Summary
腹腔内超音波は、リーブスのムンジャク鹿の生殖状態を評価するための効果的で非侵襲的な手段として記述されている。これらの方法は、妊娠初期の診断を達成し、胎児の生存率を評価するために使用することができる。この技術の将来の応用には、妊娠年齢の推定と胎児の発達に及ぼす母親の病気の影響が含まれる。
Abstract
リーブスのムンチャクシカ(ムンティアカス・リーベシ)は、東南アジア原産の小さなチェルド種であり、現在プリオン病の伝染と病因の潜在的なモデルとして調査されています。鉛直透過はプリオン病を含む感染症を研究する研究者の間で関心のある分野であり、これらの調査では、生殖性能に及ぼす母親の感染の影響を評価するための効率的な方法が必要です。ウルトラソノグラフィー検査は、多くの動物種1-7で妊娠を診断し、胎児の健康を評価するための確立されたツールであり、養殖cervidsの数種を含む8-19であるが、この技術はリーブスのmuntjac鹿には記載されていない。ここでは、muntjacで妊娠を検出し、妊娠期間を通じて胎児の成長と発達を評価するための腹腔内超音波の適用について説明する。この手順を使用して、妊娠中の動物は、doe-buckペアリングの後、早くも35日に同定され、これは定期的に安全に妊娠を監視するための効果的な手段でした。この研究の将来の目標は、妊娠年齢の推定のための正常な胎児測定参照を確立し、妊娠の様々な段階で妊娠を診断するための技術の感受性および特異性を決定し、異なる実験条件下での胎児の成長および発達の変動を特定することを含む。
Introduction
超音波検査は、牛1、羊2,3、ヤギ4、馬5、コンパニオン動物6,7、および他の家畜種における妊娠診断の詳細な方法である。このイメージングモダリティは、キャプティブカービドの数種における妊娠検出および胎児年齢推定のための貴重なツールとして同定されています, キャプティブシカ8-11,赤鹿12-16,北海道シカ鹿17, トナカイ18,19.多くの場合、超音波検査は、血清プロゲステロンまたは妊娠関連糖タンパク質解析9,18のような妊娠検出の他のメカニズムよりも高い精度率を生成している。さらに、生殖管の超ソノグラフィック可視化は、胎児の生存率、妊娠年齢、およびそうでなければ評価が困難であろう発達異常の同定に関する追加情報を提供することができる。生殖状態を評価するための超音波検査の有用性は、この方法論が活動的な繁殖プログラムが使用されている他の種に適応されるべきであることを示唆している。
リーブスのムンジャク鹿(ムンティアカス・リーヴェシ)は東南アジア20原産の小さなチェルヴィッド種です。これらの動物の生殖サイクルは自国の領土で十分に特徴付けられていないが、イングランド南部の一部の野生集団の研究は、彼らの繁殖パターン20の理解を改善した。ほとんどのcervidsとは異なり、リーブスのmuntjacは一年中繁殖しているように見えますが、明らかな季節的な偽のピークは20-22はありません。雌のムンジャクは、通常、210日の妊娠期間に続いて単一のファーンを出産し、24時間20〜22時間以内に確実に産後のエストラスに入る。この産後の期間中に妊娠していないそれは、約24〜25日後に20の後にエストラスに戻ります。捕虜の状況では、繁殖は通常、1人または複数の無傷の男性との住宅によって達成される。このシステムは、満足のいく受胎率を生成し、人員のための技術的なスキルをほとんど必要としませんが、正確な繁殖日は、不可能ではないにしても、決定することは困難です。
ムンジャクは、異なる種23の間で、広範囲の二倍染色体数および高い核糸量多様化率による細胞遺伝学的研究で一般的に使用されている。これらの動物は現在、プリオン病の病態と伝染のモデルとして調査されており、特にcervidsにおける慢性消耗性疾患(CWD)の垂直伝染の研究に関心を持っている。さまざまな研究アプリケーションにおけるmuntjacの重要性は、現在の調査手順を補完するために改善された生殖技術を確立すべきであることを示唆している。具体的には、妊娠期間を評価するための非侵襲的なメカニズムは、異なる実験条件下で生殖性能および胎児の成長および発達における重大な変動を解明する可能性がある。