Membranpotensialet Dye Imaging av ventromedial Hypothalamus nerveceller fra voksne mus for å studere Glukose Sensing
Summary
Aktiviteten av enkeltnerveceller fra voksen-alderen mus kan studeres ved dissociating nevroner fra bestemte områder av hjernen og bruker fluoriserende membranpotensialet fargestoff bildebehandling. Ved å teste reaksjoner på endringer i glukose, kan denne teknikken brukes til å studere glukose følsomheten av voksne ventromedial hypothalamus nevroner.
Abstract
Studier av neuronal aktivitet er ofte utført ved hjelp av nerveceller fra gnagere mindre enn 2 måneders alder på grunn av tekniske problemer forbundet med økende bindevev og redusert neuronal levedyktighet som oppstår med alderen. Her beskriver vi en metodikk for dissosiasjon av sunne hypothalamus nevroner fra voksen-alderen mus. Evnen til å studere neuroner fra voksne aldrende mus gjør det mulig å bruke sykdomsmodeller som manifesterer på et senere alder og kan være mer nøyaktige utviklingsmessig for visse studier. Fluorescens avbildning av dissosierte nevroner kan brukes til å studere aktiviteten av en populasjon av nerveceller, i motsetning til ved bruk av elektro å studere et enkelt neuron. Dette er spesielt nyttig når man studerer en heterogen neuronal populasjon hvor den ønskede neuronal type er sjelden så som for hypothalamus glukose avføling neuroner. Vi utnyttet membranpotensialet fargestoff avbildning av voksne ventromedial hypothalamus nevroner å studere sine svar til changes i ekstracellulære glukose. Glukose sensing nevroner antas å spille en rolle i sentral regulering av energibalansen. Evnen til å studere glukose avføling hos voksne gnagere er spesielt nyttig ettersom overvekt av sykdommer relatert til uhensiktsmessig energibalanse (fedme f.eks.) Øker med alderen.
Introduction
Hjernen regulerer energi homeostase gjennom nevroendokrine og det autonome nervesystem. Den ventromediale hypotalamus (VMH), som består av den ventromediale kjernen (VMN) og den bueformede kjerne (ARC), er viktig for den sentrale regulering av energihomeostase. Specialized glukose sensing nevroner, i VMH, link neuronal aktivitet og perifert glukose homeostase en. Det finnes to typer av glukose sensing nevroner, glukose opphisset (GE) nevroner øke, mens glukose hemmet (GI) nevroner redusere sin aktivitet som ekstracellulære glukose øker. VMH glukose sensing nevroner er generelt studert ved hjelp av elektrofysiologi eller kalsium / membranpotensialet sensitive fargestoff bildebehandling.
Den elektro patch clamp teknikk anses å være gullstandarden i studiet av ex vivo neuronal aktivitet. I denne teknikken blir et glass mikropipette elektrode koblet til cellemembranen via et høy motstand(GΩ) segl. Patch klemme elektroder tillate sanntidsopptak av aksjonspotensial frekvens (strømtang) eller ion konduktans (spenning klemme) endrer innenfor en enkelt nervecelle. Mens patch clamp teknikk gir detaljert informasjon vedrørende endringer i spesifikke ion kanals konduktans, er en stor ulempe at bare én nervecelle kan observeres på en gang. Det tar ca 30-45 min av opptak for å kontrollere at man tar opp fra en glukosesensor nevron før selv begynner en bestemt eksperimentell behandling. Dessuten, GI og GE neuroner utgjør <20% av den totale VMH neuronal populasjon. Compounding dette problemet er mangelen, i mange tilfeller av en identifisering cellular markør for disse nevronene. Således er det klart at til tross for å gi verdifull elektrisk informasjon som andre teknikker kan ikke, er arbeidskrevende patch clamp-analyse, tidkrevende og lavt utbytte.
