスターナルビューにおけるLVおよび他の心臓構造の可視化を最適化します。すべてのイメージが DICOM ファイル形式で保存されていることを確認します。標準化された画像ビューは、フレームの底部に下側左心室壁を配置します。フレームは左心室心筋および心膜の全体を表示しなければならない。解像度は、心膜の境界、心筋壁、および左心室の心筋境界を区切るのに十分な高さでなければなりません。余分なドロップアウトまたはイメージアーティファクトを含むイメージを破棄します。
- DICOMファイルとしてImageJソフトウェアプラットフォームv1.46に分析用の画像ファイルをインポートします。ファイルを 8 ビットイメージファイルに変換します。
- 適切な品質のエンド拡張期フレームに達するまで、心臓サイクルの連続したフレームをスクロールします。または、心エコー表示プログラムでエンド拡張期フレームを選択し、ImageJ で使用するために高解像度.jpgファイル形式にエクスポートします。ECGトレースのR波を使用してエンド・ダイストールに最も近いフレームを特定し、最大内部次元でLVをキャプチャする単一の最良のフレームを特定します。この単一フレームをエンド拡張フレームと考えてください。
- 関心のある地域を選択する際に、ユーザーがサブジェクト ID に目をつぶることをお勧めします。
2. ROI サンプリング
- 心膜参照選択。関心のある心膜領域(ROI)を選択する際には、心膜組織の異質性を捉えることを目指す。画像の明るさとコントラストは、必要に応じて、解析結果に影響を与えることなく、ROIの選択に合わせて調整できます。
- ImageJ の矩形描画ツールを使用して、基底の内膜壁の 3 分の 1 に近い長さの長方形を選択します。
- ROI サイズ変更ツールを使用して、四角形の ROI を心膜の幅に合わせてサイズ変更します。
- ImageJ の回転ツールを使用して、心膜領域内に配置する ROI を回転させます。
- 心膜 ROI のコーナーに必要な調整を行います。心膜壁の中央3分の1以内にあり、心筋領域または心外領域に伸びることなく心膜壁の幅を含む、関心のある最終的な心膜領域をキャプチャします。特定の研究で行われたすべての測定に対して、同じ相対位置と総心膜領域の割合をキャプチャすることを目指します。
- ImageJ 解析ツールを使用して選択にアルゴリズムを適用します(セクション3を参照)。
- 心筋選択。もう一度、基底下心筋心筋壁の中央3分の1以内の心筋組織の不均一性を捕捉することを目指す。画像の明るさとコントラストは、必要に応じて、解析結果に影響を与えることなく、ROIの選択に合わせて調整できます。
- 心内膜と心外膜を除いて、心筋壁の幅に及ぶ長方形を選択します。心筋選択が心膜選択に隣接し、同じθ角度にあることを確認してください。選択領域内に乳頭筋の領域を含めないでください。
- 心筋ROIを心膜選択と平行になるように回転させます。
- 心筋ROIのコーナーに必要な調整を行います。心筋壁の中央3分の1以内にある最終心筋領域を隔離し、心膜領域または内反領域に伸びることなく壁の幅を捉えます。
- アルゴリズムを ImageJ マクロを使用して選択に適用します。
3. データ分析と処理
- "取得のヒストグラム値.txt"と呼ばれる ImageJ マクロをインストールします。
- ImageJ ヒストグラム解析ツールを使用して、ROI 内の信号強度値の分布をプレビューします (心膜選択と心筋選択に対してこの手順を実行します)。
- ImageJ マクロを使用して、ROI のこれらの信号密度値を記録します (心膜選択と心筋選択に対してこのステップを実行します)。
- 選択範囲内の各ピクセルに 0 (最も暗い) から 255 (最も明るい) 単位の強度値を割り当てます。
- 強度値を階層的に並べ、強度を上げる順に、信号強度の分布を生成する。
- 分布の百分位数の値として、20番目 の百分位数、50番目の 百分位数 (中央値)、および 80 パーセンタイルを選択してレポートします 。
- 心膜参照を使用して心筋強度を正規化します。
- 強度の心筋百分位数を、対応する心膜百分位値の強度12で割ることによって、または強度の心膜百分位値から強度の心筋百分位数値を差し引くことによって正規化する。
- 4 つの分析方法のレポート値: 20パー センタイルの正規化された心筋対心筋値、50番目の 百分位数 (中央値)、および 80パー センタイル値。
4. 周期的変動性の定量化
- DICOMファイルの連続したフレームを介して心筋選択にアルゴリズムを適用し、心臓周期を移動する。フレーム間の強度分布の差を比較し、エンドシストリックフレームとエンド拡張期フレームに注意します。
上記の画像解析はすべて、以前に取得した非侵襲的な心エコー画像上でオフラインで行われ、DICOM形式でデジタル保存されます。すべての研究議定書は,ブリガム・アンド・ウィメンズ制度審査委員会とハーバード医療地域常設動物のケア・使用委員会によって承認されました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
信号強度解析は、4つの主要なステップ(図1)を含む:画像選択とフォーマット、2)サンプリングROIおよび基準領域、3)アルゴリズムアプリケーション、および4)心筋対心筋強度比を得るための最終的な値を処理する。ROIの選択とサイズは、ユーザー間とユーザー内変動を制限するために標準化されています(図2)。各ROIの位置づけは、各被験者の解剖学的構造に関しても標準化され、被検者間および被検体内変動を制限する。