さらに、リアルタイムの胎児測定参照の開発は、繁殖日を決定できない状況で妊娠年齢を推定する上で潜在的に価値がある。これまでの研究では、冠ランプ長(CRL)、胸深さ(CD)、頭部長さ(HL)などの胎児測定を使用するメカニズムを説明し、cervid種11-14、16,17における妊娠のおよその段階を推定する。さらに、これらの研究のいくつかは、骨格鉱化や胎児の心拍などの特定の発達マイルストーンを8-19で特定できる時期を説明するガイドラインも確立している。これらのデータは、ムンジャクの生殖超音波分析を導くのに役立つかもしれないが、研究された他のcervid種のほとんどは、はるかに大きな体サイズと長い妊娠期間を有し、ムンジャク用途に対するこれらの研究の翻訳値を減少させる。
ここで概説するプロトコルは、妊娠の診断とモニタリングを目的とした女性ムンジャクの経腹的超音波検査について説明する。このプロトコルの実行が成功すると、胎児の成長と発達の早期妊娠検出と評価を容易にすることができます。この技術は、小さなcervidモデルにおける感染症の生殖、 子宮 の発達、または垂直伝達を調査する研究の実施において貴重な用途を有し、また捕虜飼育活動における臨床目的に有用であり得る。
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Protocol
1. 手続き準備
記載されているすべての動物の手順は、コロラド州立大学の機関動物ケアと使用委員会、実験動物ケア(AAALAC)の評価と認定のための協会、Intl.認定機関によって審査され、承認されています。
- 検査の前に、適切な沈着または麻酔プロトコルを使用して動物を固定化して、緩和を提供し、適切な位置を可能にする。1人のハンドラーは鹿を拘束し、2人目は動物にセドレーションを投与する。
注: 著者らは、この種で効果的な鎮静を提供するために、次の組み合わせを発見しました: ブトルファノール (0.45 mg/kg), アザペロン (0.035 mg/kg), メデトミジン (0.04 mg/kg), 臀筋で筋肉内投与. - doeが準拠した取り扱いを可能にするセドレーションの平面に達したら、検査テーブルまたはV-トラフ内の後ろまたは横の債務に彼女を配置します。頭、首、胸郭をわずかに(約20~30°)上昇させ、尿中の逆流や吸引のリスクを軽減し、手順中の適切な換気を促進します。
注: ほとんどのcervidsまたは他の反する種では、腹部超音波は立っている動物で行われます。しかし、この種の小さなサイズと行動の考慮事項は、検査のために重い沈殿を必要とし、胸骨の位置決めはより困難であり、効果的なイメージング技術を妨げる可能性があります。胸部と横の遅れの中間に動物を配置することは、逆流および低換気のリスクを減らすのに理想的であり、可能であれば考慮すべきである。どんなリカンベント位置でも、動物の呼吸を注意深く監視し、逆流または低換気が指摘された場合、すぐに検査を停止し、胸骨の不全に動物を置くことを重要です。 - 必要に応じて、検査する腹部の領域から毛髪をクリップし、トランスデューサと皮膚のフットプリントとの間に十分な接触を達成する。
注: 妊娠初期には、乳腺付近の尾内腹部で妊娠の証拠が検出される。このムンジャクの領域は、典型的には無毛であり、したがってシェービングは、現時点では示されない場合がある。胎児が成長し、子宮が腹部のより頭蓋的な位置を占めるように、画像化の前に毛髪のクリッピングが必要になる。カミソリの刃による裂傷や電気バリカンによる熱損傷など、皮膚に機械的な外傷を引き起こさないように注意してください。 - 超音波ユニットを、技術者が優れた手で検査を行っている間、モニターを容易に可視化できる場所に設置します。保存した画像やビデオループに自動的にラベルを付けるには、動物識別情報(名前、識別番号 など)をシステムに入力します。
2. 腹腔内生殖超音波検査
- コーダル腹部に音響カップリングゲルの寛大な量を適用します。
- 5~10MHzの湾曲した線形トランスデューサーを尾頭腹部の皮膚に置き、直ちに陰蓋に向け、頭蓋方向にゆっくりと動かし、骨盤腔内の構造を評価する。口腔腹部の左右の象限をスキャンして、ムンチャクの二コルニュエ子宮の両方の角を評価する。