Bruken av fluorescens avbildning av dissosierte VMH nevroner tillater studiet av hundreds av nevroner samtidig. Kalsium følsomme fargestoffer som kan brukes til å måle intracellulære kalsium endringer, som indirekte korrelere endringer i neuronal aktivitet. Membranpotensialet følsomme fargestoffer som brukes til å overvåke membran mulige endringer. Måling av cellemembranpotensialet er en mer direkte indeks av neuronal aktivitet sammenlignet med endringer i den intracellulære kalsiumnivåer. Videre membranpotensialet fargestoff (MPD) bildebehandling oppdager potensielt mindre endringer i membranpotensialet der aksjonspotensial avfyring ikke er endret og den intracellulære kalsiumnivåer kan ikke endres. Begge disse fluorescens imaging teknikker har blitt brukt til å studere VMH glukose sensing nevroner fra juvenile mus 2-7. Selv om resultatene er mindre detaljert enn de som oppnås med patch clamp elektrofysiologi, er styrken av bildebehandlings eksperimenter at de samtidig evaluere en stor populasjon av celler som uunngåelig inneholder et betydelig antall glukosefølenerveceller. MPD bildebehandling ier spesielt nyttig for å studere GI nevroner som er mer jevnt lokalisert i hele VMH, og dermed gi en tilstrekkelig befolkning for å studere i dissosiert VMH (~ 15% GI). I kontrast, mens GE neuroner er tett lokalisert til ventrolateral-VMN og celle dårlig området mellom ARC og VMN, har ikke gitt et betydelig antall neuroner innenfor VMH (<1% GE). Dessuten, ved å studere isolerte neuroner, er astrocytic og presynaptiske virkninger elimineres. Dette kan være en fordel i å studere første orden neuron effekter, så vel som en ulempe, siden fysiologiske forbindelser og prosesser går tapt.
En begrensende faktor i både patch clamp elektrofysiologi og MPD / kalsium fargestoff bildebehandling er behovet for å bruke yngre dyr (f.eks. Mus eller rotter <8 ukers alder). Dette er hovedsakelig på grunn av økt bindevev i kombinasjon med redusert neuronal levedyktighet som oppstår med tiden. I hjernen-slice elektrofysiologi studies, gir økt bindevev det mer vanskelig å visualisere de nervecellene. Økt bindevevet gjør det også vanskeligere å dissosiere et stort antall friske nerveceller for bildediagnostikk. Videre nerveceller fra yngre dyr overlever lenger under enten patch clamp opptak eller bildebehandling. Imidlertid kan bruk av unge mus være en vesentlig begrensning. Neuronal aktivitet og / eller svar på nevrotransmittere eller sirkulerende næringsstoffer endrer seg med alderen. For eksempel, siden energibalansen er nært knyttet til reproduktiv status, kan de hypothalamus nevroner som regulerer energibalansen reagerer forskjellig i pre-vs postpubescent dyr. I tillegg er mange sykdommer krever langvarig behandling eller ikke manifest til voksen alder. Prime eksempler på slike sykdommer er kosten fedme eller type 2 diabetes mellitus. Siden glukose sensing nevroner antas å spille en rolle i disse sykdommene vi utviklet en metode for å lykkes med dyrking av friske voksne VMH nevroner for bruk i MPD bildebehandling experiments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nøkkelen til å være i stand til å studere aktiviteten av neuroner fra voksne mus er evnen til å dissosiere friske nerveceller. Dissosiasjon av hypothalamus neuroner fra voksne mus er mer vanskelig i flere viktige trinnene i protokollen i forhold til nerveceller fra unge mus. Vi har overvunnet dette problem på en rekke måter. Making tykke 500 mikrometer hjernen skiver minimerer mekanisk skade på nervecellene i forhold til de vanlige 250-350 mikrometer skiver som brukes for hjernevev fra yngre mus. Men tykkere ski…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
References
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?. Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
- Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
- Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
- Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
- Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
- Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).
- Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
- Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).