心筋密度の尺度として、このアルゴリズムは、収縮期の心筋密度の増加が期的な収縮期と比較して予想される増加に対応して、心臓周期全体のシグナル強度の変化を明らかにすることが期待される。 図3に示すように、シグナル強度の百分位値が高いほど、7週間の後負荷抵抗への曝露の有無にかかわらずマウスの周期的変動を強調する(すなわち 、偽の手術を受けた車両制御マウスと比較して大動脈収縮の上昇を受けたマウス)。
単一のエンド拡張期フレームの分析(図4)では、慢性後負荷ストレスにさらされたマウスとヒトの両方の被験者に対して、代表的な対応物(コントロール)と比較して有意な違いが指摘される。信号強度の範囲と大きさの両方が、ケースとコントロールによって異なります。周期変動の分析で見られるように、各信号強度分布内の50番目の百分位数の値と比較して80番目は、ケースとコントロール間の信号強度の相対的な差が大きいことを示唆しています。
本明細書に示すアルゴリズムは、心筋対心膜間の信号強度比の形式で出力を提供し、そこで心膜内値がフレーム内参照として機能する(図5)。心筋対心筋信号強度比は、代表的な制御から取得した画像の単一フレーム分析と後負荷応力の場合に基づいて決定した。上記の結果と一致して、80番目のパーセンタイル信号強度値の心筋対心膜比は、コントロールとケースを区別する最大の能力を提供します。心筋微細構造の予想される違いは、我々の画像解析結果に基づいて、それぞれ、恥骨または大動脈バンディング手術の後7週間のコントロールマウスおよび症例マウスにおける心筋組織組織組織学からの知見と一致した(図6)。
図 1. 個々のイメージのワークフロー プロセス。 このプロセスには、被験者を比較するとき、または周期的変動を定量化する際に繰り返される可能性のある4つの主要なステップが含まれます。
ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。
図 2.対象地域 (ROI) サンプリング手法。 画像解析アルゴリズムは、マウス(A)およびヒト(B)での適用に対して標準化されている。代表的なマウスおよびヒト画像の心筋および心膜選択がそれぞれ示されている。
ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。
図 3.心臓周期全体のソノグラフィック信号強度の変動。 このアルゴリズムは、代表的なコントロールマウス(A)と大動脈バンドマウス(B)から取得したDICOM画像の連続したフレームに対して、関心のある心筋領域に適用された。両方の画像のフレームレートは212であった。これらの画像では、周期的変動を3つのカットポイント(20パー センタイル(ダイヤモンド)、50パー センタイル(正方形)、80パー センタイル(三角形)で評価しました。相対循環変動は、80番目 のパーセンタイル値の方が、下側のカットポイント値よりも高くなります。 ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。
図 4.信号強度分布は、代表的なマウスおよびヒト画像の単一フレーム分析から示される。 ヒストグラムは、手術後7週間(A)、手術後7週間(B)、ノルモテンシヒト(C)、高血圧性ヒト(D)の7週目にコントロールマウスの心筋に由来するシグナル強度の分布を表示する。青い縦線は、20番目の 百分位数、50番目の 百分位数、および 80番目の 百分位数を表します。シグナル強度の分布は右シフトされ、範囲が大きく、慢性後負荷ストレス(すなわち コントロールマウスと比較した大動脈バンド、および高血圧とノルマンテンスヒトと比較した)を有する被験者に対しては、より大きい。
ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。
図 5.画像解析アルゴリズムによって生成された代表的なデータ。(A)は、7週で大動脈バンド(ケース)マウスと比較して、シャム操作(コントロール)からのデータを示す。(B)は、慢性高血圧のヒト(症例)と比較して、正常な血圧(コントロール)を有するヒトからのデータを示す。心筋対心筋信号強度比は、アルゴリズム内の3つの分析方法を使用して決定しました:20番目のパーセンタイル値の比率。50番目の百分位数の値の比率;80 番目の百分位数の値の比率。コントロールとケースの最大の差は、信号強度の80番目のパーセンタイル値の比率を使用して示されます。
ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。
図 6.マウスの心筋組織組織の違いは、後負荷ストレスの有無にかかわらずマウスの間で。 マッソンの左心室の三色染色切片は、手術後7週間で、シャム手術(A:コントロール)を受けたマウスと大動脈バンディング(B:症例)を受けたマウスに対して示されている。切片は、コントロールと比較して、場合における実質的なコラーゲン沈着および間質線維化の存在を示す。スケールバーは50 μmを表します。
ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々は、ソノグラフィ信号強度分布を定量化し、ひいては心筋微細構造の代理尺度を提供する画像解析アルゴリズムのプロトコルを記述する。ROIと参照領域の選択、サイジング、位置決めなど、プロトコルの標準化された機能は、ユーザおよびサブジェクトベースの変動を最小限に抑えるのに役立ちます。我々は、エンド拡張期単一フレーム心エコー画像に適用すると、アルゴリズムが通常の心筋と後負荷ストレスにさらされた心筋を適切に区別できることを実証する。
プロトコルは、オープンソースの ImageJ ソフトウェアパッケージを使用してアルゴリズムをどのように採用できるかを詳しく説明します。この画像解析環境内では、このアルゴリズムを使用して、所与の心筋組織サンプルからの信号強度値の分布に関するデータを生成することができます。結果として得られる信号強度分布は、ヒストグラムの形で表示することができます。心筋選択における強度値のヒストグラムは、病気の心筋組織が非疾患心筋と比較して分布の右シフトおよびより大きな範囲の値を示すことを示している。このパターンは、アルゴリズムが人間とマウスの両方の心エコー画像に適用されるときに見られます。
心周期に対するシグナル強度の変動は、心筋密度の生理学的変化に対応して観察される。心周期を通して密度変化を一貫して区別する分析法は、病理学的プロセス1,6に応答して起こる心筋密度の違いに敏感であると考えられる。実際、マウス心エコー図内の連続したフレームにアルゴリズムを適用すると周期的変動が観察される。全信号強度分布内の低百分位数と比較して、より高い画像強度値に対して、心周期に対する強度の大きな変動が観察される。
このアルゴリズムを、後負荷抵抗への曝露の有無にかかわらず被検者から取得した心エコー画像の代表的なサンプルに適用すると、選択されたパーセンタイル値における心筋対心膜比密度は、慢性の後負荷耐性にさらされることなく被験者を区別するのに特に有効であることが観察される。この知見は、代表的なマウスおよびヒトデータの分析で観察される。心筋密度の上昇は、慢性後負荷ストレスにさらされた被験者の心筋組織に見られることが予想され、そのようなストレスは間質性コラーゲン沈着および心筋線維症14の発症を促進することが知られているからである。時間の経過に応じて心筋組織の変化の測定は、長期のストレスや疾患の進行に対する組織応答のより良い理解を提供するために使用することができる。シグナル強度の変動が経時の組織学的変化と相関し、特定の疾患表現型の重症度が高まっているかどうかを評価するために、さらなる研究が必要である。
画像解析アルゴリズムは、ROI や参照選択、心内膜境界の不完全な視覚化、または全体的な品質の低下を妨げるアーティファクトを持つ画像への適用性が制限されています。百分位数がグレースケールマッピングで非線形パターンを示す場合、またはダイナミックレンジが不十分な場合、このアルゴリズムは、対象となる心筋領域と心膜領域を正確に比較できない場合があります。このような例は、ほとんどのフェノタイプにおいてシグナル強度の10〜90パーセンタイル値以内にまれであると予想されるが、後方散乱直線性およびダイナミックレンジの予備的評価は、関心のある新しいフェノタイプを研究し、非伝統的な超音波技術を用いて取得した画像を分析するために保証される。また、ROIおよび参照サンプル選択プロセスの自動化の欠如によって、アルゴリズムが制限されます。さらに、このアルゴリズムは、著しく異なる心エコー集録パラメータを使用して撮影された画像の相互比較に使用できる容量が限られています。現在のレポートでは、マウスの画像は、225-247 fpsの範囲のフレームレートで18-38 MHzトランスデューサを使用して取得されました。人間の画像は、34-54 fpsの範囲のフレームレートで1〜5 MHzのトランスデューサを使用して取得されました。別の機器を使用して取得した画像や、上記の報告範囲を超えるフレームレートで取得する可能性のあるプロトコル改訂を決定するには、さらなる研究が必要です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
ハーバード大学医学部/ブリガム・アンド・ウィメンズ病院心臓血管生理学コアラボラトリーのリソースに感謝しています。この研究は、国立衛生研究所の助成金HL088533、HL071775、HL093148、HL099073(RL)からの資金提供によって部分的に支援されました。MBは、米国心臓協会の創設者アフィリエイトポストドクターフェローシップ賞を受賞しました。KUは、米国心臓協会の創設者アフィリエイトポスドクフェローシップ賞を受賞しています。SCはエリソン財団の賞によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ v 1.46 | NIH (Bethesda, MD) | open access software | |
| Power ShowCase | Trillium Technology (Ann Arbor, MI) | commercial software |
References
- Yamada, S., Komuro, K. Integrated backscatter for the assessment of myocardial viability. Curr. Opin. Cardiol. 21, 433-437 (2006).