注: 包括的な腹部超音波は、肝臓、腎臓、脾臓、消化管、尿膀胱、および生殖管を含むすべての腹部内臓の評価を伴う。このプロトコルの目的のために、妊娠の検査のみが詳細に議論される。しかし、他の尾状腹部器官の正常な外観は、これらの構造が研究の過程で遭遇する可能性が高いと認識されるべきである。この場所で最も一般的に見られる器官には、胃腸管、尿膀胱、生殖管のセグメントが含まれる。大腸と小腸は、腸壁の特徴的な層状の外観によって識別されます。この内腔は、内容物の種類や量によって発音される場合があり、これは流体、ガス、粘液、または食品粒子を含む場合がある。尿膀胱は尿で歪まなければ同定が難しい場合があり、膀胱壁の層は腸の層よりも有意に明確ではない。子宮とは別に、卵巣は雌のムンジャクの生殖管の超音波でも見つかる。卵巣は腎臓の尾柱付近の卵型構造として現れ、その外観はエストルスサイクルの過程で変化する可能性がある。皮質内に複数の成熟した、体液で満たされた卵胞の存在は、発情を示唆する。
注: トランスデューサのスキャンヘッドを回転および/または「ファン」することにより、構造は横方向または矢状の平面で評価することができる。- グラビド子宮と尿膀胱を区別するために必要な場合は、尾骨腹部に穏やかな圧力をかけるか、尿カテーテルを置いてスキャンを繰り返すことによって、膀胱を手動で空にする。
注: 膀胱の手動発現は、動物が胸骨または直立位置にあり、腹部内臓のより自然な配向を促進し、他の構造に対する外傷のリスクを軽減する場合にのみ試みるべきである。子宮はまた、器官の壁の厚さを評価することによって尿膀胱から区別され得る。適度に歪んだ膀胱の典型的な厚さは約1.4mm24であり、著者らは、ムンジャク中のグラビド子宮のより筋肉質な壁が一般的に7〜8mmの間で測定することを発見した。
注:妊娠初期は、胎児の構造が識別できないことのために決定的に診断することは困難であり、実際に妊娠の最初の徴候は単に尾部腹部の小さな液体ポケットである可能性があります。このとき見れば、発達中の胚は、子宮内の非晶質構造に対して、超エコー的に現れる(図1)。
- グラビド子宮と尿膀胱を区別するために必要な場合は、尾骨腹部に穏やかな圧力をかけるか、尿カテーテルを置いてスキャンを繰り返すことによって、膀胱を手動で空にする。
- コントラストとイメージのディテールを改善するために、必要に応じて深さ、周波数、ゲインを調整します。
注: 高い周波数は、画像解像度を向上するために必要な短い波長に関連付けられています。ほとんどのトランスデューサは、周波数の範囲内で動作することができます (例えば, 6-10 MHz)24.周波数は、超音波ユニットのスキャナコントロールを使用して調整することができ、周波数が増加すると、より鮮明な画像になります。周波数を同時に増加させると、音波の浸透の深さが減少します。したがって、より深い構造を視覚化するには周波数を減らす必要があるかもしれませんが、解像度が24に危険にさらされる可能性があります。このため、所望の組織深度に到達するために可能な限り最高の周波数を選択することが重要である。ゲイン制御の調整は、組織からトランスデューサに戻る音波の増幅を変化させ、画像24のコントラストの程度に影響を与える。利得は、超響性組織と低響組織の間の最適なコントラストが得られるポイントに設定する必要があり、これらの設定は、画像化される構造に応じて調整する必要があります。
3. 胎児の測定を取得する
注:多くの家畜種における妊娠年齢は、超音波検査から得られた胎児測定のための確立された基準範囲を使用して推定することができる。最も一般的に使用される測定は、ストレートクラウンランプ長(SCRL)、胸深度(CD)、およびヘッド長さ(HL)17を含む。リーブスのmuntjac鹿で信頼性の高い妊娠年齢ガイドラインを開発するのに十分なデータはまだ収集されていませんが、これらの参照を確立するために測定を収集することができます。胎児心拍数(FHR)は、妊娠が一定の時点(通常は妊娠の60日目前後)に進むにつれて直線的に増加する他の種のcervidおよび反すう剤で示されており、その時点で心拍数は17減少し始める。FHRは、他の超音波観察と併せて妊娠年齢を推定するために使用することができるが、それはより一般的に胎児の生存率17,24の尺度として使用される。FHRは、リーベスのムンジャクで、観察後35日の早い時期に計算されている。
- SCRLを測定するには、モニター上の子宮を見つけ、胎児全体の矢状のビューが得られるまでトランスデューサの位置を微調整する(図2および図3)。画像をフリーズし、頭蓋骨の最も後ろ方向と仙骨の基部との距離を測定します(図2および3)。
- CDを測定するには、胎児の矢状図(同じ画像をSCRLを測定するために使用してもよい)を得て、胸郭の側側と腹側の間の距離を測定する(図2および図3)。
- HLを測定するために、SCRLおよびCD測定に関して説明したのと同じ胎児の矢状図を用いて、後頭紋から鼻の基部までの距離を測定する(図2および3)。
- 胎児の心拍数を計算するには、そのリズミカルな収縮を視覚化することによって、胎児の胸腔内の心臓を識別する。1 分の期間内に発生する収縮 (心臓の拍動) の数を数えることによって心拍数を計算します。
注: 使用されている超音波ユニットがドップラー機能を有する場合、この機能は、さらに他の非特異的な胎児の動きから心臓を区別するのに役立つ可能性があります。 - 保存されたすべての画像とビデオループに、動物の名前や番号、日付、測定値、適切な構造ラベルなど、必要な識別情報がすべて含まれているかどうかを確認します。
4. 手続き上の結論と回復
- 柔らかい布やペーパータオルを使用して、動物の腹部から残った超音波接触ゲルをすべて取り除きます。保管する前にトランスデューサからゲルを洗浄します。
- ステップ1.1に記載の鎮静プロトコルを使用する場合、メデトミジンの効果を逆転させるために0.25mg/kgの用量でアミフェゾールを皮下投与する。アンタゴニストが利用可能である別のセドレーションプロトコルを使用する場合、回復をスピードアップする手順の終了時に公開された用量に従って動物にこの薬剤を投与する。
- 胸部の不順で柔らかい寝た表面にムンジャクを置き、頭をわずかに高くして、逆流のリスクとルーメナル内容物の吸引を減らす。完全に回復し、助けを借りずにエンクロージャの周りをアンバクするまで、動物を注意深く監視してください。
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Representative Results
ここで説明するプロトコルを使用して、妊娠は低侵襲技術でリーブのムンジャク鹿で診断および監視することができる。著者によって妊娠が検出される最も早い時点は、観察された交配行動の約35日後であった。
妊娠初期には、妊娠は、尾大腹部の無響空間として同定された流体で満たされた子宮を視覚化することによって診断された。子宮内では、発達中の胚は、識別可能な特徴がほとんどない超響性のovoid構造として現れた(図1)。妊娠が進むにつれて、胎児の構造が明らかになり、骨格のミネラル化と胎児の心拍の観察に続いて決定的な診断が行われる(図2および3)。
胎児の測定は、正確な繁殖日が不明な場合に妊娠年齢を推定するための基準ガイドラインを確立するために得られ、使用することができますが、まだmuntjacでこのシステムを完全に開発していません。ストレートクラウンランプ長(SCRL)、HL、およびCDは、多くの種17で胎児年齢を推定するために一般的に使用される標準的な胎児測定であり、これらの測定値は、ここで説明するプロトコルを用いてムンジャク妊娠の超音波画像から得られた。これら3つの測定値はいずれも、同じ正しい位置の矢状画像(図2 および 3)から得ることができますが、胎児全体が単一の矢状のビューで捕捉できない場合は、別々の写真を使用することができます。将来的には、これらの技術は、異なる実験条件下で観察された成長と発達の変動を特定し、胎児の生存率を決定するためにも使用することができる。
図 1.リーブスのムンジャク鹿の妊娠初期を示す超音波画像。この研究のドエは46日間無傷の雄のムンジャクで収容されていたが、正確な繁殖日は知られていない。胎児の特徴は、妊娠のこの段階では区別できません。
図 2.図1に描かれた同じ妊娠の超音波画像は、バックにdoeの導入後91日。(CD - 胸深さ、HL - 頭の長さ、P - プラセントーム、SCRL - ストレートクラウンランプ長)。