- Mimbs, J. W., O'Donnell, M., Bauwens, D., Miller, J. W., Sobel, B. E. The dependence of ultrasonic attenuation and backscatter on collagen content in dog and rabbit hearts. Circ. Res. 47, 49-58 (1980).
- Picano, E., et al. In vivo quantitative ultrasonic evaluation of myocardial fibrosis in humans. Circulation. 81, 58-64 (1990).
- Mizuno, R., et al. Myocardial ultrasonic tissue characterization for estimating histological abnormalities in hypertrophic cardiomyopathy: comparison with endomyocardial biopsy findings. Cardiology. 96, 16-23 (2001).
- Mizuno, R., Fujimoto, S., Saito, Y., Nakamura, S. Non-invasive quantitation of myocardial fibrosis using combined tissue harmonic imaging and integrated backscatter analysis in dilated cardiomyopathy. Cardiology. 108, 11-17 (2007).
- Marini, C., et al. Cyclic variation in myocardial gray level as a marker of viability in man. A videodensitometric study. Eur. Heart. J. 17, 472-479 (1996).
- Komuro, K., et al. Sensitive detection of myocardial viability in chronic coronary artery disease by ultrasonic integrated backscatter analysis. J. Am. Soc. Echocardiogr. 18, 26-31 (2005).
- Ciulla, M., et al. Echocardiographic patterns of myocardial fibrosis in hypertensive patients: endomyocardial biopsy versus ultrasonic tissue characterization. J. Am. Soc. Echocardiogr. 10, 657-664 (1997).
- Maceira, A. M., Barba, J., Varo, N., Beloqui, O., Diez, J. Ultrasonic backscatter and serum marker of cardiac fibrosis in hypertensives. Hypertension. 39, 923-928 (2002).
- D'Hooge, J., et al. High frame rate myocardial integrated backscatter. Does this change our understanding of this acoustic parameter. Eur. J. Echocardiogr. 1, 32-41 (2000).
- Finch-Johnston, A. E., et al. Cyclic variation of integrated backscatter: dependence of time delay on the echocardiographic view used and the myocardial segment analyzed. J. Am. Soc. Echocardiogr. 13, 9-17 (2000).
- Di Bello, V., et al. Increased echodensity of myocardial wall in the diabetic heart: an ultrasound tissue characterization study. J. Am. Coll. Cardiol. 25, 1408-1415 (1995).
- Takiuchi, S., et al. Quantitative ultrasonic tissue characterization can identify high-risk atherosclerotic alteration in human carotid arteries. Circulation. 102, 766-770 (2000).
- Querejeta, R., et al. Serum carboxy-terminal propeptide of procollagen type I is a marker of myocardial fibrosis in hypertensive heart disease. Circulation. 101, 1729-1735 (2000).