図 3.胎児の測定を得るための適切な位置を示す第二の妊娠の超音波画像。バックにdoeの導入後91日を撮影した画像。(CD - 胸深さ、HL - 頭の長さ、P - プラセントーム、SCRL - ストレートクラウンランプ長)。
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Discussion
このプロトコルは、リーブスのムンジャク鹿における妊娠診断のための経腹的超音波超音波検査の適用について説明する。他の超音波研究と一致して、適切な機器と技術的な熟練度は、ムンジャクのドエの成功した生殖検査に不可欠です。基本的な哺乳類の解剖学、診断超音波の物理的原理、および腹部内臓の典型的な超超音波学的外観の慎重な検討は、誤った診断の減少に役立つ。さらに、適切なトランスデューサの選択と計測器とスキャナ制御の熟知度は、高品質の画像と正確な解釈を得るために重要です。
多くの経験の浅い超ソノグラファーにとって、イメージングアーティファクトは、画像解像度が悪く、構造の不正確な評価の一般的な原因です。皮膚トランスデューサ界面での残響は、獣医腹部超音波で最も頻繁に遭遇する人工物の1つであり、2つの表面間のガスの存在を排除することによって大幅に減少させることができる。十分な脱毛と皮膚への音響ゲルの寛大な適用は、このアーティファクトの影響を最小限に抑えるのに十分であるべきである。他のイメージングアーティファクトの議論は、人間と獣医の超音波検査の様々なテキストで見つけることができるので、ここでそれ以上の詳細については説明しません。しかし、これらの現象の一般的な知識は、超ソノグラファーがそれらをより効果的に制御することを可能にします24.
生殖検査を行う場合、子宮は正常な非妊娠動物で視覚化することが困難である可能性があることを理解すべきである。妊娠初期には、子宮の内腔は、妊娠嚢が形成されるにつれて、無響性空間に対する低響体として識別可能になる可能性がある。ムンジャクのこの段階では、子宮は通常、乳腺のレベル、またはわずかに尾行でスキャンすることによって見つけることができます。骨格のミネラル化や胎児の心拍の出現に先立ち、妊娠は、子宮内に蓄積する流体を引き起こす他の生殖条件の存在下で誤診され、ピョメトラ、ヒドロメトラ、またはムコメトラなどの病理が含まれる可能性があります。超音波診断は、処置のためのセデションの前に動物の完全な臨床評価と共に行われるべきである。妊娠初期には、概念は羊膜嚢内の球状から球体的、超響性構造として現れる。特定の発達時のポイントは、この種では十分に特徴付けられていない。しかし、骨格の鉱化と胎児の心臓運動は、交配後約8週間で一貫して検出可能であるように見える。
理想的な条件下では、腹腔内超音波は、リーブスのムンジャクを含む多くの種の生殖構造の評価のための非常に有用なツールであり得る。しかし、この技術の価値は、動物の住宅施設の特定の能力に大きく依存しています。妊娠検出のより受動的なメカニズムとは異なり、交配行動の視覚的観察およびその後の腹部の腹部の膨張など、超音波は5〜10分以上持続する期間の動物の物理的および/または化学的拘束を必要とする。多くの施設では、これは不可能または実用的であり、試験の必要性は、研究の具体的な目的に基づいて考慮されるべきである。さらに、特定の生理学的または病理学的状態は、捕捉および沈下に関連する苦痛の潜在的に有害な影響のために、特定の動物において超音波検査が禁忌であることを示唆するかもしれない。研究を実施する前に超音波検査のために各動物の適合性を評価することが重要であり、獣医師はこれらのプロジェクトの計画段階で相談する必要があります。
リーブスのムンジャクおよび他の野生生物種における妊娠検出のための現在の慣行は、典型的には本質的に受動的である(交配行動および腹部の膨張の観察はそうする)。血清プロゲステロンまたは妊娠関連糖タンパク質レベルを測定して診断を確認することができます 18,25しかし、これらのアッセイの結果は、妊娠または胎児の生存率の段階に関する情報を提供しません。超音波は、動物への最低侵襲性および苦痛を維持しながら、血清ホルモンアッセイ18と同様またはより大きい精度で生殖状態のリアルタイム評価を可能にする利点を提供する。繁殖日を決定することが困難または不可能である操作では、超音波は、公表された妊娠表がない場合でも、ホルモンアッセイよりも妊娠の段階を推定するより正確なメカニズムを提供することができる。さらに、超音波検査のための物理的および化学的拘束は、健康なムンジャクに最小限の苦痛を引き起こすように見え、徹底的な身体検査を行い、一般的な健康評価のための追加のサンプル(血液、尿 など)を収集する理想的な機会を提供する。
超ソノグラフィック測定による妊娠年齢推定は、牛1、羊2、3、ヤギ4、及び馬5を含む多くの種において確立されており、また、限られた数のcervid種にも8〜19に記載されている。正確な繁殖日または確立された妊娠表がない場合、リーブスのmuntjacの胎児年齢は、他の種のために概説された胎児の発達パラメータに基づいて概算されるだけです。ここで説明する作業の具体的な目標は、この種における胎児老化のためのより正式なガイドラインを確立することです。十分な規範データが整えば、このコロニーにおける超音波検査の将来の応用には、異なる実験変数の存在下で胎児の発達の異常を特定し、胎児の生存率を評価することを含む。さらに、腹腔内超音波の感度および特異性を決定し、cervid種の妊娠を検出するための他の一般的に採用されたメカニズムと比較することができる。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、このプロジェクトにシードムンジャクを提供してくれたムンジャクとCervid Solutions Inc.のクリーブ・テッドフォード氏に私たちを紹介してくれた、ムンジャクコロニーの管理に対するジャネット・ヘイズ=クラッグとケリー・アンダーソンに感謝したいと考えています。この作業は、NIH助成金R01AI093634によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butorphanol tartrate (Torbugesic) (0.45 mg/kg) | Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa | NADA 135-780 | |
| Azaperone tartrate (0.035 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Medetomidine HCl (0.04 mg/kg) | ZooPharm | ||
| Ultrasound contact gel | Medline, Mundelein, Illinois | MDS092005 | |
| Atipamezole hydrochloride (Antisedan) (0.25 mg/kg) | Orion Corporation, Espoo, Finland | NADA 141-033 | |
| V-trough (optional) | N/A | N/A | Animal may be supported in dorsal recumbency on a standard examination table or other surface without the use of a V-trough |
| Electrical clippers or razor blades for hair removal | Oster, McMinnville, Tennessee | 78005-140 | |
| Ultrasound system: Ibex Pro portable ultrasound | E.I. Medical Imaging, Loveland, CO | Ibex Pro | |
| 5-10 MHz transducer: CL3.8 5-2.5 MHz 60 mm curved linear array | E.I. Medical Imaging, Loveland, CO | 290420 | |
| 3 ml syringes | Covidien | 1.18E+09 | |
| 22 G needles | Covidien | 8.88E+09 |
References
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